ABA诱导蚕豆气孔保卫细胞H2O2的产生

以蚕豆叶片下麦皮为材料,将荧光探针ＨＰＴＳ导入蚕豆忆保卫细胞内,利用荧光光谱和激光共聚焦显微技术,检测了ＡＢＡ诱导蚕豆气孔关闭过程中Ｈ２Ｏ２的产生。结果表明,ＡＢＡ和１００μｍｏｌ／Ｌ的Ｈ２Ｏ２可以迅速猝灭ＨＰＴＳ的荧光,ＣＡＴ几乎可完全阻止９μｌ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ的ＡＢＡ引起荧光猝灭。因此,ＡＢＡ可以诱导气孔保卫细胞产生Ｈ２Ｏ２,其产生的强度和速度与ＡＢＡ的浓度直接有关,并且推测：这种Ｈ２Ｏ２产     

NADPH氧化酶参与水杨酸诱导的蚕豆气孔关闭过程

水杨酸(SA)可以浓度依赖的方式诱导蚕豆叶片的气孔关闭,1～1000μmol·L~(-1)SA所诱导的气孔关闭可以再开放,而10~(-2)mol·L~(-1)的SA导致的气孔关闭则否。质膜NADPH氧化酶抑制剂二亚苯基碘(DPI)可削弱SA作用的45%～60%。表明SA诱导的气孔关闭可能与H_2O_2的产生有关。以H_2O_2荧光探针H_2DCFDA结合显微注射技术直接检测保卫细胞内产生H_2O_2的结果显示,100μmol·L~(-1)SA可引起保卫细胞内荧光素(DCF)荧光快速增强。在DPI存在的情况下,经SA处理的保卫细胞,仅在其叶绿体部位产生H_2O_2,而质膜附近的DCF荧光增强则受到抑制。表明叶绿体可能是保卫细胞内产生H_2O_2的主要部位,质膜NADPH氧化酶也可能参与SA诱导H_2O_2的产生。     

共聚焦显微技术研究ABA诱导蚕豆气孔保卫细胞H2O2的产生（简报）

The methods of confocal laser scanning microscopy (CLSM) and microinjection were used to study ABA-induced H2O2 in guard cells (Vicia faba), which were labeled with H2O2 specific probe-2, 7-dichlorofluorescin diacetate(H2DCFDA). The results indicated 100 U/mL catalase (CAT) could inhibit partly stomatal closure induced by ABA. 10(-3) mmol/L ABA could significantly induce H2O2 production in chloroplast in guard cells of Vicia faba following microinjection, and 100 U/mL CAT could partly abolish the effects following simultaneous microinjection of ABA and CAT. These suggest that H2O2 is possibly involved in ABA signaling leading to stomatal closure.     

ABA诱导蚕豆气孔保卫细胞H2O2的产生

以蚕豆叶片下表皮为材料,将荧光探针ＨＰＴＳ导入蚕豆气孔保卫细胞内,利用荧光光谱和激光共聚焦显微技术,检测了ＡＢＡ诱导蚕豆气孔关闭过程中Ｈ２Ｏ２的产生。结果表明,ＡＢＡ和１００μｍｏｌ／Ｌ的Ｈ２Ｏ２可以迅速猝灭ＨＰＴＳ的荧光,ＣＡＴ几乎可完全阻止９μｌ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ的ＡＢＡ引起荧光猝灭。因此,ＡＢＡ可以诱导气孔保卫细胞产生Ｈ２Ｏ２,其产生的强度和速度与ＡＢＡ的浓度直接有关,并且推测：这种Ｈ２Ｏ２产生可能是ＡＢＡ诱导气孔关闭过程中信号转导链的一个中间成分。     

砷诱导蚕豆气孔保卫细胞死亡的毒性效应

采用蚕豆(Vicia faba L.)叶面气孔保卫细胞,研究砷对细胞的毒性效应。结果表明,0.3—10 mg/L的NaAsO_2能降低保卫细胞活性,使部分细胞死亡,死亡率随砷浓度升高而增高。死细胞中呈现核固缩、核崩解等典型程序性死亡特征,且泛caspase抑制剂Z-Asp-CH_2-DCB能阻止NaAsO_2诱发的细胞死亡。过氧化氢清除剂过氧化氢酶与NaAsO_2共同作用时,细胞死亡率显著低于砷单独处理组,保卫细胞内Ca~(2+)水平降低,具程序性死亡特征的细胞数减少;Ca~(2+)特异性螯合剂EGTA亦能降低NaAsO_2诱发的细胞死亡。研究结果表明,NaAsO_2能诱发蚕豆保卫细胞程序性死亡,该过程由胁迫引发的ROS升高引起,ROS可能通过激活质膜Ca~(2+)通道,使胞外Ca~(2+)内流,造成胞内Ca~(2+)浓度升高,进而诱导细胞程序性死亡。     

