逆转录环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP)在H5N1禽流感病毒基因检测中的应用

建立一种便捷、灵敏的检测方法,即逆转录环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP)用于H5N1亚型禽流感病毒基因检测.该技术使用特异对应于靶序列中8个基因区段的6条特异引物,在等温条件下进行核酸扩增反应.对51份实验感染动物及病毒培养标本的H5N1亚型禽流感病毒的HA、NA基因区进行了RT-LAMP检测,并以SYBR Green Ⅰ为反应指示剂进行了逆转录环介导等温核酸扩增技术,对该反应进行实时监控,经对扩增产物做内切酶验证和测序分析,证明RT-LAMP技术的特异性;同时,用10倍系列稀释的RNA样品对该检测方法的灵敏度进行了测试.结果显示:利用RT-LAMP技术成功检测到H5N1禽流感病毒的HA、NA基因区,且RT-LAMP与Real-time PCR结果呈现很好的一致性.此方法的灵敏度可达到能检测10个拷贝RNA分子水平.因此,RT-LAMP技术应用于H5N1亚型禽流感病毒的快速检测是一种可行的方法.     

H5N1禽流感病毒环介导等温扩增快速检测方法的建立

目的：建立H5N1禽流感病毒环介导等温扩增（LAMP）快速检测方法。方法：从GenBank中获得H5N1禽流感病毒血凝素（HA）基因序列,应用DNAStar软件MegAlign程序分析其序列,利用PrimerExplorerV3软件在序列保守区域设计LAMP引物,即外引物、内引物和环引物,同时以所克隆的阳性质粒为模板,对试验中的几个重要参数进行优化。结果：LAMP检测方法对H5N1禽流感病毒的灵敏度达到4～6个拷贝,其引物对于H1、H9亚型禽流感病毒和新城疫病毒无非特异性扩增,表现出良好的H5亚型特异性。结论：建立的H5N1禽流感病毒环介导等温扩增快速检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,为快速检测禽流感病毒提供了新方法和新思路。     

H6亚型禽流感病毒RT-LAMP检测方法的建立

建立一种快速、敏感、特异的检测H6亚型禽流感病毒(AIV)逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法.根据H6亚型AIV血凝素(HA)基因序列的保守区8个位点设计了6条特异性LAMP引物,以H6亚型AIV阳性样品RNA为模板进行一步法扩增,对反应条件和反应体系进行优化.结果表明该方法的特异性良好,对其他呼吸道病原体均无扩增反应.该方法灵敏度高,最低可检测到H6亚型AIV RNA为0.01 pg,该方法无需特殊仪器,只需在水浴锅中进行,是一种适于基层的简便、灵敏、快速的H6亚型AIV检测方法.     

环介导逆转录等温扩增技术检测中东呼吸综合征冠状病毒基因

建立了基于浊度仪和羟基萘酚蓝(Hydroxy naphthol blue,HNB)颜色变化的简单、快速和灵敏的环介导逆转录等温扩增技术(RT-LAMP)检测方法,应用于中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)的检测。针对MERS-CoV的核衣壳蛋白基因(Nucleocapsid,N)设计6条特异引物,在等温条件下(63℃)进行60min扩增反应。通过实时浊度仪记录扩增曲线和扩增前在反应体系中加入HNB观察颜色变化两种方式进行检测结果判定。本文对不同人类冠状病毒及常见呼吸道病毒进行了特异性验证,对梯度稀释的体外转录MERS-CoV全N基因RNA进行了定量和检测限分析,同时与已发表的实时荧光定量PCR(rRT-PCR)进行比较。结果显示,本研究建立的RT-LAMP方法特异性高,对于每反应管103至106的拷贝数RNA,出峰时间与每反应管N基因RNA拷贝数对数值有稳定的线性关系。基于浊度仪和颜色判定的RT-LAMP检测方法检测限分别为500拷贝和1 000拷贝。因此,该方法有望应用于MERS-CoV感染的快速筛选,具有在基层医疗卫生机构和现场推广和应用的潜力。     

鹅副黏病毒环介导等温扩增快速检测方法的建立及应用

参照GenBank中登录的鹅副黏病毒(gallinacean paramyxovirus,GPMV)序列(AY325797),针对GPMV的F基因保守区域设计了4条引物,通过优化反应条件,建立了检测GPMV的逆转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP),并进行了特异性试验、敏感性试验及临床样本检测.结果显示,建立的RT-LAMP方法对GPMV阳性样品扩增产物的电泳呈特征性梯状条带,而鸭瘟病毒(DPV)、鹅细小病毒(GPV)、番鸭细小病毒(MDPV)、鸭肝炎病毒(DHV)、鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer)、鸭源沙门氏菌(Salmonella anatamu)、鸡马立克病毒(MDV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的扩增产物电泳后均无扩增条带.建立的RT-LAMP方法对GPMV的最低检出量为9.5 fg的cDNA模板,敏感性比常规RT-PCR方法高1 000倍.表明建立的RT-LAMP方法特异性强、敏感性高.对6份临床样本的检出率为100％ (6/6),与常规RT-PCR的符合率为100％.     

