生物素对地衣芽孢杆菌生长和乳酸形成的影响

生物素对地衣芽孢杆菌生长和乳酸形成的影响胡尚勤（重庆师范学院生物系重庆６３００４７）地衣芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｕｓｌｉｃｇｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）是我国９０年代首次从正常待产妇阴道拭子分离出来的一个无毒新菌株。现在国内已经用它来生产“整肠生”活菌剂。它是一...     

地衣芽孢杆菌DSM13分泌蛋白信号肽分析

地衣芽孢杆菌是重要的工业微生物,对于其分泌途径及信号肽进行预测和分析,有助于改善影响蛋白分泌的关键因素,高效生产异源蛋白。本研究首次在全基因范围内,利用SignalPv3.0等方法识别了地衣芽孢杆菌DSM13中各种分泌蛋白的信号肽。DSM13信号肽类型包括分泌型Sec信号肽、双精氨酸Tat信号肽、脂蛋白信号肽、IV型纤毛结构信号肽及生物信息素信号肽。同时分析了分泌途径组成,信号肽长度,氨基酸组成,各分泌信号肽特征,与枯草芽孢杆菌的异同以及重要工业酶制剂的分泌途径。该研究对使DSM13成为更有效分泌表达外源蛋白表达系统,具有重要的理论指导意义。     

不同抑制剂对地衣芽孢杆菌生长影响的研究

报道了地衣芽孢杆菌对不同抑制剂的反应。结果表明,当ｐＨ在７．０时,链霉素浓度为５００μｇ／ｍＬ,青霉素浓度１０００μｇ／ｍＬ,头孢唑啉钠浓度为５００μｇ／ｍＬ时对地衣芽孢杆菌有明显抑制作用。这对正确使用地衣芽孢杆菌制剂（整肠生）提供了可靠的理论依据。     

地衣芽孢杆菌对家兔体液免疫功能的影响研究

本研究采用地衣芽孢杆菌制成微生态制剂,饲喂断奶后的家兔４０天,再用兔病毒性出血病（ＲＨＤ）组织灭活疫苗免疫,检测家兔产生的血清抗体对ＲＨＤ病毒的特异性血凝抑制价和血清免疫球蛋白的含量。结果,试验组家兔的血清抗体对ＲＨＤ病毒的特异性血凝抗体和血清免疫球蛋白含量均明显高于对照组。表明,地衣芽孢杆菌对家兔的体液免疫功能有促进作用,ＲＨＤ组织灭活疫苗与地衣芽孢杆菌制剂相结合较单独使用疫苗的效果更佳     

地衣芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶基因的克隆和特性

克隆了地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)谷氨酸脱氢酶基因(gdhA), 并研究其表达和功能. 发现野生型IRC-3 GDH-菌株和突变型IRC-8 GDH+菌株的gdhA基因都能互补大肠杆菌谷氨酸缺陷型菌Q100 GDH-的缺陷性状, 但突变型IRC-8 GDH+菌株的gdhA基因不能互补野生型IRC-3 GDH-菌株的谷氨酸缺陷性状. 经测序发现两者的核苷酸序列完全一致. gdhA基因在野生型IRC-3和突变型IRC-8中都能正常表达, 在野生型IRC-3细胞中未发现有抑制GDH活性的物质存在. 推测由于GDH翻译后调节的差异导致GDH表型的不同. 根据序列分析, 地衣芽孢杆菌GDH属于六聚体GDH中的家族Ⅰ, 而枯草芽孢杆菌GDH则属于家族Ⅱ, 两者间亲缘关系相距甚远.     

分泌高效蛋白的地衣芽孢杆菌及其工业应用

革兰氏阳性、腐生性地衣芽孢杆菌是高温α-淀粉酶、碱性蛋白酶的重要工业生产用菌株.其基因组大小约为4.22 Mb,已被多个国际机构认定为GRAS工业菌株.地衣芽孢杆菌具有完善的蛋白分泌体系,蛋白合成与分泌能力可达到20～25 mg/ml.在作为外源基因表达系统的研究中,建立了其遗传转化方法,完成了多种表达载体的构建与应用,以及进行了作为宿主细胞的地衣芽孢杆菌的遗传改良与多种重组蛋白表达的研究.显示地衣芽孢杆菌具有作为重组蛋白高效分泌表达的巨大潜力与工业应用价值.     