蚕豆保卫细胞原生质体质膜ABA结合蛋白与气孔对ABA敏感性的关系

在测定蚕豆(Vicia faba L.)保卫细胞原生质体质膜ABA结合蛋白的解离常数(Kd)和最大结合容量的基础上,进一步研究了几种因子(pH、光)对Kd和最大结合容量的影响。结果显示:pH并不改变结合蛋白的Kd值,而仅影响每个原生质体结合的分子数;光、暗处理的结果表明,光可使结合蛋白的Kd值增大,每个原生质体结合的ABA分子数减少,而暗处理可使结合蛋白的Kd值减小及每个原生质体结合的分子数增多,说明黑暗可提高气孔保卫细胞对ABA的敏感性,而光可以降低气孔保卫细胞对ABA的敏感性。因此,光、暗可以通过调节ABA结合蛋白的Kd值来调节气孔对ABA的敏感性。     

ABA诱导蚕豆气孔保卫细胞H2O2的产生

以蚕豆叶片下表皮为材料,将荧光探针HPTS导入蚕豆气孔保卫细胞内,利用荧光光谱和激光共聚焦显微技术,检测了ABA诱导蚕豆气孔关闭过程中H     

拟南芥保卫细胞微丝骨架的解聚可能参与了细胞外钙调素诱导的气孔关闭

细胞外钙调素(CaM)在植物的许多生理活动中都执行着重要功能, 但它对气孔运动的作用及其调控机制, 人们了解的很少. 以模式植物拟南芥为材料, 研究了细胞外CaM在保卫细胞壁上的存在及其对气孔运动的调控机制. 结果表明, 拟南芥保卫细胞壁中存在有分子量为17 kD的CaM, 并应用W7-琼脂糖和CaM抗血清初步证明了保卫细胞壁中存在的CaM可能具有促进气孔关闭和抑制气孔开放的作用. 在应用外源CaM诱导气孔关闭的实验中, 保卫细胞微丝骨架由长而呈辐射状分布的聚合态逐步解聚, 气孔开度也随着降低. 药理学实验结果表明, 保卫细胞微丝骨架的解聚能明显地促进外源CaM诱导的气孔关闭, 而微丝骨架的聚合则抑制这一过程. 研究结果还表明, 外源CaM能诱导保卫细胞[Ca²⁺]_cyt升高; 当使用Ca²⁺螯合剂EGTA时, 外源CaM诱导的[Ca²⁺]_cyt升高和气孔关闭运动均受到抑制. 为此推测细胞外CaM可能是通过诱导保卫细胞[Ca²⁺]_cyt升高, 导致微丝骨架的解聚, 进而促进气孔的关闭运动.     

蚕豆保卫细胞原生质体质膜ABA结合蛋白的理化特性

以蚕豆(Vicia faba L.)保卫细胞原生质体为材料,证明在其质膜外侧存在着对ABA高亲和力的结合蛋白。这种蛋白与ABA作用的最适pH为6.5;在25℃时.其特异结合比高于0℃时的特异结合比;在温育30min时即达到其最大结合。它与ABA作用的解离常数为2.0×10~(-8)mol/L,每个原生质体上大约有3.2×10~6个结合位点。该结合蛋白内部具有维持其功能所必须的二硫键,而且其功能的发挥要求介质中有一定浓度的Ca~(2 )的存在。     

