草菇蛋白酶的分离、纯化及等电点的测定

草菇是我国食用菌主要栽培品种之一,属典型高温真菌。低温将诱导草菇细胞内的蛋白质降解,导致草菇菌丝自溶、死亡。蛋白酶在草菇低温自溶过程中起了重要作用。在分离、纯化草菇蛋白酶的基础上,采用等电点聚焦电泳测定了蛋白酶的等电点,为草菇低温自溶与蛋白酶之间的关系的研究奠定了基础。     

草菇蛋白酶的分离、纯化及等电点的测定

草菇是我国食用菌主要栽培品种之一,属典型高温真菌。低温将诱导草菇细胞内的蛋白质降解,导致草菇菌丝自溶、死亡。蛋白酶在草菇低温自溶过程中起了重要作用。在分离、纯化草菇蛋白酶的基础上,采用等电点聚焦电泳测定了蛋白酶的等电点,为草菇低温自溶与蛋白酶之间的关系的研究奠定了基础。     

泛素化结合酶E2抑制剂对草菇15 ℃保鲜的影响

为了改进草菇低温保鲜方法,在15 ℃贮藏条件下,采用泛素化结合酶E2 (UBEV2)抑制剂对草菇子实体进行处理,并开展相关生理指标和基因表达检测。结果表明,使用100 μmol/L的UBEV2抑制剂L345-0044维持了草菇较好的品质,提高了草菇可溶性糖的含量。低温明显提升抑制剂处理下的碱性蛋白酶和中性蛋白酶活力,并证实了低温胁迫显著提高了抑制剂处理下的一种类型蛋白酶肽基赖氨酸金属内肽酶的表达。本研究证实了草菇可溶性糖和高活性的冷诱导金属内肽酶对于延长草菇的低温保鲜时间是必须的。     

THP基因的重新克隆及草菇表达载体的构建

草菇 (Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａｖｏｌｖａｃｅａ)是一种高温型的食用菌 ,在 4℃低温条件下 ,其菌丝自溶死亡 ,子实体发软、液化直至腐烂[1～ 3 ] 。草菇的这一特性严重地限制了草菇的生产、新鲜草菇的流通、低温冷冻保鲜和出口创汇以及草菇菌种的低温冷冻储藏。草菇是同宗结合的真菌 ,生活史复杂[4 ] ,菌丝没有锁状联合 ,杂种选择缺乏标记 ,这给草菇的杂交育种带来极大的困难[5,6] 。基因工程的发展为解决草菇不耐低温冷藏这一难题提供了可能。ＴＨＰ(ＴｈｅｒｍａｌＨｙｓｔｅｒｅｓｉｓＰｒｏｔｅｉｎ)基因—热滞后蛋白基因 ,是加拿大科学…     

基于全基因组系统发生的草菇基因家族显著扩增

【目的】从基因组层次研究草菇低温自溶异常代谢的分子特征。【方法】对21个真菌物种进行全基因组系统发生分析,进而选取其中具有代表性的物种进行比较基因组学分析,系统研究草菇异常代谢分子特征。【结果】全基因组系统发生分析结果显示草菇位于草腐菌所形成簇的底端。基于全基因组系统发生树,由于担子菌和子囊菌属于完全不同的演化路径,所以选取担子菌中具有代表性的9个物种进行比较基因组学分析,结果显示相比于其它草腐菌,草菇基因家族具有一定的收缩趋势。进一步对不同范畴的基因家族数目进行比较,结果显示3个大于200的草菇基因家族(fam1、fam4和fam6)分别发生了显著扩增,且在总数上也显著高于其它物种,表明草菇的这一分子特征与其异常代谢相关。【结论】3个草菇基因家族(200)显著扩增提示其特定基因家族功能加强,很可能与草菇低温自溶密切相关。     

草菇低温诱导蛋白研究初探

对低温处理的草菇Volvariella volvacea菌丝体的可溶性蛋白进行分析,发现草菇菌丝在低温协迫中有新的可溶性蛋白产生,应用电泳技术分离纯化了草菇菌丝体中的一个低温诱导蛋白,经等电聚焦分析,该蛋白质的等电点6.79,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析该蛋白质是由分子最为70kD和48kD的两条多肽所组成。     