地衣芽孢杆菌的应用现状及展望

地衣芽孢杆菌是一种革兰氏染色呈阳性的益生菌,俗称整肠生,其细胞呈杆状排列、单生,能产生近中生的芽孢,形态为椭圆状,孢囊稍膨大。它在生活中主要应用于饲料添加、医药、工业等方面,本文综述了地衣芽孢杆菌的主要应用。     

地衣芽孢杆菌9945a转运蛋白YdgF1的功能鉴定

【目的】本研究对地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) 9945a菌株中ydgF1基因编码的转运蛋白进行功能鉴定。【方法】分别构建ydgF1基因过表达株9945a/pHY300-Shu-ydgF1和敲除株9945aΔydgF1,设计了以D-丙氨酸为唯一氮源的磷酸盐D-丙氨酸(phosphate D-alanine, PDA)培养基来考察菌株的生长能力,并进行细胞吸收实验。利用实时荧光定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)评价菌株9945a与9945aΔydgF1在LB培养基中不同生长时期ydgF1的相对表达量,然后对9945a与9945aΔydgF1后期的培养基平板活菌计数,计算菌落形成单位(colony-forming units, CFU)。【结果】在PDA培养基中,9945aΔydgF1的比生长速率始终低于9945a,而9945a/pHY300-Shu-ydgF1最大比生长速率为0.336h–1,是9945a/pHY300-Shu的1.98倍,并且培养15 h后9945...     

地衣芽孢杆菌原生质体电转化方法的研究

为了解决地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)工业菌株难以转化的问题,将原生质体制备、电穿孔和原生质体再生技术相结合,建立了一种地衣芽孢杆菌原生质体电击转化方法。在对菌体生长状态、溶菌酶作用时间、电转电压、渗透压保护剂等条件进行优化后,试验了将不同类型的表达载体,即游离型质粒p GJ103(3.3kb)和整合型质粒p AX01(9.3kb),分别转入两株地衣芽孢杆菌工业生产菌株B.licheniformis CICC 10181和B.licheniformis CICC 20204中。实验结果显示,对数生长期后期的菌体酶解40min后制备的地衣芽孢杆菌原生质体得率为96%,再生率达25%以上。原生质体与质粒DNA在最适电压0.6k V/mm下电击转化,并以0.5mol/L山梨醇或甘露醇作为渗透压保护剂进行再生培养后,最终游离型质粒的转化率可达0.88×102~1.1×102CFU/μg p GJ103,整合型质粒的转化率达到0.45×102~0.52×102CFU/μg p AX01。该方法为地衣芽孢杆菌野生工业菌株的遗传改造提供了一种新的、高效的转化手段。     

Purification and Properties of Three Forms of α-Glucosidase from Germinated Green Gram (Phaseolus vidissimus Ten.)

Three forms of α-glucosidase have been isolated from 5-day-old green gram (Phaseolus vidissimus Ten.) seedlings, by a procedure including fractionation with ammonium sulfate and polyethylene glycol 6000, DEAE-cellulose column chromatography, SP-Sephadex column chromatography, preparative gel electrofocusing and preparative disc gel electrophoresis. The α-glucosidases isolated were designated as α-glucosidase I, α-glucosidase II–1 and α-glucosidase II–2. They were homogeneous on polyacrylamide disc gel electrophoresis. Their molecular weights were 145,000, 105,000 and 65,000, respectively. The three enzymes hydrolyzed maltose, maltotriose, phenyl α-maltoside, amylose and soluble starch liberating glucose, but did not act on sucrose. Their enzymes hydrolyzed phenyl α-maltoside into glucose and phenyl α-glucoside. They hydrolyzed amylose liberating α-glucose. Maltotriose was the main α-glucosyltransfer product formed from maltose by the three α-glucosidases.     

