低温胁迫诱导肺形侧耳合成麦角甾醇的通路分析

本文以肺形侧耳栽培菌株X57为研究对象,对其低温胁迫时期进行转录组分析,发现差异基因显著地富集到麦角甾醇合成通路。根据麦角甾醇合成通路的相关信息,在肺形侧耳中筛选出该通路的17个基因,并推测了肺形侧耳的麦角甾醇合成通路。利用荧光定量研究了X57栽培袋在低温处理下该通路上各个基因的表达,结果显示随着低温胁迫时间的增加,该通路上大部分基因的表达量持续上升,且差异显著。检测栽培袋中菌丝麦角甾醇含量发现,低温胁迫显著提高麦角甾醇的含量,与RNA‐Seq分析结果一致。此外,以无需打冷也能整齐出菇的野生菌株X1为对照,比较X57与X1的麦角甾醇基因对冷胁迫的响应情况,探究麦角甾醇合成通路是否在肺形侧耳低温诱导形成原基时期具有关键性作用。将X57与X1菌株置于PDA平板上培养并进行低温胁迫,利用荧光定量PCR对各个基因表达进行验证,结果显示两个菌株的麦角甾醇合成通路相关基因均对低温胁迫有响应,X57低温胁迫时通路中绝大多数基因的表达量上升,且大部分基因表达量提高2倍以上;X1菌株的通路中的表达量变化较小。由此推测麦角甾醇通路在肺形侧耳变温结实中低温刺激形成原基有一定作用,为深入研究肺形侧耳低温胁迫调控分子机理提供了重要的基础。     

准噶尔小胸鳖甲短时低温胁迫响应的转录组分析

【目的】拟步甲科昆虫小胸鳖甲Microdera punctipennis是分布于中国新疆古尔班通古特沙漠的特有物种,具有很强的耐寒性,但其低温响应的分子机制尚不明确。本研究旨在利用转录组测序技术丰富小胸鳖甲的已知基因信息,分析在短时低温胁迫下,上调表达基因的主要类群及参与的主要代谢通路。【方法】利用Trinity软件对分别在4℃低温和25℃(对照)下处理3 h的小胸鳖甲成虫RNA-Seq数据进行从头组装,利用Blast2go软件进行基因注释。通过DESeq和GFOLD软件分析差异表达基因,并对上调表达基因进行GO(Gene Ontology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)代谢途径富集分析。【结果】测序过滤后得到68 165 001个有效读序,51 712个平均长度为984 bp的非冗余基因,其中29 925个基因(约57.87%)有同源序列(E-value10-5),与拟步甲科的赤拟谷盗Tribolium castaneum相应基因相似性最高(核苷酸序列一致性为72.75%)。低温响应上调表达基因有514个,富集到35个GO类群,18个KEGG途径。其中胁迫响应类群、生物调节类群和免疫系统过程类群都占有重要比例,嘌呤代谢、硫胺素代谢、糖酵解/糖异生等代谢通路显著富集。在胁迫响应类群中,热激蛋白Hsp90基因、超氧化物歧化酶(SOD)基因和钙联接蛋白Calnexin基因等8个非生物胁迫相关基因显著上调表达。【结论】荒漠昆虫小胸鳖甲低温转录组揭示,在4℃冷驯化过程中,代谢过程、胁迫响应、生物调节和免疫系统等生物学过程相关基因表达显著上调,其中几个非生物胁迫响应基因提示小胸鳖甲可能从分子伴侣、细胞周期阻滞、线粒体稳定性、抗氧化胁迫等多方面应对低温胁迫。KEGG富集分析所揭示的小胸鳖甲在低温下的转录组代谢通路与其他物种有较大差异。研究结果为后续生物信息学分析及小胸鳖甲耐寒关键基因的发掘及耐寒机制的揭示提供了基础数据。     

