米曲霉异源表达天然产物研究进展

天然产物是创新药物和生物农药研发的重要源泉。阐明天然产物生物合成关键基因的功能、解析其生物合成通路和酶催化机制对于促进功能天然产物的应用和开发至关重要。异源表达是研究天然产物生物合成和合成生物学的重要手段之一。近年来,米曲霉异源宿主得到了广泛的应用。通过基因工程技术,将目的天然产物生物合成基因和基因簇在米曲霉中异源表达,不仅能够有效地激活沉默的生物合成基因和基因簇,挖掘全新活性天然产物,而且可以快速高效地鉴定天然产物生物合成基因功能,解析和重构其生物合成途径。米曲霉异源表达宿主已经成为天然产物合成生物学研究的强有力工具。本文对米曲霉遗传转化系统在天然产物研究中的应用进行了系统综述。首先,概述了异源表达的应用和意义,介绍了米曲霉遗传转化系统的发展过程、应用基础和优势以及遗传转化方法的实践和优化。其次,根据不同天然产物的结构类型和与之相对应的合成酶特点,着重介绍了该体系表达各类天然产物的成功案例。最后,对米曲霉异源表达宿主在天然产物化学领域的研究和应用前景进行了总结和展望。随着基因编辑、定向进化、合成生物学、生物信息学技术以及人工智能技术的发展和应用,米曲霉异源表达宿主的发展和完善将会极大...     

天然产物类药物的合成生物学研究

结构复杂多样的天然产物是现代药物的重要组成部分和新药发现的重要源泉.建立在基因工程及代谢工程、合成化学、基因组学、系统生物学等学科基础上的合成生物学研究对于结构复杂的天然产物类药物研究有特殊的意义.核心是通过在发酵友好、高效的微生物中设计、构建目标化合物的生物合成途径,经系统地调控和优化由重组微生物发酵生产来源稀缺的天然产物类药物或前体.该方法是不远的将来解决来源、成本与环境、资源协调问题最好的途径之一,也是解决海洋天然产物或特殊生境微生物药物面临的如何持续供应化合物这一个瓶颈问题的最佳选择.该文将对天然产物类药物合成生物学研究涉及的主要策略和重要进展进行阐述.     

合成生物学与天然产物开发

天然产物依然是临床用药的重要来源.合成生物学的诞生为天然产物的开发提供了全新的机遇,传统的微生物药物、植物天然产物等研究领域都因合成生物学而获得新生.重点介绍了合成生物学在天然产物开发中的应用,包括新化合物及其生物合成元件的筛选,基于理性设计的天然产物异源生物合成,人工底盘细胞的系统优化等.     

微生物次级代谢产物生物合成基因簇的克隆与异源表达

微生物次级代谢产物结构、功能极为多样,具有抗感染、抗肿瘤、免疫调节等多种生物活性,是新药研发的重要来源.随着新一代DNA测序技术以及生物信息学工具的快速发展,微生物基因组中大量次级代谢产物的生物合成基因簇(biosynthetic gene clusters,BGCs)被发现,BGCs克隆与异源表达在研究次级代谢产物中...     

微生物次级代谢产物生物合成的研究进展

微生物能够产生多种具有生物活性的天然次级代谢产物,这些次级代谢产物在医疗、农业和食品领域有着广阔的应用前景。分子生物学、生物信息学和测序技术的发展为次级代谢产物的挖掘奠定了理论基础,并提供了作工具。近年来,对微生物次级代谢产物的研究越来越多。传统的方法已经难以得到令人满意的结果,对微生物进行分子水平的操作将会是新的方向,如对次级代谢产物生物合成基因簇的调控。综述了新发现的次级代谢产物、提高次级代谢产物产量的策略,通过运用次级代谢产物生物合成基因簇异源表达、核糖体工程、表观遗传调控、代谢调控以及调控转录翻译水平等方法,挖掘新的次级代谢产物、提高次级代谢产物产量,旨在为新药的挖掘提供了突破点。     

内生真菌天然活性产物的研究进展

药用植物内生真菌能够产生许多结构新颖的活性次级代谢产物,已成为发现新天然活性物质的重要源泉。结合作者的工作,文中通过对内生真菌天然产物的分类,对这一领域的研究进展进行综述。     

植物天然产物微生物重组合成研究进展

植物天然产物是小分子药物、营养品、化妆品、香精香料等的主要来源之一,在国民经济中发挥重要的作用。目前植物天然产物主要依赖于植物提取,这种生产方式占用耕地、生长周期长,而且植物活性成分往往含量低、生产成本高。通过解析植物天然产物生物合成途径,在微生物细胞中重构,创建细胞工厂,实现利用可再生原料发酵合成,为植物天然产物的供给提供了新的路线。本文重点介绍了中国科学院天津工业生物技术研究所在萜类、黄酮类、苯丙素类等重要类型植物天然产物微生物重组合成方面的研究进展,简要探讨了当前研究面临的挑战及未来前景。     

