重叠PCR法构建副猪嗜血杆菌外源打靶基因

利用重叠PCR法构建了包含副猪嗜血杆菌血清5型hhdA基因上、下游同源臂(H-up、H-down)和卡那霉素抗性基因(Kan)的外源打靶基因Hup-kan-Hdown.通过对反应条件进行优化,发现退火温度为50.5℃,加入H-up、H-down和Kan各为5μL(450 ng)时得到Hup-kan-Hdown的量最多.将此外源打靶基因的两端引入Pst Ⅰ和SacⅠ酶切位点,克隆至具有迁移作用的自杀质粒pDS132,构建了可在大肠杆菌E.coli SM10-λpir中稳定遗传的打靶载体,为下一步建立副猪嗜血杆菌的高效基因打靶系统奠定基础.     

副猪嗜血杆菌检测技术研究进展

副猪嗜血杆菌是存在于健康猪上呼吸道的一种致病菌,也是格拉泽氏病的病原,近年来其发生与流行给养猪业造成巨大的经济损失,现已成为危害养猪业较严重的细菌性疾病之一.及时、准确地检测出该病以便采取相应的措施,是成功防制该病的关键.本文就从血清学、病原学、分子生物学等方面阐明了副猪嗜血杆菌的检测技术,从而为兽医临床诊断与治疗提供参考.     

副猪嗜血杆菌安徽株血清型、基因型及耐药性

【背景】副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis,HPS)是猪革拉瑟氏病(Gl?sser’sdisease)的病原体,由于长期使用抗生素产生的耐药性以及灭活疫苗缺乏交互免疫保护力,目前对该病无法形成有效防控。【目的】了解安徽地区副猪嗜血杆菌血清型、基因型及耐药性特征,为猪革拉瑟氏病的有效防控提供科学依据和技术支撑。【方法】针对2008–2017年安徽地区分离的44株HPS,利用PCR反应鉴定血清型,应用多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)进行基因分型,通过微量稀释法测定最小抑菌浓度(minimalinhibitoryconcentration,MIC)。【结果】44株HPS共检测出6种血清型(1、4、5、7、13、14),血清型4型和13型为优势血清型,各占40.91%;9种ST型(ST241、ST267、ST268、ST269、ST270、ST271、ST272、ST273和ST274)中ST267和ST268为优势基因型,各占40.91%;对庆大霉素、青霉素的敏感率分别为100%和93.2%,86.4%的分离株呈现多重耐药,耐药谱型有33种,其中以甲氧苄啶/磺胺甲噁唑-四环素构成比最大,为42.4%。【结论】安徽地区HPS流行血清型和基因型呈现多元化,具有较高的遗传异质性,多重耐药现象严重,血清型、ST型与耐药性之间无明显相关性。     

副猪嗜血杆菌蜂胶苗的制备及免疫效果试验

目的：以原场副猪嗜血杆菌为制苗菌株,制成自家细菌苗,预防本场猪格拉泽氏病。方法：用从河南济源一自繁自养大型养猪场发病猪分离到的副猪嗜血杆菌进行培养,经甲醛灭活,以蜂胶为佐剂,制成原场副猪嗜血杆菌灭活苗,含菌量为200亿/ml。母猪分别于产前30d和15d各注射4ml/头。仔猪出生后,分别在15、30日龄肌肉注射,1.5ml/头。结果：应用试验证明,该灭活苗保护率达98%。结论：该蜂胶苗安全、可靠,对猪格拉泽氏病有较好的预防作用。     