草菇低温诱导蛋白研究初探*

对低温处理的草菇Volvariella volvacea菌丝体的可溶性蛋白进行分析,发现草菇菌丝在低温协迫中有新的可溶性蛋白产生,应用电泳技术分离纯化了草菇菌丝体中的一个低温诱导蛋白,经等电聚焦分析,该蛋白质的等电点6.79,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析该蛋白质是由分子最为70kD和48kD的两条多肽所组成。     

草菇低温诱导蛋白研究初探

对低温处理的草菇Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａ ｖｏｌｖａｃｅａ菌丝体的可溶性蛋白进行分析,发现草菇菌丝在低温协迫中有新的可溶性蛋白产生,应用电泳技术分离纯化了草菇菌丝体中的一个低温诱导蛋白,经等电聚焦分析,该蛋白质的等电点６．７９,ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳分析该蛋白质是由分子量为７０ｋＤ和４８ｋＤ的两条多肽所组成。     

草菇低温诱导蛋白分离纯化及其部分性质的测定*

采用硫酸铵分级沉淀和制备电泳分离技术,从低温处理过的草菇菌丝中分离纯化得到三种低温诱导蛋白,分别命名为CspDZG1 ,CspDZG2 ,CspDZG3。IEF测定了等电点,分别为3.7,4.4,4.4。SDS-PAGE结果表明,CspDZG1 ,CspDZG2由一条多肽组成,分子量分别为56kD,54.5kD;CspDZG3由两个亚基组成,分子量分别为54.5 kD,68 kD。经S. aureus V8蛋白酶酶解后,测定了N端氨基酸序列。     

草菇低温诱导蛋白分离纯化及其部分性质的测定

采用硫酸铵分级沉淀和制备电泳分离技术,从低温处理过的草菇菌丝中分离纯化得到三种低温诱导蛋白,分别命名为CspDZG1,CspDZG2,CspDZG3。IEF测定了等电点,分别为3．7,4．4,4．4。SDS-PAGE结果表明,CspDZG1,CspDZG2由一条多肽组成,分子量分别为56kD,54．5kD;CspDZG3由两个亚基组成,分子量分别为54．5kD,68kD。经S.aureus V8蛋白酶酶解后,测定了N端氨基酸序列。     

草菇GH61家族基因的生物信息学分析及金属离子对其表达水平的影响

在前期工作中发现草菇含有30个GH61家族基因同源物（Vv_gh61_1至Vv_gh61_30）,进一步分析了这些基因的结构特点以及其编码蛋白基本性质和系统进化关系,并研究了Cu2+和Mn2+对基因表达水平的影响。分析表明有17个草菇GH61基因串联成6个基因簇,存在明显的串联重复现象,系统发育树与基因外显子位置分析表明串联重复基因分布在同一进化分枝上并具有相似的基因结构,串联重复基因编码序列一致性在71%–94%之间。草菇GH61编码蛋白的氨基酸数目在217–442aa之间,分子量和等电点分别介于22.4–45.4kDa和5.2–9.3之间,绝大多数都含有信号肽并定位在细胞外,都含有Glyco_hydro_61功能域以及CBM1、peroxidase等多样化的功能域,系统进化树表明草菇GH61家族基因具有3个主要进化分枝,与灰盖鬼伞等的GH61基因有较近的进化关系。金属离子诱导作用显示,Mn2+对草菇GH61家族基因的表达水平存在诱导作用而Cu2+的诱导作用不明显。     

基因文库的鉴定和应用

由于草菇是一种同宗结合的食用真菌,这给草菇的杂交育种带来了一定的困难。本文在建立草菇部分基因文库的基础之上,对草菇的基因文库进行了鉴定。在草菇基因文库中任意抽取72个克隆,利用专一的PCR方法,测出在草菇基因文库中,草菇基因组DNA的平均大小为1156个碱基对。在基因文库中任意选择53个克隆,利用专一的PCR进行DNA扩增以及dig非同位素标记,用于和草菇基因组DNA杂交。在测试的53个克隆中有8％的高度重复序列,36％中度重复序列和56％的低度重复序列。     

An aspartic proteinase from human erythrocytes is immunochemically indistinguishable from a non-pepsin, electrophoretically slow moving proteinase from gastric mucosa

Antiserum raised against an erythrocyte membrane-attached aspartic proteinase precipitates a non-pepsin gastric proteinase. With a monospecific antiserum raised against the non-pepsin gastric proteinase the two enzymes show immunochemical identity. The isoelectric points of both are between 4.5 and 4.6. By SDS-polyacrylamide gel electrophoresis the two proteinases behave the same way. Under non-reducing conditions the main components show molecular weights around 90 000 and after reduction about 58 000. The proteinase may tentatively be classified as cathepsin E.     