肺形侧耳线粒体基因组多态性鉴定

线粒体是能量转化与ATP形成的重要场所,已有多种食用真菌的线粒体基因组被相继组装注释,但肺形侧耳的线粒体基因组鲜有报道。本研究对野生肺形侧耳X2菌株的线粒体基因组进行组装并注释,由野生菌株X2与主栽菌株JX线粒体大片段差异序列,构建分子标记来鉴别野生和主栽肺形侧耳菌株。结果显示X2的线粒体基因组为大小75 709bp的闭合环状结构,含有rRNA的大小亚基基因,25个负责携带氨基酸的tRNA基因以及14个常见蛋白编码基因,在cox1基因上含有9个内含子。内含子主要为IB型,包含LAGLIDADG_1 superfamily、GIY-YIG_Cterm superfamily保守结构域。位于菌株X2与JX内含子和基因间区上的大片段差异序列,是造成种内线粒体多态性的主要因素。根据两菌株的差异片段构建系统进化树的结果显示,内含子、rnl-trnX、trnD-atp6序列能够将两株野生菌株和其他主栽菌株区分开,可用于野生肺形侧耳种内鉴定,而且trnD-atp6效果最佳。     

肺形侧耳发酵培养基优化及多糖提取工艺

通过碳源、氮源单因素实验和正交实验,对野生肺形侧耳进行发酵培养基优化。选取浸提时间、浸提温度及液料比3个因素,以胞内粗多糖提取率为指标,采用正交实验设计确定菌丝体胞内多糖提取的最佳工艺。结果表明,适宜肺形侧耳深层发酵的培养基为蔗糖1.5%,麸皮5%,蛋白胨0.6%,KH₂PO₄ 0.15%,MgSO₄ 0.75%,VB₁ 0.01%。胞内多糖提取的最佳工艺为浸提时间2h,液料比50:1,浸提温度90℃,此条件下多糖提取率为34.35%。     

盐胁迫下两个甜瓜品种转录因子的转录组分析

利用新一代高通量测序手段——转录组测序（RNA-Seq）技术研究在300 mmol.L-1NaCl胁迫下两个甜瓜（Cucumis melo L.）品种‘玉露’和‘冰雪脆’的转录因子基因表达变化。这两个甜瓜品种在叶绿素荧光参数上的差异表明其在盐胁迫下有不同的生理反应。转录组测序结果表明,盐胁迫与对照相比,‘玉露’共有属于19个转录因子家族的56个转录因子基因表达发生变化（在转录水平,属于7个转录因子家族的22个转录因子上调表达,属于14个转录因子家族的34个转录因子下调表达）。‘冰雪脆’有属于20个转录因子家族的47个转录因子基因表达发生变化（在转录水平上,属于5个转录因子家族的17个转录因子上调表达,属于17个转录因子家族的30个转录因子下调表达）。盐胁迫下,两个甜瓜品种差异表达的转录因子既表现特异性,也存在部分重叠。‘玉露’有29个转录因子特异响应,‘冰雪脆’有20个特异响应。盐胁迫响应重叠的转录因子有27个,其中9个上调表达,18个下调表达。采用实时荧光定量PCR对几个转录因子进行了盐胁迫下的表达检测,其趋势与转录组分析结果基本一致。     

萱草叶片响应低温胁迫的转录组分析

低温胁迫是萱草（Hemerocallis fulva）生长过程中经常会遭遇的一种非生物胁迫。比较了萱草叶片在低温处理（10、5、0 ℃）下转录组与对照（15 ℃）数据的差异,共筛选出差异表达基因2 457个,其中上调基因1 253个,下调基因1 204个。差异表达基因主要富集在细胞过程、代谢过程和催化活性等49个GO过程,代谢途径、次生代谢产物的生物合成、植物激素信号转导等42条KEGG代谢途径中。其中参与植物激素信号转导通路的差异表达基因发生了不同程度的变化,GH3.10基因上调至对照组的13.624倍,IAA1基因下调0.120倍;参与可溶性糖合成通路的差异基因发生了0.076~28.114倍不同程度的变化。随后对3个低温处理组共有的29个差异表达基因进行热图和网络调控分析,基于基因在网络调控中的位置,对ABCF5、OFPs和SWEETs等基因在冷应答的作用进行了分析。本研究结果为进一步挖掘萱草低温响应的关键基因及耐寒萱草种质开发、分子育种提供了一定的理论支撑。     