副鸡禽杆菌aroA基因克隆及序列分析

旨在建立一种方便、高效的同源保守基因克隆方法,并对副鸡禽杆菌aroA基因进行克隆和结构分析。本试验以副鸡禽杆菌国际标准株145(C-3)基因组DNA为模板,用CODEHOP软件设计针对aroA基因的兼并引物,并运用改进的染色体步移方法扩增aroA基因序列;对该核酸序列及其编码蛋白进行结构分析并与该菌其他血清型及相关细菌进行序列比对分析。结果显示,获得了完整的aroA基因,全长1 293 bp。该基因编码由430个氨基酸组成的多肽,具有2个功能位点和5个抗原表位位点。不同血清型间氨基酸序列同源性为88.1%-100%,与其他相关细菌核酸同源性为75%以上。首次将兼并PCR和改进的染色体步移技术结合起来对副鸡禽杆菌aroA基因全长进行扩增研究,得到了预期的结果。     

安徽PRSS发病猪副猪嗜血杆菌的分离鉴定及其耐药性分析

目的了解猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）发病猪继发感染副猪嗜血杆菌（HPS）的情况及分离菌株的药物感受性。方法应用细菌分离培养、形态学检查、生化试验和PCR技术,对2007年1月至2008年12月从安徽不同地区采集的146头份PRRS发病猪的病料进行HPS检测,并采用标准K-B纸片法对分离菌株进行14种抗菌药物敏感试验。结果分离鉴定出12株HPS,检出率为8.22%（12/146）;12株HPS对氯霉素100%敏感,环丙沙星为91.7%,阿莫西林和新霉素为83.3%,对罗红霉素100%耐药,阿米卡星为83.3%。结论安徽省不同地区PRRS感染猪群中均存在程度不同的HPS感染,各地区HPS分离株表现出形态上的变化特征和一致的生化特性,且有对临床常用抗菌药物耐药性增强的趋势。     

副猪嗜血杆菌毒力因子研究进展

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)是猪上呼吸道的一种常在菌,但却因其被证明是以多发性浆膜炎、关节炎、呼吸困难、高热及高死亡率为特征的Glasser病的病原体而广受关注。介绍了巴氏杆菌科一些常见的毒力相关蛋白、神经氨酸酶、血清型以及毒力相关的三聚自身转运载体与HPS毒力之间的关系,另外就近年来对HPS毒力因子方面的一些研究报道和成果作一综述。     

多杀性巴氏杆菌aroA基因缺失突变株的构建及鉴定

【目的】构建多杀性巴氏杆菌aroA基因缺失突变株,并验证其致病性。【方法】采用正向筛选同源重组技术构建多杀性巴氏杆菌aroA基因缺失突变株,利用PCR对突变株进行鉴定,分析其遗传稳定性、生长特性和致病性。【结果】成功构建多杀性巴氏杆菌aroA基因缺失突变株,连续传代20代,遗传稳定;突变株体外生长曲线表明,在前6h生长速度稍慢于亲本菌,随后两者生长速度一致。对小鼠的致病性试验表明:经腹腔注射aroA基因缺失突变株在1.0×106 CFU对小鼠无致死性,而亲本菌株在1.0×102 CFU对小鼠是致死性的。【结论】本研究获得多杀性巴氏杆菌aroA基因缺失突变株,对小鼠的致病性是减弱的。多杀性巴氏杆菌突变株的构建有助于研究其致病机理。     

猪CAST基因的遗传多态性及遗传效应分析

采用PCR—SSCP方法对猪cAST基因遗传多态性进行分析。并研究基因型与肉质性状和背膘厚的相关性。根据猪CAST基因的cDNA序列（M20160）设计7对引物。结果在F1／R1。F6／R6引物对扩增的片段上发现了多态性。并对纯合子进行测序。发现317位A—G突变。2042位G—C突变。基因型在不同猪种分布的多重比较结果表明。长白猪、大白猪和杜洛克猪与沂蒙黑猪和莱芜猪比较差异极显著（P〈0．01）。固定效应模型分析结果表明,嫩度及背膘厚基因型间差异显著（P〈0．05）,而pH值、温度及滴水损失基因型间差异不显著（P〉0．05）。最小二乘分析结果表明,不同猪种比较,屠宰12h和24h后肌肉温度、30min和1h后pH值及滴水损失差异显著（P〈0．05）;BBCC和BBDD单元型个体与其他单元型个体比较肌肉嫩度的差异显著（P〈0．01）。AACC和AADD单元型个体与其他单元型个体比较背膘厚的差异显著（P〈0．01）。因此,推测CAST基因对猪肉品质及背膘厚存在一定的影响。将CAST基因应用于猪育种过程中的标记辅助选择将可以改善猪肉品质。加快猪的育种进程。     