白僵菌天然产物及其药理活性和生物合成研究进展

白僵菌是重要的昆虫病原真菌,能产生多肽类、聚酮类、生物碱类、苯丙素类、萜类、核苷类等多种结构类型的天然产物,其中很多天然产物显示出优良的抗肿瘤、抗菌、抗病毒和杀虫等活性,具有极大的应用开发潜力。随着白僵菌基因组测序的完成,白僵菌素、白僵菌交酯、球孢交酯、卵孢素及纤细素等活性分子的生物合成基因簇及其生物合成机制已得到阐明,这些研究将大大促进白僵菌来源的新结构活性天然产物的基因组挖掘和发现以及已知重要活性分子的开发应用。本文对已知白僵菌产生的天然产物、药理活性及重要活性分子的生物合成途径进行了概括总结,为系统开发白僵菌天然产物资源提供参考。     

芳香类天然产物的合成生物学研究进展

植物芳香类天然产物具有重要的药用价值,可制成具有抗菌、抗炎、镇痛、抗氧化、杀虫驱虫、祛痰止咳、安神镇静和抗肿瘤等药效的医药保健用品.然而,由于植物中芳香类天然产物含量较低并且难以提取和纯化,严重限制了其工业化生产及应用.合成生物学和代谢工程技术的发展为天然产物的生产提供了新的思路,可以利用人工微生物细胞工厂来实现多种芳...     

酵母人工合成细胞生产植物源天然产物

植物源天然产物在医疗保健领域有着广泛的应用。目前,生产植物源天然产物的主要方式为从原植物直接提取,但此法面临诸多问题。基于合成生物学的理念,创建酵母人工细胞工厂发酵生产植物源天然产物是一种新的资源获取途径。本文将从植物源天然产物在药物和营养领域的应用前景,发酵法生产青蒿酸的研发历程,部分萜类、生物碱和长链多不饱和脂肪酸的研究进展,以及该领域相关技术前沿4个方面介绍酵母人工合成细胞生产植物源天然产物的近况。     

酿酒酵母基因组位置效应对外源基因表达的影响

外源基因元件和模块在底盘细胞中发挥特定功能是合成生物学研究的基本过程,而外源元件和模块在基因组中的位置对其功能的实现具有显著影响。为了系统、全面地表征酿酒酵母基因组位置效应对外源基因的表达影响,以绿色荧光蛋白为报告基因,通过双交换同源重组方法,对酿酒酵母单基因敲除库进行高通量转化,构建酿酒酵母基因组单位点荧光标记菌株库。结合流式细胞术和高通量测序技术对单位点荧光标记库菌株进行分析,构建高表达位点库和低表达位点库,共发现促进绿色荧光蛋白表达的位点428个,抑制绿色荧光蛋白表达的位点444个。通过分析高、低表达位点在酵母染色体上的分布,从全基因组尺度上对酿酒酵母基因组整合位置对基因表达的影响进行表征。本研究可为酿酒酵母基因组位置效应的分布规律和产生机理研究提供重要参考,对外源蛋白工业生产和合成生物学中的基因表达精细调控也具有重要的指导意义。     

从阿维菌素获得诺贝尔奖到中国创造

纵观世界历史,大国崛起无不伴随着科技的兴起和机制体制的突破。来自大自然的天然产物对于人类的健康起到非常重要的作用,从抗肿瘤明星分子紫杉醇到挽救了无数人生命的抗感染药物青霉素,从治疗代谢疾病到营养保健,都离不开天然产物。此外,还有大量天然产物资源没有被开发过。而随着阿维菌素的发现者Satoshiōmura教授和William C.Campbell博士,及青蒿素的发现者屠呦呦研究员因为这两种天然产物在治疗寄生虫感染病和疟疾上的应用而获得2015年诺贝尔生理与医学奖后,天然产物有望迎来其发展的第二个黄金时代。我国是世界工厂也是天然药物的资源大国,为了实现产业升级,弯道超车,实现大国崛起的中国梦,我国科学家在\"十二五\"期间围绕着天然产物的高产和创新两大主题开展了富有成效的合成生物学研究。阿维菌素是由阿维链霉菌产生的高效低毒生物杀虫剂,其原料产能占国际市场的100%。但我国原有生产菌株的单位发酵产量较低,高消耗、高污染、片面追求生产规模的粗放型发展模式已经成了阻碍低碳经济持续高速发展的瓶颈。如何从根本上解决问题,提高生产菌株的单位发酵产量和原料利用率,降低能耗和生产成本,减少环境污染,是促进我国从\"发酵大国\"向\"发酵强国\"转变的关键。本文以阿维菌素为例,综述其基础研究的技术发展,特别是中国科学院微生物研究所引入合成生物学技术,将阿维菌素的单位产量提高了1000倍,至9 g/L,在内蒙古新威远与阿维菌素产业联盟的公司应用,迫使默克公司全面退出阿维菌素历史舞台,从而引领产业迅速发展的过程,为我国其它天然产物生物制造品种的改良提供思路和方法。     

