刺五加鲨烯合酶基因cDNA的克隆与序列分析

采用改良的异硫氰酸胍法提取刺五加总RNA,逆转录为cDNA,根据已报道的人参鲨烯合酶基因(squalene synthase gene,SS) cDNA序列设计引物,利用RT-PCR法克隆刺五加SS基因的cDNA序列.克隆得到长度为1258 bp的刺五加SS基因cDNA序列,开放阅读框全长1248 bp,编码415个氨基酸残基,GenBank登录号为HQ456918,与人参的SS1、SS2和SS3氨基酸序列一致性分别为91.73％、97.59％和96.63％.首次分离并报道了刺五加SS基因cDNA序列,为刺五加苷生物合成中关键酶的表达分析及调控机理研究提供参考.     

绞股蓝鲨烯环氧酶基因的克隆与序列分析

根据已报道植物鲨烯环氧酶(squalene epoxidase,SE)基因cDNA序列的保守区域设计引物,利用RT-PCR和RACE技术,对绞股蓝SE基因进行克隆及序列分析.结果表明,绞股蓝SE基因cDNA全长为1 818 bp,编码一个由525个氨基酸残基组成的多肽.绞股蓝SE基因编码的氨基酸序列中含有52.4%的非极性疏水性氨基酸,26.1%极性中性氨基酸,9.0%酸性氨基酸,12.6%碱性氨基酸.Blast结果显示,绞股蓝SE基因核苷酸序列与其他已报道的植物SE基因相似性为73%～82%,推导的氨基酸序列相似性为63.2%～79.4%.SE氨基酸序列进化分析发现,绞股蓝SE与绿珊瑚、拟南芥亲缘关系较近.     

甜瓜鲨烯合酶基因克隆及酶分子结构分析

葫芦素类是主要分布于葫芦科植物中具有多种医药活性的四环三萜类化合物,目前药用葫芦素原料主要从甜瓜蒂中提取。该研究从甜瓜中克隆葫芦素类合成关键酶——鲨烯合酶(SQS)的基因,并对其序列进行了生物信息学分析。结果表明:DNA测序和BLASTRefSeqGene分析表明,克隆的甜瓜SQS基因片段具有完整的该酶基因开放阅读框架(ORF)序列。ORF分析显示,甜瓜SQS由417氨基酸残基构成,等电点为7.56。对推衍的甜瓜SQS氨基酸序列分析结果提示,该酶二级结构以α螺旋为主。结构域预测结果表明,SQS属于异戊二烯合酶家族,具有法呢酰基二磷酸及镁离子的结合位点。三级结构预测提示,甜瓜SQS为单体酶,其活性中心主要由几个α螺旋围绕形成的穴状结构。磷酸化位点分析显示,S~(48)处于酶活性中心相关~(47)VSRSF~(52)的模体中,而S~(196)是正选择位点,提示这两处磷酸化位点可能是甜瓜SQS酶活性调节的关键部位。以甜瓜SQS基因ORF序列构建系统发生树的系统发生分类结果与形态学分类结果一致。该研究结果为葫芦素类的生物合成调控研究提供了新的线索和实验依据。     

黄独微型块茎鲨烯合酶的基因克隆与序列分析

通过黄独微型块茎转录组数据库筛选到SQS基因的核心片段,利用RT-PCR技术获得SQS基因保守片段,采用RACE技术获得SQS基因的3′及5′末端序列,并采用生物信息学方法进行序列分析。结果表明,黄独微型块茎SQS基因编码序列长1548 bp,编码415 bp的氨基酸序列,理论分子量为46786.38 D,等电点(pI)为5.97。SQS蛋白为疏水性蛋白,无信号肽,含有SQS所必需的功能结构域,属于Isoprenoid_Biosym_C1 superfami?ly。黄独SQS蛋白与其他植物的SQS蛋白同源性较高,其中与盾叶薯蓣的SQS蛋白氨基酸相似性为96.4%。本试验结果从黄独微型块茎中首次获得SQS基因cDNA全长序列,该基因具有SQS同源基因的典型特征,为进一步研究黄独微型块茎SQS基因结构、基因表达和基因突变提供了基础,并为薯蓣属植物三萜合成通路关键酶SQS的正选择位点与功能的关联性分析提供了数据支持。     