副猪嗜血杆菌血清4、13和14型TbpA对豚鼠的交互免疫保护性

【背景】副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis,HPS)是猪革拉瑟氏病(Gl?sser?sdisease)的病原体,目前在对该病的防控中,由于长期使用抗生素产生的耐药性以及灭活疫苗缺乏交互免疫保护力,亟待寻求新的方法来解决这一问题。【目的】探究不同血清型HPS转铁结合蛋白A (TbpA)对豚鼠的交互免疫保护性,为进一步用仔猪开展相关研究奠定基础。【方法】采用HPS血清型4、13和14型重组TbpA以0.1mg/只、经2次间隔期为20d的免疫后,检测豚鼠血清IgG抗体和细胞因子(IL-2、IL-5、IL-8、IFN-γ、MCP-1、TNF-α)水平;以HPS血清型4、13和14型菌株5 LD50剂量腹腔攻毒,检查病理组织学变化及其免疫保护率。【结果】HPS血清型4、13和14型重组TbpA均能诱导豚鼠产生较高水平的特异性抗体IgG,并使细胞因子显著升高。HPS血清型4、13和14型重组TbpA在免疫后均能对豚鼠产生交互免疫保护,其中HPS血清型13型TbpA免疫组的交互免疫保护率最高,对血清型4、14型HPS均为50.0%,对相同血清型HPS的免疫保护率也最高,达到83.3%,病理组织学检查显示与HPS血清型4、14型TbpA免疫组相比,13型TbpA免疫组的组织切片病理变化与攻毒对照组之间差异更明显。【结论】HPS血清型4、13和14型TbpA均能诱导豚鼠的体液免疫和相关细胞因子的分泌,产生交互免疫保护力,其中HPS血清型13型Tbp A的交互免疫保护力最强,可作为一种新的疫苗候选抗原。     

蝰科(Viperidae)蝮亚科(Crotalinae)线粒体12S rRBA基因序列分析及其系统发育

对蝮亚科（蛇岛蝮Ｇｌｏｙｄｉｕｓ ｓｈｅｄａｏｅｎｓｉｓ Ｚｈａｏ、黑眉蝮Ｇｌｏｙｄｉｕｓ ｓａｘａｔｉｌｉｓ Ｅｍｅｌｉａｎｏｖ、乌苏 里蝮Ｇｌｏｙｄｉｕｓ ｕｓｓｕｒｒｉｅｎｓｉｓ　 Ｅｍｅｌｉａｎｏｖ、　竹叶青Ｔｒｉｍｅｒｅｓｕｒｕｓ 　ｓｔｅｊｎｅｇｅｒｉ 　Ｓｃｈｍｉｄｔ和分别来自不 同地区的尖吻蝮Ｄｅｉｎａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ　ａｃｕｔｕｓ　Ｇｕｅｎｔｈｅｒ、短尾蝮Ｇｌｏｙｄｉｕｓ　ｂｒｅｖｉｃａｕｄｕｓ　Ｓｔｅｊｎｅｇｅｒ各 两条）６种蛇共８个个体测定、分析了约３７０ｂｐ线粒体１２Ｓ ｒＲＮＡ基因序列;以游蛇科链蛇属半 棱鳞链蛇Ｄｉｎｏｄｏｎ ｓｅｍｉｃａｒｉｎａｔｕｓ　序列为外群构建分子系统树。分子数据结果支持尖吻蝮形态 学的属级分类地位;提示蛇岛蝮位于黑眉蝮的蛇岛亚种分类地位,同时探讨了蛇岛蝮的起源 问题;并提示短尾蝮和乌苏里蝮同位于种级分类地位。     