一种快速辨别糙皮侧耳和肺形侧耳的方法

目的：建立一种快速、经济的方法辨别糙皮侧耳（P.ostreatus）和肺形侧耳（P.pulmonarius）。方法：在GenBank下载糙皮侧耳和肺形侧耳的ITS序列,经ClustalX序列比对,利用Primer 3设计特异引物组合1F（5′-GATAGATCTGTGAAGTCGTC-3′）、1R（5′-TCACAATTGGAAAGAAACC-3′）和2R（5′-TGCGTGCTATTGATGAGTGA-3′）,最后经PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测。结果：5个糙皮侧耳菌株均能得到2条带,分别为342bp和459bp。4个肺形侧耳菌株均能扩增到一条446bp的片段。结论：该组引物适合辨别糙皮侧耳和肺形侧耳。     

肺形侧耳‘杭秀2号’的选育

肺形侧耳‘杭秀2号’以‘台秀57’菌株为亲本采用多孢自交育种技术选育而成。该品种菌丝生长适温26-28℃,子实体生长发育适温22-28℃。菌盖扇形,深灰色,菌盖大小平均为4.38cm×3.65cm;菌柄圆柱形,白色,直径平均为1.06cm。鲜菇蛋白质含量2.94%,氨基酸总量2.54%。示范栽培表明,‘杭秀2号’平均生物学效率为71.2%。低温刺激后,经5-6d可完成一茬菇采收。该品种具有出菇整齐、商品性好等优良性状,适于设施栽培。     

肺形侧耳‘申秀1号’的选育报告

肺形侧耳Pleurotus pulmonarius‘申秀1号’品种以‘3108’菌株为亲本采用单孢自交育种技术选育,经ISSR鉴定表明与亲本相比具有自身特异性。经多年的示范栽培表明：‘申秀1号’具有产量高（505g/500g干料）、商品性好（一级商品菇比例90%以上）、栽培周期短（冷刺激后4-5d完成采收）、菌丝培养阶段不出菇、冷刺激后出芽整齐、抗逆性强等优良特性,能够满足肺形侧耳温控设施化栽培与常规栽培的高温反季节用种需求。     

东乡野生稻苗期响应低温胁迫的转录组分析

为了解东乡野生稻（Oryza rufipogon）对低温胁迫的响应机制,对苗期的RNA-seq转录表达谱进行了研究。结果表明,与对照相比,共检测到10 200个差异表达基因（DEGs）,其中5 201个上调表达,4 999个下调表达,其中有426个DEGs位于已报道的水稻耐冷QTL区间,且37个为耐冷调控相关的家族基因。GO功能分类和KEGG代谢路径分析表明,核酸结合转录因子活性、氨基酸生物合成以及光合作用代谢等均参与响应低温胁迫过程。实时荧光定量分析表明,ABA响应蛋白基因、MYB转录因子和40S核糖体蛋白SA基因等12个可能与低温胁迫响应相关的DEGs表达模式与RNA-seq的一致。可见,植物激素传导途径和转录因子相关调控基因在东乡野生稻苗期响应低温胁迫过程中起重要作用。     

刺芹侧耳不同发育时期的转录组差异分析

为了探讨刺芹侧耳子实体生长发育时期的基因表达变化,本文利用高通量测序技术对刺芹侧耳不同发育时期（菌丝期、原基期、子实体时期）进行RNA-Seq分析,在转录水平上解析差异表达基因在刺芹侧耳生长发育过程中的作用和功能。KEGG功能富集显示,菌丝期差异表达基因主要富集在碳代谢和氨基酸代谢中,其中三羧酸循环中编码柠檬酸合酶、乌头酸水合酶、异柠檬酸脱氢酶、琥珀酰辅酶A合成酶、琥珀酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶的基因表达量均上调,说明碳代谢和氨基酸代谢是菌丝时期的主要能量来源;原基期上调的差异表达基因主要富集在脂肪酸代谢,其中RT-PCR定量结果显示原基期编码脂肪酸合酶的基因和编码脂酰辅酶A合成酶的基因下调,编码超氧化物酶的基因和编码过氧化氢酶的基因上调,表明脂肪酸代谢和抗氧化酶对刺芹侧耳原基期维持机体的稳定和生物应激方面起着重要作用。子实体时期上调的差异表达基因主要富集在剪接体、类固醇的生物合成以及AMPK信号通路中,说明环境因子对子实体时期有一定的影响。     