刺五加内生青霉鲨烯合酶基因的克隆与序列分析

【目的】克隆刺五加内生青霉Penicillium minioluteum P116-1a的鲨烯合酶(Squalene synthase,SS)基因。【方法】采用cDNA 5末端快速扩增(Rapid Amplification ofcDNA 5 Ends,5 RACE)技术扩增P.minioluteum P116-1a SS基因的全长cDNA序列和DNA序列;运用生物信息学方法对该基因进行分析,预测其编码蛋白的结构与功能;并通过RT-PCR法和SDS-PAGE法检测SS的表达情况。【结果】P.minioluteum P116-1a的SS基因含有4个外显子和3个内含子,开放阅读框长1 416 bp,编码471个氨基酸,预测蛋白含67.73%的α螺旋,5.31%的延伸链,2.97%的β折叠,23.99%的无规则卷曲,含有鲨烯合酶和八氢番茄红素合成酶的特异性识别区域,定位于内质网膜。与P.marneffei和Talaromyces stipitatus中SS蛋白的氨基酸同源性达90%以上。不同温度下SS的表达情况不同。【结论】首次在刺五加内生青霉P.minioluteum P116-1a中克隆到SS基因,为进一步研究P.minioluteum P116-1a提高刺五加皂苷含量的机制奠定基础。     

青蒿鲨烯合酶基因的克隆、结构分析与大肠杆菌表达

用RT-PCR方法从青蒿(Artemisia annua L.)中克隆了一个1539bp全长鲨烯合酶cDNA。青蒿鲨烯合酶氨基酸序列与拟南芥、烟草、人类、酵母鲨烯合酶的一致性分别为70％、77％、44％和39％。青蒿鲨烯合酶基因组DNA结构很复杂,包括14个外显子和13个内含子。全长的或C末端截短的鲨烯合酶cDNA被克隆进原核表达载体pET30a并在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中诱导表达。但在含有全长的鲨烯合酶cDNA的大肠杆菌中并没有观察到预期大小的鲨烯合酶表达,而C末端截短疏水区30个氨基酸的鲨烯合酶可在大肠杆菌中过量表达。     

油茶种仁鲨烯合酶基因的分子特性与表达分析

角鲨烯含量是高品质植物食用油评判标准的重要指标之一。鲨烯合酶是角鲨烯合成直接相关的上游调控关键酶。本研究在已构建的油茶种仁转录组数据库基础上,设计特异引物,采用RACE技术获得油茶鲨烯合酶基因的全长cDNA序列,命名为CoSQS(Gen Bank登录号为JX914592)。生物信息学分析结果表明:该序列全长1554 bp,其中含全长的开放阅读框为1245 bp,编码415个氨基酸残基,CoSQS蛋白为弱碱性非分泌型蛋白,具有2个明显的跨膜区和2个角鲨烯和番茄红素合成酶的特异信号区。与柿Dk SQS同源蛋白亲缘关系最近,属于疏水性蛋白。亚细胞定位试验结果显示该基因定位于叶绿体。实时荧光定量PCR分析表明,5-10月间,油茶种仁中CoSQS基因表达量呈现先上升后下降的趋势,转录最高峰在9月下旬。通过关联分析表明CoSQS基因表达量与角鲨烯含量密切相关。     

青蒿鲨烯合酶基因的克隆、结构分析与大肠杆菌表达

用RT-PCR方法从青蒿(Artemisia annua L.)中克隆了一个1 539 bp全长鲨烯合酶cDNA.青蒿鲨烯合酶氨基酸序列与拟南芥、烟草、人类、酵母鲨烯合酶的一致性分别为70%、77%、44%和39%.青蒿鲨烯合酶基因组DNA结构很复杂,包括14个外显子和13个内含子.全长的或C末端截短的鲨烯合酶cDNA被克隆进原核表达载体pET30a并在大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3)中诱导表达.但在含有全长的鲨烯合酶cDNA的大肠杆菌中并没有观察到预期大小的鲨烯合酶表达,而C末端截短疏水区30个氨基酸的鲨烯合酶可在大肠杆菌中过量表达.     