基因簇大片段克隆技术研究进展及挑战

天然产物结构复杂、活性多样,是新药开发的重要来源,对天然产物生物合成途径的研究,有利于探索酶催化的合成机制,促进复杂天然产物的应用。天然产物的生物合成由其对应的基因簇调控,其中大量天然产物生物合成基因簇(biosynthetic gene clusters,BGCs)在野生型菌株中无法表达或表达量低。对这些基因簇的研究,需要进行克隆表达,而如何克隆大片段基因簇并使其表达,从而发现新型天然产物是一个具有挑战性的问题。其中构建基因组文库、转化关联重组(transformation-associated recombination,TAR)、Red/ET重组等是克隆大片段基因簇的重要技术。本文从克隆技术的策略和应用两个方面,总结了这3种克隆技术目前的研究进展,讨论了目前大片段基因簇克隆技术面临的挑战,为研究大片段基因簇提供方法学借鉴。     

适用于链霉菌大片段基因组DNA 克隆和异源表达的细菌人工染色体(BAC)载体的构建及应用

【目的】很多链霉菌来源的天然产物的生物合成基因簇往往很大,用传统的cosmid载体很难完整的克隆和异源表达。本研究通过载体改造,成功构建出一个新的细菌人工染色体(BAC)载体,用于链霉菌来源的天然产物生物合成基因簇的克隆及异源表达实验。【方法】从复合型载体pCUGIBAC1出发,通过λRED介导的PCR-targeting方法,用链霉素抗性基因替换掉原有的氯霉素抗性基因标记,同时插入链霉菌中常用的安普拉霉素抗性标记、转移起始位点oriT、φC31整合酶基因int、整合位点attP等元件。【结果】成功构建出可装载链霉菌大片段DNA的BAC载体pMSBBACs。使用pMSBBACs构建出链霉菌U27的基因组BAC文库,平均插入片段大小为100 kb。选取其中一个大小为140 kb的BAC质粒进行功能验证,实验证明通过接合转移和原生质体转化的方法都能够将这个大型BAC质粒导入链霉菌模式菌株,并通过位点特异性重组整合到染色体中进行异源表达。【结论】BAC载体pMSBBACs可成功用于放线菌大片段基因组DNA的克隆和异源表达实验。     

人肿瘤坏死因子β(hTNFβ)在变铅青链霉菌中的表达研究

以变铅青链霉菌为宿主研究了人INFβ(hTNFβ)的异源表达。应用链霉菌S.VENEZUELAC cbs762.70分泌产生的枯草杆菌蛋白酶抑制剂vsi基因的启动子、表达调控序列和分泌信号肽序列,分别对hTNFβ进行了直接分泌表达、分泌融合表达和胞内表达。将hTNFβ的cDNA分别直接融合于vsi信号肽序列下游2个氨基酸处、vsi全长基因之后以及vsi起始密码子ATG的下游,获得的表达盒分别克隆至链霉菌高拷贝质粒pIJ486,转化Streptomyces lividans TK24,获得了重组菌株S.lividans(pIJ486-hTNFβ),s.LIVIDANS(PIJ486-vsi-hTNFβ)和S.lividans(pIVPA-hTNFβ)。分别对不同的重组菌株进行摇瓶培养,对其培养的上清液和细胞裂解液进行SDS—PAGE和Westen杂交,结果表明：hTNFβ在重组菌株中均获得了表达,且直接分泌产物和胞内表达产物均具有生物学活性。hTNFβ直接分泌表达产物的分子量约为16kDa,NB培养基中培养48h时表达水平约为0．7mg／L。胞内表达产物分子量与对照重组hTNFβ一致(18．7kDa),但随培养时间的延长远步降解为16kDa,NB培养基中培养48h时的表达水平(25．1mg／L)远高于其直接分泌表达水平。     

链霉菌底盘细胞的开发现状及其应用

天然产物及其衍生物在现代医疗中扮演着举足轻重的角色,其生物活性多样性以及化学结构的丰富性是新药研发的源泉和动力。利用纯化学方法合成天然产物在技术和成本上有很大的困难,加上许多天然产物的原始产生菌具有培养条件苛刻、产量低下等缺点,而且大量基因簇在原始菌株中是沉默的,这使得利用合成生物学思想来指导天然产物生物合成基因簇的异源表达具有重大意义。作为抗生素、抗肿瘤活性物质、免疫抑制剂等次级代谢产物主要来源的放线菌一直是研究者们关注的焦点,特别是随着基因测序技术的飞速发展,人们发现链霉菌基因组中包含着极为丰富的天然产物生物合成基因簇资源。这意味着开发链霉菌底盘细胞作为异源表达宿主有其得天独厚的优势。本综述从底盘细胞开发的意义入手,重点阐述链霉菌底盘细胞构建的策略及现状,随后通过实例阐述了各种底盘链霉菌的实际应用。