Isolation and identification of secondary metabolites from hexane extract of culture filtrate of Bacillus licheniformis MTCC 7445

Hexane extract of cell free culture filtrate of Bacillus licheniformis MTCC 7445 isolated from rhizoshere soil of a resistant tomato plant showed antifungal activity against a number of soilborne and human pathogenic fungi. Maximum activity was observed against Botrytis cinerea (ED₅₀ = 23.79 μg/ml), Candida albicans (ED50 33.45 μg/ml) and Microsporum canis (ED₅₀ = 39.02 μg/ml). Metabolites such as 1-methyl pyrrolidene, 1-methyl cyclohexene, 4,4-dimethyl cyclohexane, ethyl-4-ethoxybenzoate, 2-butoxyethanol, naphthalene, ter butyl benzene and phenoxy acetic acid were identified by GC-MS and comparing the mass spectrum with the NIST library.     

地衣芽孢杆菌原生质体最佳形成和再生条件的研究

近年来,微生物原生质体融合及诱变受到广泛重视,实验方法日趋完善,实践证明它是一种有效的育种方法。在微生物原生质体制备和再生过程中,各种微生物所需的最佳条件差别很大。我们研究厂地衣芽孢杆菌53-A,菌株原生质体形成和再生的各种因素及最佳条件,并用光学显微镜和电镜观察了原生质体形成、再生和原生质体的聚集现象,现将结果报道如下。     

地衣芽孢杆菌β－甘露聚糖酶的纯化及酶学性质

地衣芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＮＫ－２７菌株发酵产生的β－甘露聚糖酶（β－ｍａｎｎａｎａｓｅ）经硫酸铵盐析沉淀,两次ＤＥＡＥ纤维素和ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１００离子交换柱层析以及制备ＰＡＧＥ筹步骤,获得了凝胶电泳均一的样品。用ＳＤＳ－凝胶电泳测得纯化后的β－甘露聚糖酶分子量为２６ｋＤ,用凝胶聚焦电泳测得等电点ＰＩ为５．０。酶反应的最适ｐＨ为９．０,最后温度为６０℃,稳定ｐＨ为６．０—９．０,稳定温度为４０℃。金属离子中Ｍｇ￣（２＋）、Ｃａ￣（２＋）、Ｆｅ￣（２＋）、Ｎｉ￣（２＋）对该酶有一定的激活作用;而Ｓｎ￣（２＋）、Ｚｎ￣（２＋）、Ａｌ￣（３＋）、Ａｇ￣＋和Ｈｇ￣（２＋）对该酶有强烈的抑制作用。ＮＫ－２７菌株的β－甘露聚糖酶对魔芋葡萄甘露聚糖和角豆胶半乳甘露聚糖的Ｋｍ值分别为７．１４和５．５６ｍｇ·ｍｌ￣（－１）;Ｖ＿（ｍａｘ）分别为２００．５３和１５７．４５μｍｏｌ·ｍｇ￣（－１）·ｍｉｎ￣（－１）。     

溶剂稳定性蛋白酶产生菌Bacillus licheniformis YP1的发酵优化

溶剂稳定性蛋白酶产生菌Bacillus licheniformis YP1分离自油田土样。考察了碳源、氮源、金属离子等营养因素对YP1菌株发酵产溶剂稳定性蛋白酶的影响。YP1菌株发酵产胞外蛋白酶的最佳碳源为淀粉,果糖、甘露糖和乳糖显著抑制产酶;最佳氮源为酵母膏,干酪素、酵母粉和牛肉膏促进产酶,玉米浆和尿素显著抑制产酶。Mn^2＋可以显著促进酶活,Mg^2＋可以促进产酶,在初步优化的培养条件下,YP1菌株的胞外蛋白酶产量达980U。     

Co-linear scaffold of the Bacillus licheniformis and Bacillus subtilis genomes and its use to compare their competence genes

We have established the co-linear regions of Bacillus licheniformis, an industrially important bacterium, and Bacillus subtilis, a model bacterium. In the co-linear regions, revealed by PCR, gene content and order are presumed to be conserved. These regions constitute approximately 60% of the compared chromosomes. Sequencing of the competence genes of B. licheniformis allowed us to validate the approach, and to demonstrate how it can be used for the comparative analysis of complex genetic systems. A new insertion sequence, designated IS3Bli1, was discovered in the competence region of the analyzed B. licheniformis strain.     