鲨烯合酶基因的密码子偏性分析

为了分析鲨烯合酶(squalene synthase, SS)基因密码子的使用方式及其影响因素,利用codon W和SPSS 16.0软件对47条来自不同物种的SS基因进行多元统计分析、对应性分析.SS基因密码子1~3位碱基的GC含量(GC1, GC2和GC3)依次为51.33%、34.65%和54.37%,3个位点的GC含量均呈极显著相关关系(p<0.01),对应性分析的结果表明,第1轴显示30.71%的差异,有效密码子数和GC3、GC1和GC2的均值与GC3之间的相关性均达极显著水平(p<0.01).筛选出的26个最优密码子的第3位碱基均为G或C.以MEGA 5.0构建的基于SS蛋白质序列的进化树比基于RSCU的聚类更符合传统的系统发育观点.SS基因密码子偏好以G/C结尾,使用模式受选择和突变影响,突变对密码子偏好影响较大.     

鲨烯合酶的研究进展

鲨烯合酶 (SqualeneSynthase,EC 2 5 1 2 1 ,简称SQS)是催化两分子的法呢酯焦磷酸 (Farnesyldiphos phate,简称FPP)缩合产生鲨烯 (SQ)的关键酶 ,而鲨烯是生物合成三萜、甾醇、胆固醇等萜烯类重要物质的共同前体[1 ,2 ] 。因此 ,对鲨烯合酶的研究倍受重视 ,迄今人们已对 1 4个不同物种中的鲨烯合酶进行了研究。本文简要综述国内外关于鲨烯合酶研究的进展。1　SQS在萜烯类化合物生物合成中的作用萜烯类化合物生物合成的途径见图 1 [1 ] ,SQS处于代谢途径中FPP到其它产物的分支点上 ,FPP除可以被鲨烯合酶催化产生鲨烯 (SQ)外 ,还…     

巴西橡胶树胶乳磷脂酶A2的分离纯化及部分酶学性质鉴定

通过丙酮沉淀、DEAE-纤维素离子交换柱层析和Sephadex G-100凝胶过滤柱层析等分离纯化技术,对巴西橡胶树胶乳C-乳清磷脂酶A2进行分离纯化。用SDS-PAGE测定其亚基的相对分子量。测定该酶最适温度和pH,动力学常数Km和Vmax。并测定Ca2+和La3+对酶活性的影响。结果显示:该酶被纯化了49.47倍,产率为5.12%。SDS-PAGE检测为单一条带,其亚基相对分子量约43kDa。最适反应温度为37℃,最适反应pH为8.0,Km为0.44mmol·L-1,Vmax为7.22μmol.(mL.min)-1。最适Ca2+浓度为50μmol·L-1,稀土元素La3+离子对磷脂酶A2活性有抑制作用,但加入Ca2+后可缓解La3+对磷脂酶A2活性的抑制作用。胶乳C-乳清磷脂酶A2与其他植物磷脂酶A2在Ca2+的依赖性上存在差异。研究结果为今后探索橡胶树胶乳磷脂酶A2的催化机理、调节机理及生理功能等奠定了基础。     

甜荞查尔酮合酶基因Chs的克隆及序列分析

利用RT-PCR技术从甜荞中克隆得到查耳酮合酶(CHS)的cDNA开放阅读框(ORF)序列,命名为FeChs,NCBI登录号为GU172166.1.该序列长1 179 bp,编码392个氨基酸,与其它植物CHS基因的同源性为78%～92%,其推导的氨基酸序列含有CHS高度保守的活性位点及CHS的标签序列GFGPG.     

橡胶树DELLA蛋白编码基因HbGAI的克隆与表达分析

该研究采用RT-PCR与RACE技术,从橡胶树‘热研7-33-97’胶乳中克隆了1个DELLA蛋白编码基因HbGAI(GenBank登录号为KT696439)。HbGAI全长cDNA序列2 050bp,包含1个长1 842bp的完整开放阅读框。序列分析显示,HbGAI基因编码613个氨基酸,其推导的蛋白含有DELLA和GRAS结构域,分子量为66.476kD,理论等电点为5.19,无跨膜结构域,属于亲水性蛋白。进化树分析表明,HbGAI蛋白与其他植物中DELLA蛋白具有较高的相似性,与麻疯树JcGAI和蓖麻RcGAI亲缘关系较近。荧光定量PCR结果显示,割胶和茉莉酸甲酯处理下调胶乳中HbGAI基因的表达,乙烯利处理4h内显著上调胶乳中HbGAI基因的表达,表明HbGAI基因可能在橡胶树割胶、茉莉酸、乙烯响应中发挥作用。     