大花杓兰亲环素基因(CmCyP)的克隆及生物信息学分析

亲环素是一个多基因家族,在植物生命活动中发挥着重要的作用。该研究以大花杓兰(Cypripedium macranthum)为材料,采用RT-PCR技术克隆到1个亲环素基因(CyP),并对其进行生物信息学分析。结果表明:大花杓兰CyP基因的开放阅读框序列为525 bp,命名为CmCyP(GenBank登录号为MH411125),编码174个氨基酸。预测CmCyP蛋白是一个位于细胞质、相对分子量约为18 kD、理论pI为8.73、无信号肽、跨膜结构域的亲水性蛋白质。磷酸化和糖基化位点预测分析发现,CmCyP蛋白存在18个潜在的磷酸化位点和2个潜在的糖基化位点。蛋白保守结构域预测分析发现,CmCyP蛋白包含一个高度保守的肽脯氨酰顺反异构酶结构域,属于单结构域亲环素。对二级结构进行预测分析发现,CmCyP蛋白中存在无规卷曲70个、延伸链56个、α-螺旋23个、β-折叠25个,这4种结构元件在三级结构中也有体现。系统进化树结果显示,大花杓兰CmCyP蛋白与铁皮石斛(Dendrobium catenatum)和万带兰(Vanda hybrid cultivar)的CyP蛋白的亲缘关系较近。该研究首次克隆了大花杓兰亲环素基因(CmCyP),为进一步探讨CmCyP基因的生物学功能奠定了基础。     

汉滩病毒M片段的核苷酸序列变异和系统发生树分析

The total RNA was extracted from two clinical blood samples of HFRS patients and the RNA was amplified by RT-PCRThe amplified DNA fragment of sample 613 involved nucleotides 1,471-1,873,and the sample 226 involved 540-1,244 nucleotides of M fragment of Hantaan virusThen the amplified PCR products were sequenced directlyThe sequencing results demonstrated that there was 84% identity between sample 613 and HV114 virus strain,but was 99% between sample 613 and HTN76-118 strainHowever,in sample 226,there was 95% sequence identity with HV114,82% with HTN76-118The results of phylogenetic tree analysis showed that HV613 was located in the same linage with HTN76-118,the HV226 was in the same linage with HV114 and A9 strains     

云南红豆杉紫杉烷2α-O-苯甲酰转运酶基因的克隆及定性

通过RACE技术,克隆了云南红豆杉紫杉烷2α-O-苯甲酰转运酶基因(TyTBT),该酶催化2-去苯甲酰-7,13-二乙酰巴卡亭Ⅲ生成7,13-二乙酰巴卡亭Ⅲ,是紫杉醇合成途径中的关键酶之一.TyTBT基因cDNA全长1481 bp,含有1 320 bp的开放读码框,编码440个氨基酸的多肽,分子量为50 050 Da,等电点为6.17.氨基酸序列比对表明TyTBT同植物酰化酶家族的其它成员有较高的相似性,超过67%,同东北红豆杉和曼地亚红豆杉的紫杉烷2α-O-苯甲酰转运酶氨基酸序列的一致性和相似性达到最高,分别为95%和96%.广泛地比对分析证明这种较高的相似性在红豆杉属的其它酶家族中具有普遍性,进化树分析表明同东北红豆杉和曼地亚红豆杉的紫杉烷2α-O-苯甲酰转运酶(TBT)的相似性高于紫杉醇合成途径中的其它酰化酶.     