核、质基因对肺形侧耳菌丝生长、营养成分及基因表达的影响

本研究通过杂交构建肺形侧耳同核异质菌株N1M1、N1M2和同质异核菌株N1M1、N2M1,比较菌丝形态与生长速度、营养成分以及常见的细胞核基因与线粒体基因的表达量,分析线粒体基因对肺形侧耳菌丝的影响,探讨线粒体基因与核基因的相互作用。由菌丝生长情况可知N1M1和N1M2菌丝形态相似,生长速度差异不显著,N1M1和N2M1菌丝形态差异大,生长速度差异极显著,在菌丝形态与生长速度上细胞核基因作用大于线粒体基因。进一步检测菌株中的主要营养成分发现必需氨基酸与总水解氨基酸含量差异显著,菌株N1M2蛋白含量显著高于N1M1,N1M1维生素C含量是N1M2的1.67倍,菌株N2M1多糖和蛋白含量显著高于N1M1,铁和维生素C含量显著低于N1M1。所以细胞核基因、线粒体基因都能影响肺形侧耳营养成分含量。检测同核异质菌株N1M1、N1M2的7个细胞核常见基因的表达情况发现,N1M2菌丝中6个细胞核基因的表达量都显著高于N1M1,这表明肺形侧耳线粒体基因的不同会影响核基因的表达;同质异核菌株N1M1、N2M1的14个线粒体普通编码蛋白基因表达差异显著,这说明线粒体基因的表达量会因核基因的不同有所差异。综上,肺形侧耳线粒体基因和细胞核基因能够相互影响,共同作用于生命活动。     

镉胁迫后旱柳转录组变化分析

随着重金属镉(Cd)应用范围的扩大,由此引发的土壤镉污染问题日益严重。以具有植物恢复潜力的旱柳Salix matsudana作为研究对象,探究不同浓度的Cd (2.5 mg/L, 50 mg/L)胁迫后旱柳无性系1 d、7 d和30 d后基因表达与代谢通路的变化。转录组测序结果表明:共获得102 595个非冗余基因(Unigenes),相同浓度不同时间的差异基因总数为26 623个和32 154个;相同时间不同浓度的差异基因总数为8 550个、3 444个和11 428个。从中筛选得到与Cd胁迫响应密切相关的基因25个,其中金属硫蛋白、ABC转运蛋白、锌和锰转运蛋白等基因的表达不仅会随着Cd胁迫浓度变化而且同时受到胁迫时间的改变而发生改变;油菜素内酯合成通路的ROT3和黄酮类化合物合成通路的FLS、F3H均明显上调。此外Cd胁迫引起旱柳在代谢过程、细胞过程、膜、细胞器、细胞、细胞部分、催化活化和结合蛋白这8个方面发生改变,参与这些GO条目的差异表达基因数随着Cd浓度和胁迫时间的增加而增加。并对转录组信息的可靠性用RT-PCR和酶活性生理实验数据进行了验证。文中通过转录组测序分析旱柳Cd胁迫后的响应机制,从而为旱柳修复土壤Cd污染提供理论指导。     

寒冷适应差异表达基因的研究

为寻找寒冷适应机体表达上调的相关基因,以Balb／C小鼠建立寒冷适应模型,分别提取肌肉和肝脏RNA,运用代表性差异分析(RDA)方法,寻找寒冷适应表达上调的相关基因片段,进行序列分析和同源性比较。结果显示,在肌肉和肝脏中有部分表达上调的基因片段,经狭线杂交验证,其中3条基因表达存在显著差异。这些新发现的机体寒冷适应相关基因为进一步理解寒冷适应的分子机制提供了帮助。