Isolation and characterization of squalene synthase cDNA fromcentella asiatica (L) urban

We have cloned and characterized a gene for squalene synthase (SQS) fromCentella asiatica (L) Urban, a species that produces a large quantity of triterpene saponins such as asiaticoside and madecassoside. Its full-length cDNA clone was isolated by RACE PCR. The sequence ofpSQS contains an open reading frame of 1248 nucleotides, which code for 416 amino acids with a molecular mass of 47.3 kDa. Southern analysis revealed that one copy might exist in the C.asiatica genome. We also determined that 0.1 mM methyl jasmonate was sufficient to up-regulate those levels ofCaSQS mRNA.     

大花杓兰亲环素基因(CmCyP)的克隆及生物信息学分析

亲环素是一个多基因家族,在植物生命活动中发挥着重要的作用。该研究以大花杓兰(Cypripedium macranthum)为材料,采用RT-PCR技术克隆到1个亲环素基因(CyP),并对其进行生物信息学分析。结果表明:大花杓兰CyP基因的开放阅读框序列为525 bp,命名为CmCyP(GenBank登录号为MH411125),编码174个氨基酸。预测CmCyP蛋白是一个位于细胞质、相对分子量约为18 kD、理论pI为8.73、无信号肽、跨膜结构域的亲水性蛋白质。磷酸化和糖基化位点预测分析发现,CmCyP蛋白存在18个潜在的磷酸化位点和2个潜在的糖基化位点。蛋白保守结构域预测分析发现,CmCyP蛋白包含一个高度保守的肽脯氨酰顺反异构酶结构域,属于单结构域亲环素。对二级结构进行预测分析发现,CmCyP蛋白中存在无规卷曲70个、延伸链56个、α-螺旋23个、β-折叠25个,这4种结构元件在三级结构中也有体现。系统进化树结果显示,大花杓兰CmCyP蛋白与铁皮石斛(Dendrobium catenatum)和万带兰(Vanda hybrid cultivar)的CyP蛋白的亲缘关系较近。该研究首次克隆了大花杓兰亲环素基因(CmCyP),为进一步探讨CmCyP基因的生物学功能奠定了基础。     

In silico analysis of squalene synthase in Fabaceae family using bioinformatics tools

Triterpenoid saponins are a diverse group of bioactive compounds, which are used for possessing of many biomedical and pharmaceutical products. Generally, squalene synthase (SQS) is defined as an emerging and essential branch point enzyme far from the major pathway of isoprenoids biosynthetic and a latent adjusting point, which manages carbon flux into triterpenes biosynthesis and sterols. The present study deals with the detailed characterization of SQS by bioinformatics approaches to evaluate physicochemical properties, structural characteristics including secondary and 3D structure prediction and functional analysis from eight plants related to Fabaceae family and Arabidopsis thaliana. Bioinformatics analysis revealed that SQS proteins have two transmembrane regions in the C-terminal. The predicted motifs were used to design universal degenerate primers for PCR analysis and other molecular applications. Phylogenetic analysis showed conserved regions at different stretches with maximum homology in amino acid residues within all SQSs. The secondary structure prediction results showed that the amino acid sequence of all squalene synthases had α helix and random coil as the main components. The reliability of the received model was confirmed using the ProSA and RAMPAGE programs. Determining of active site by CASTp proposes the possibility of using this protein as probable medication target. The findings of the present study may be useful for further assessments on characterization and cloning of squalene synthase.     