中华鳖线粒体基因组序列分析

参照近源物种线粒体基因组序列,设计17对特异引物,采用PCR产物直接测序法测得中华鳖线粒体基因组全序列.初步分析其基因组特点和各基因的定位,用pDRAW32软件预测12种限制性酶对其的酶切图谱.结果表明,中华鳖线粒体基因组全长17364bp,核苷酸组成为35.23%A、27.26%T、25.73%C、11.78%G,包括13个蛋白质编码基因、2个rRNA基因、22个tRNA基因和1个非编码控制区.基于线粒体基因组编码的13个蛋白质的氨基酸序列,用NJ法和MP法构建系统进化树,分析6种龟鳖类动物之间的亲缘关系,与传统的系统分类基本一致,初步确定淡水龟科与海龟科的亲缘关系比与龟科的亲缘关系要近.     

中国几种剧毒鹅膏菌的ITS序列分析

测定了来自中国不同地区的9个剧毒鹅膏菌的核糖体内转录间隔区(ITS)核苷酸序列.以湖南鹅膏为外类群,用ITS序列构建了系统进化树.结果表明:两个不同产地的欧氏鹅膏存在一定的差异,但仍可聚为同一组;欧氏鹅膏与其它几种剧毒鹅膏的亲缘关系较远;两个根据形态特征鉴定为灰花纹鹅膏的标本可能是两个不同的种;欧氏鹅膏、致命鹅膏和黄盖鹅膏白色变种这3个产生白色子实体的种系统演化上不是同源的.     

棉铃虫核型多角体病毒几丁质酶基因及杆状病毒几丁质酶基因的分子进化

用PCR方法扩增了棉铃虫Helicoverpa armigera单粒包埋型核型多角体病毒（HaSNPV）几丁质酶基因,测定了基因编码区的核苷酸全序列。基因编码区全长1.713 bp,可编码570个氨基酸残基组成的多肽,预计分子量为63.6 kD。将所推导的HaSNPV几丁质酶氨基酸序列与其它已知杆状病毒几丁质酶氨基酸序列进行联配比较,结果表明HaSNPV 与谷实夜蛾H.zea单粒包埋型核型多角体病毒（HzSNPV）的氨基酸序列非常相似,同源性高达90.7%,与苜蓿丫纹夜蛾Autographa californica多粒包埋型核型多角体病毒（AcMNPV）、家蚕Bombyx mori核型多角体病毒（BmNPV）、美国白蛾Hyphantria cunea核型多角体病毒（HcNPV）、舞毒蛾Lymantria dispar多粒包埋型核型多角体病毒（LdMNPV）、黄杉毒蛾Orgyia pseudotsugata多粒包埋型核型多角体病毒（OpMNPV）和云杉卷叶蛾Choristoneura fumiferana核型多角体病毒（CfMNPV）氨基酸序列同源性分别为64.4%、64.9%、64.2%、62.9%、66.2%和61.5%。根据氨基酸序列用PC＼GENE程序绘制已知杆状病毒几丁质酶的分子系统树,并与杆状病毒中最为保守的多角体蛋白基因系统树作了比较,结果表明几丁质酶基因和多角体蛋白基因的进化速率是不尽相同的。     

黑蜂王台病毒中国BQCV-JL1株5'UTR的序列分析

蜜蜂黑蜂王台病毒(Black queen cell virus,BQCV)是引起蜜蜂蜜蜂黑蜂王台病的病原体,主要侵染蜜蜂蜂王幼虫。BQCV基因组为单正链RNA,包括5'端的ORF 1和3'端的ORF 2两个开放阅读框。分别编码非结构蛋白和结构蛋白。本实验室首次成功分离鉴定得到中国首株BQCV毒株,命名为中国BQCV-JL1株。该株全长为8 358 nt。【目的】本文主要研究该株核苷酸序列位置为1~1 124 nt的片段,该段序列的1~545 nt为该毒株的5'UTR区域。【方法】通过Blast及DNAStar等软件对核苷酸及氨基酸序列进行分析。【结果】5'UTR区域的同源性为94%~99%,为高度保守序列。【结论】经Mega5软件作多重序列对比分析得知,该中国BQCV-JL1株的5'UTR区域与其他毒株差异性很大,经分析推断原因为碱基的缺失与碱基置换。