Ca2+参与水杨酸诱导蚕豆气孔运动时的信号转导

在一定条件下,外源水杨酸(SA)可以诱导蚕豆(Vicia faba L.)气孔关闭,阻止气孔张开。以Fluo-3—AM作为Ca^2 的荧光探针,利用激光共聚焦扫描显微技术,对水杨酸调控气孔运动中保卫细胞胞质Ca^2 的变化趋势及Ca^2 的来源进行了研究。结果表明,水杨酸可引起胞质Ca^2 增加,这种变化发生在气孔开度改变之前。Ca^2 螯合剂BAPTA（1,2-bis(2-amino phenox-y)ethane-N,N,N′,N′-tetraacetic acid,1mmol/L)几乎可以完全抑制水杨酸诱导气孔开度减小的作用;胞外Ca^2 螯合剂EGTA(2mmol/L)、质膜Ca^2 通道抑制剂尼群地平(nifedipine,NIF,1μmol/L)和LaCl3(1mmol／L)可不同程度地减弱水杨酸诱导气孔关闭的效应。BAPTA(1mmol／L)预处理后,水杨酸不再引起胞质Ca^2 含量改变;尼群地平能够降低水杨酸引起的胞质Ca^2 增加的幅度。说明Ca^2 可能参与水杨酸诱导气孔运动的信号转导。水杨酸引起胞内升高的Ca^2 可能既来自胞外又来自胞内,胞内Ca^2 库可能是其主要来源。     

Extensive Distribution of Acetylcholinesterase in Guard Cells of Vicia faba

Acetylcholinesterase, an enzyme responsible for hydrolyzing of acetylcholine to choline and acetic acid residues, is detected in the guard cell protoplasts. Extensive acetylcholinesterase activity has been found in the guard cell protoplasts as compared with the mesophyll cell protoplasts. Moreover, light could stimulate the enzyme activity. Localization of acetylcholinesterase in the stomata of Vicia faba L. was undertaken using Karnovsky and Roots cytochemical method. It was found that in the stomata of this plant products of acetylcholinesterase enzymatic reaction mainly appeared in the outer side of the guard cell ventral wall and inner wall. When the staining time was prolonged, products of acetylcholinesterase enzymatic reaction could also be found in the ventral and inner wall of the guard cells. In addition, more extensive product of enzymatic reaction was observed in the opened stomata than in the closed stomata. It was assumed that acetylcholineaterase may participate in the regulation of stomatal movement by hydrolyzing acetylcholine around the stomata.     

星型孢菌素(STS)对蚕豆气孔运动的调控效应

用激光扫描共聚焦显微技术,初步研究广谱性蛋白激酶抑制剂星型孢菌素(STS)对蚕豆气孔运动的调控效应.结果表明:(1)光下STS对气孔开度无影响但暗中显著促进气孔开放,表明蛋白激酶参与光/暗对气孔运动的调控,光下蛋白激酶活性低而暗中高;(2)与H2O2清除剂抗坏血酸(ASA)和NO清除剂羧基-2-苯-4,4,5,5-四甲基咪唑-1-氧-3-氧化物(cPTIO)一样,STS既降低暗处理和光下外源H2O2、硝普钠(SNP)处理保卫细胞H2O2、NO水平,也促进气孔开放,表明暗中蛋白激酶通过抑制H2O2、NO清除机制提高保卫细胞内源H2O2、NO水平并促进气孔关闭.     

In Vitro and in Vivo Phosphorylation of Stomatal Phosphoenolpyruvate Carboxylase from Vicia faba L.

The in vitro and in vivo phosphorylation of stomatal phosphoenolpyruvate carboxylase [EC 4.1. 1.31] from Vicia faba L. was demonstrated by feeding the concentrated enzyme after 0–70% ammonium sulfate precipitation of guard cell protoplasts with ³²P and subsequent analysis of autoradiograms and Western immunoblots, after SDS-PAGE, of protein samples. The in vitro and in vivo results provide evidence for a radioactive labeling of the two stomatal PEPCase bands (112 and 110 kDa).     

蚕豆保卫细胞质膜水通道蛋白的鉴定及其在气孔运动中的作用

水通道或水通道蛋白是水分运动的主要通道。以RD2 8cDNA和RD2 8抗体为探针证明了蚕豆 (ViciafabaL .)保卫细胞中存在水通道蛋白 ,并以气孔运动为指标 ,结合抗体和抑制剂处理证明水通道蛋白是水分运动的主要通道。研究表明编码质膜水通道蛋白的RD2 8转录体在叶片保卫细胞、叶肉细胞和维管束中高表达 ,尤以保卫细胞中最多 ;荧光免疫染色和Confocal显微镜观察表明 ,RD2 8抗体反应主要位于保卫细胞质膜。进一步采用RD2 8抗体和水通道蛋白抑制剂———HgCl2 (2 5 μmol L) 处理可抑制壳梭孢素 (FC)、光照诱导的气孔开放和原生质体体积膨胀以及ABA诱导的气孔关闭 ,但这种抑制作用可以被水通道抑制剂的逆转剂 β_巯基乙醇 (ME)逆转。表明蚕豆保卫细胞中存在水通道蛋白并参与蚕豆保卫细胞的运动过程。     