Development of an asporogenic Bacillus licheniformis for the production of keratinase

AIMS: Bacillus licheniformis PWD-1 is a keratin-degrading, spore-forming bacterium isolated from a poultry waste digester. A sporulation-deficient mutant of B. licheniformis PWD-1, named B. licheniformis WBG, was developed and characterized. METHODS AND RESULTS: The mutation was generated using the splicing by overlap extension PCR method (Gene SOEing) to create 256 bp deletion in the spoIIAC gene, which encodes an essential sporulation-specific sigma factor. In vivo gene replacement was accomplished with the use of a temperature-sensitive plasmid that is able to integrate and excise the nucleotide fragment 256 bp from the B. licheniformis chromosome. PCR analysis and DNA sequencing confirmed the spoIIAC gene deletion. Heat-treatment assays and electron microscopy verified the absence of spores. CONCLUSIONS: This asporogenic strain is able to express normal levels of keratinase when compared with its wild-type host. SIGNIFICANCE AND IMPACT OF THE STUDY: In this study, a method of constructing a stable sporulation-defective strain was developed. It can be potentially useful as a tool to generate asporogenic strains of Bacillus that retain their industrial capabilities for production of exoproteases and other exozymes.     

地衣芽孢杆菌H-1的鉴定及其产木聚糖酶性质的研究

本实验室分离到一株木聚糖酶高产菌,经形态、生理以及生化鉴定,确认为地衣穿孢杆菌,定名为H-1。对H-1的胞外木聚糖酶进行初步的研究。从碳源利用方面,认为 H-1的木聚糖酶为组成型合成。木聚糖和纤维二糖对它有诱导作用,而木糖和葡萄糖对酶的产生有阻抑作用。对酶解产物分析表明,有小分子糖产生、但并非都是单糖。H-1胞外木聚糖酶经60％硫酸铵沉淀,过DEAE-50柱,以及超过滤,得到了部分纯化酶。该酶作用的最适pH为7.6,在pH4～5范围较为稳定;最适温度为50℃; 70℃25min则完全失活。米氏常数为10.42×10~(-3)g/ml,最大反应速度为0.345μmol/min。2mM Ag~+使酶活增加了1.5倍,2mM EDTA抑制了 22％的酶活性,而2mM Cu~(++)则使酶完全失活。     

地衣芽孢杆菌MY75菌株几丁质酶基因的异源表达及特性

【目的】地衣芽孢杆菌MY75菌株的几丁质酶基因的异源表达,并对表达蛋白的特性进行研究。【方法】制备MY75菌株培养上清粗蛋白,利用酶谱分析确定具有几丁质酶活的蛋白分子量。将该蛋白进行飞行时间质谱分析,确定其部分氨基酸序列,设计PCR引物对MY75菌株的几丁质酶基因进行克隆及异源表达。对表达蛋白的最适反应温度及pH,温度耐受性及金属离子对酶活力的影响等特性进行了研究,并测定了表达蛋白对真菌孢子萌发的抑制活性和对甜菜夜蛾幼虫的杀虫增效作用。【结果】酶谱分析证明MY75菌株培养上清液中仅含有一种55kDa的几丁质酶。将该编码基因chiMY克隆及序列分析后发现,基因长度为1797bp,编码599个氨基酸。在大肠杆菌中异源表达的几丁质酶ChiMY蛋白的分子量为67kDa。质谱分析证明,55kDa蛋白与67kDa蛋白序列相同。ChiMY最适pH和最适温度分别为7.0和50°C,为中性几丁质酶。Li+,Na+,和Mg2+离子对表达蛋白的酶活力具有促进作用,Mn2+,Cr3+,Zn2+和Ag+离子则能显著抑制酶活力,Cu2+和Fe3+离子完全抑制酶活性。生物测定的结果显示,异源表达的MY75几丁质酶能够抑制小麦赤霉及黑曲霉的孢子萌发,并且对苏云金芽孢杆菌的杀虫活力具有增效作用。【结论】地衣芽孢杆菌MY75菌株中仅有一种55kDa几丁质酶,其编码基因能够在大肠杆菌中大量表达,表达蛋白分子量与野生型蛋白之间有显著差异,由此证明MY75菌株中存在着几丁质酶的剪切加工过程。明确了地衣芽孢杆菌几丁质酶ChiMY具有抑制真菌活性及杀虫增效作用。上述全部研究结论在国内首次报道。