广藿香八氢番茄红素合成酶PcPSY1基因克隆和序列分析

根据已获得的广藿香转录组数据中的PSY转录本序列,利用Primer 3在线设计基因全长扩增引物,采用RT-PCR方法获得广藿香的八氢番茄红素合成酶(phytoene synthase,PSY)基因。并利用在线分析平台和生物软件对该其因进行生物信息学分析。获得的广藿香PSY1基因长1 550 bp,编码439个氨基酸,命名为PcPSY1,GenBank登录号为KC862310; 预测了PcPSY1 编码蛋白的结构与功能,且基于PSY基因利用NJ法构建了与21个不同物种间的进化树,进化树表明广藿香PcPSY1基因与桂花的PSY序列亲缘关系最近。成功克隆并分析广藿香PcPSY1基因的全长序列,为进一步阐明广藿香萜类代谢途径奠定基础。     

Biosynthesis of scopoletin in Hevea brasiliensis leaves inoculated with Phytophthora palmivora

Inoculation of resistant (R) and susceptible (S) Hevea brasiliensisleaves with Phytophthora palmivorainduced foliar necrosis and biosynthesis of scopoletin (Scp), considered as a Heveaphytoalexin. The degree of resistance of four clones, as classified by the necrotic lesions, was related to the rapidity and intensity of Scp production. The resistant BPM-24, and marked partially resistant clone PB-235, displayed an early secretion of scopoletin that intensified and lasted longer than the weak partially resistant RRIT251, and susceptible clone RRIM600. The lesion size and amount of Scp after infection were positively correlated to the concentration of spores applied to Hevealeaves. In addition, in leaflets inoculated with high spore concentration, Scp reached the highest level earlier than those with low spore concentration. A fungitoxic effect of Scp on mycelium growth was shown in bioassays; the I₅₀ value tested on Phytophthora palmivora was relatively the same as on Phytophthora botryosa, but much lower than those found on other leaf pathogens of rubber tree, Corynespora cassiicolaand Colletotrichum gloeosporioides. The lesion size and level of Scp upon spore inoculation may be appropriate for classifying Heveaclones according to their R/S with respect to P. palmivora     

番杏Actin基因片段的克隆及生物信息学分析

本实验为研究番杏(Tetragonia tetragonioides)功能基因表达模式提供内参基因,根据登录在NCBI上植物的Actin基因的保守区域设计简并性引物,通过RT-PCR克隆获得番杏的Actin基因片段,将该片段连接于载体pGEM-T后进行测序,并将该基因序列通过生物信息学软件进行分析。结果显示,克隆所得基因片段大小为598 bp,编码198个氨基酸;该序列与登录在NCBI上的其他植物的Actin基因的核苷酸序列的同源性最大可达86%以上,编码蛋白的氨基酸序列同源性在88%以上。结果表明,本研究克隆所得的基因序列为番杏Actin基因片段。该基因命名为TtActin1,在Gen Bank的登录号为MH33308。     

不同橡胶品种幼苗对遮荫的生理响应及耐荫能力评价

以不同遮荫条件(100%、50%、25%和5%自然光)下适应生长1年后的6个橡胶品种幼苗为研究对象,测定分析了干季和雨季时幼苗叶片多项生理生化指标的变化特征,并对幼苗的耐荫性进行综合评价。结果表明:(1)不同光处理对所有6个橡胶品种幼苗叶片的超氧化物歧化酶(SOD)活性、可溶性蛋白质(SP)含量、可溶性糖(SS)含量、蔗糖(Suc)含量、叶绿素(Chl)含量、叶绿素a/b(Chl a/b)、脯氨酸(Pro)含量、丙二醛(MDA)含量和质膜相对透性(RMP)都有显著影响,且幼苗叶片的SOD、SP、SS、Suc、Chl、Chla/b和RMP在6个品种之间也有显著差异。(2)与雨季相比,干季时各品种的SS和Chl显著下降,而SOD、SP、Suc、Pro、Chla/b、MDA和RMP显著升高。(3)各品种的SP、SS、Suc、SOD和MDA均随着光强的减弱而下降。(4)主成分分析法筛选结果显示,与橡胶幼苗对光强反应密切相关7个生理生化指标是SP、SS、Suc、SOD、Pro、Chl a/b和MDA;9个生理生化指标的平均隶属度比较发现,干季和雨季对光强变化适应能力较强的3个品种是‘RRIM600’、‘云研77-4’和‘云研77-2’,‘GT1’和‘PR107’品种次之,‘热研523’品种最弱。