宇佐美曲霉L336酸性蛋白酶的动力学性质*

L336酸性蛋白酶的分子量为54000,等电点为3．8±0．2。在pH2．5,40℃条件下,酶对酪蛋白、牛血清白蛋白和牛血红蛋白的Km值分别为0．263g／L、0．278g／L和0．415g／L,Vmax分别为2075、1550和2793μgTyr／min、mL,酪蛋白为最适底物。在pH2．0～5．0、40℃以下时酶的稳定性最好。此外,还研究了金属离子对酶活性的影响。     

一组新的沙蚕蛋白酶同工酶的分离纯化与鉴定

分离纯化一组新的沙蚕蛋白酶同工酶,并对其性质进行鉴定.用硫酸铵盐析、凝胶过滤层析和疏水层析技术从沙蚕中分离得到了沙蚕蛋白酶,经聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、高效液相色谱（HPLC）、等电聚焦电泳（IEF）和质谱分析（MS）鉴定,发现沙蚕蛋白酶由3个组分组成,均有纤溶活性,其等电点为3.5～4.5,分子量分别为29 248.75、29 007.66、28 954.17,肽指纹图谱分析发现,它们均为未知的新蛋白质,其中2个组分结构相似,具有较高的同源性,与另1个有不同.用抗原抗体反应鉴定其免疫原性,发现3个组分中有2个组分具有相同的免疫原性,另1个组分与2者不同.但3者具有相同的抗原决定簇,证明沙蚕蛋白酶由2个同工酶组成.以4种专一性的抑制剂对其进行抑制,检测酶的活性确定其酶学性质,发现其反应的适宜温度为40℃～50℃、适宜pH值为8～9.沙蚕蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶.     

An elastolytic proteinase from rabbit leukocytes: purification and partial characterization

A proteinase with elastolytic activity was isolated from granules of rabbit bloodstream leukocytes, and purified to apparent homogeneity by a multi-step procedure consisting of ammonium sulfate precipitation, batch fractionation on DEAE-Sephadex A-50, and finally by preparative isoelectric focusing (IEF) on Sephadex G-75 Superfine. The molecule weight of the enzyme, as determined by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), was 28,500. This enzyme shows an isoelectric point at pH 9.0. The proteinase is active against natural elastins as well as toward Suc-(Ala)3-NA, Methoxy-Suc-(Ala)2-Pro-Val-NA, and (to a lesser extent) against Suc-(Ala)2-Pro-Leu-NA and Boc-Ala-ONp. The inhibition profile of the isolated enzyme indicates that rabbit granulocyte elastase belongs to the group of serine proteinases. Inhibition by some natural proteinase inhibitors is also observed. Unlike other mammalian elastases, it is insensitive to elastatinal.     

Two kunitz-type proteinase inhibitors from potato tubers

Two proteinase inhibitors have been isolated from tubers of potato (Solanum tuberosum). Based on N-terminal amino acid sequence homologies, they are members of the Kunitz family of proteinase inhibitors. Potato Kunitz inhibitor-1 (molecular weight 19,500, isoelectric point 6.9) is a potent inhibitor of the animal pancreatic proteinase trypsin, and its amino terminus has significant homology to a recently characterized cathepsin D Kunitz inhibitor from potato tubers (Mares et al. [1989] FEBS Lett 251:94-98). Potato Kunitz inhibitor-2 (molecular weight 20,500, isoelectric point 8.6) is an inhibitor of the microbial proteinase subtilisin Carlsberg; its amino terminus is almost identical to an abundant 22 kilodalton protein from potato tubers (Suh et al. [1990] Plant Physiol 94:40-45) and has significant homology to other Kunitz-type subtilisin inhibitors from small grains. Both Kunitz inhibitors are abundant proteins of the cortex of potato tubers.