过氧化氢对蚕豆气孔运动和质膜K+通道的影响

不同浓度H2 O2 可使蚕豆 (ViciafabaL .)叶片气孔关闭 ,抑制气孔张开 ,10mmol/L的H2 O2 最有效 ,10 μmol/L的H2 O2 仍明显使气孔关闭。且 10 μmol/L的H2 O2 抑制气孔张开作用能被EGTA所消除 ,表明Ca2 参与低浓度H2 O2 使气孔关闭的过程。 2mmol/L的H2 O2 可使质膜内向K 通道电流明显减小 ,而外向K 通道电流显著增加。因此 ,H2 O2 促进蚕豆气孔关闭主要是通过抑制K 通过保卫细胞质膜内向流入 ,或加强K 外向流出实现的     

乙酰胆碱与蚕豆气孔运动的关系

在蚕豆（ViciafabaL）幼苗中,很尖的切除可以引起植株蒸腾速率的逐渐下降;而在这一过程中植株地上部水势保持不变;外施乙酰胆碱可以使蒸腾速率基本恢复到断根前的水平。利用气质联动技术对乙酰胆碱的内源性进行了鉴定,结果表明蚕豆的类乙酰胆碱提取物具有与人工合成的乙酰胆碱和高等动物脑组织中类乙酰胆碱提取物相同的质谱谱线,说明乙酰胆碱是蚕豆中的一种内源物质。为了对乙酰胆碱进行快速而准确的测定,建立了测定乙酰胆碱的热裂解的气相色谱法。利用这种方法测定的结果表明,在从根的切除到不定根重新长成的整个过程中,叶片下表皮中乙酰胆碱的含量与叶片的蒸腾速率及根的存在和生长状态密切相关,表明内源的乙酰胆碱可能参与调控植物的气孔行为;这一推论又为乙酰胆碱对表皮条中气孔开度的刺激效应和乙酰胆碱酯酶抑制剂neostig－mine可以增加气孔对乙酰胆碱的敏感性的实验进一步证实。     

共聚焦显微技术研究SA对蚕豆气孔保卫细胞的影响

水杨酸(salicylic acid,SA)作为植物体内一种内源性的信号分子,具有多种生理功能.实验表明水杨酸以浓度依赖的方式诱导气孔关闭,抑制气孔张开.20U/mL的CAT与SA共同处理时可逆转SA诱导气孔关闭作用的83%~90%.以H2O2荧光探针H2DCFDA结合激光扫描共聚焦显微术直接检测到SA处理可引起保卫细胞内H2O2的产生;在保卫细胞内显微注射CAT可完全阻止SA导致的DCF荧光增强.表明SA诱导的气孔关闭可能与H2O2的产生有关.     

胞外H2O2及NADPH氧化酶参与了铜胁迫对植物细胞死亡的诱导

以烟草悬浮细胞BY-2(Nicotiana tabacum L.cv.Bright Yellow-2)为材料,探讨了在铜离子胁迫下植物细胞死亡发生过程中胞外H₂O₂及NADPH氧化酶所扮演的角色。实验结果表明,随着外源CuCl₂浓度的上升(从0~700 μmol·L^-1),细胞死亡水平不断上升,且胞外H₂O₂的水平也不断增加。在300 μmol·L^-1的CuCl₂诱导细胞死亡的过程中,加入H₂O₂清除剂N-N-二甲基硫脲(DMTU)降低了胞外CuCl₂胁迫下H₂O₂含量增加的同时也降低了细胞死亡水平的上升,这一观察表明了铜离子胁迫所导致的细胞死亡的发生和胞外H₂O₂的增加有关。进一步的研究表明,300 μmol·L^-1 CuCl₂的胁迫导致了NADPH氧化酶活性的显著性上升,而加入NADPH氧化酶的抑制剂（二亚苯基碘,DPI,)则降低了CuCl₂胁迫所导致的细胞死亡和胞外H₂O₂含量的上升。上述结果表明,胞外H₂O₂和NADPH氧化酶参与了CuCl₂对植物细胞死亡的诱导作用。