环介导逆转录等温扩增技术(RT-LAMP)在丙型肝炎病毒基因检测中的应用

该文介绍了一种便捷、灵敏而又特异的环介导逆转录等温扩增基因检测技术,该技术分别使用特异对应于靶序列中8个基因区段的3对特殊引物,并在反转录酶和Bst-DNA聚合酶的作用下对靶序列进行等温核酸扩增反应,整个检测反应只需1~2h。利用这种技术成功检测了丙型肝炎病毒基因,对60份经Real-time PCR或RT-PCR验证阳性的血清样品检测,阳性符合率为98%。同时,对扩增终产物进一步进行酶切分析,并与HIV、HBV和不同亚型流感病毒RNA进行交叉反应和特异性测试,均与预期结果吻合。将Real-time PCR定量后的RNA系列稀释后对检测方法的灵敏度进行了测试。结果显示,该技术的检测灵敏度在理论上可达到10个拷贝的RNA分子。以上结果证明,RT-LAMP扩增技术是一种检测程序简单、灵敏度和特异性较高的基因检测手段,在丙型肝炎病毒的快速检测方面具有一定的开发潜力。     

植物青枯病菌环介导等温扩增快速检测技术研究

为实现植物青枯病的早期诊断,需要建立一种适于田间快速便捷检测青枯病菌的方法。以细胞色素C基因为靶标设计一套特异性引物,建立了植物青枯病的LAMP检测方法。此方法最低检测极限为1 pg,可在1 h内完成,不依赖昂贵复杂的仪器,结果可经肉眼观察。利用此方法,在人工接种发病的茄子、番茄、花生、芝麻和凹头苋茎部浸出液和马铃薯病薯块茎组织液中均检测出青枯病菌的存在,尤其适用于田间疑似罹病的芝麻、花生、番茄、马铃薯和甘薯等植株的检测,且LAMP法的检出率远高于PCR法。应用LAMP技术检测青枯病菌快速高效、特异性强、灵敏度高,操作简单,适于在基层推广运用。     

用基因疫苗制备H9亚型禽流感病毒单克隆抗体

用H9亚型禽流感病毒(AIV)HA基因反转录cDNA第一链PCR扩增其HA基因,PCR产物与pcDNA3.1( )质粒构建重组质粒作为基因疫苗免疫8周龄Balb/C小鼠,细胞融合后用血凝抑制试验(HI)和ELISA试验检测细胞培养上清,各获得一株阳性细胞株,经3次亚克隆后都能稳定分泌H9AIV特异性抗体。特异性检测与NDV、H5亚型AIV、产蛋下降综合症(EDS76)病毒毒株没有反应,2株单抗经亚型鉴定均为IgG2b,轻链的亚型为kappa链。所获得的单克隆抗体将在禽流感快速诊断和疾病预警监控中发挥重要作用。     

抗H9亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体的制备和鉴定

目的:获得分泌抗H9亚型禽流感病毒(AIV)血凝素单克隆抗体的杂交瘤细胞。方法:以H9N2亚型AIV为免疫原,免疫6～8周龄雌性BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0-Ag-14,在PEG4000的作用下进行细胞融合,通过血凝抑制(HI)试验筛选分泌抗H9亚型AIV血凝素单克隆抗体的杂交瘤细胞。结果:经过连续3～4次克隆化,获得能稳定分泌抗H9亚型AIV血凝素的单克隆抗体细胞系6株,分别命名为1B2、1C10、1G2、2B7、2E3和5E11。6株细胞培养上清HI效价为24～28,腹水HI效价为210～213。除1G2为IgM外,其余5株均为IgG1。Western blotting结果显示,1B2、1C10、2B7和2E3能与AIVH9蛋白在Mr为75000处反应,表明其是针对AIVH9亚型血凝素蛋白的单抗。特异性试验表明该6株单抗均只与H9亚型AIV发生特异性HI反应,而不与其他14个HA亚型的AIV及新城疫病毒、传染性支气管炎病毒发生交叉反应,显示出良好的特异性。结论:制备了针对H9亚型禽流感病毒血凝素的单克隆抗体,为禽流感的快速诊断和病毒的抗原性分析等奠定了基础。     

NASBA快速检测禽流感H5亚型病毒

采用建立的依赖核酸序列的扩增(Nucleicacidsequencebasedamplification,NASBA)对禽流感病毒3株H5亚型、1株H1、H3、H6亚型、3株禽流感H9亚型、5株不同宿主来源的新城疫病毒、鸭肝炎病毒、鸭瘟病毒、SPF鸡胚尿囊液及禽流感(H9)疫苗、新城疫疫苗、传染性法氏囊病疫苗、传染性支气管炎疫苗进行检测,结果NASBA(H5试剂)仅检测到禽流感病毒H5亚型,表明方法的特异性强。采用已知禽流感病毒A/Chicken/HK/1000/97(H5N1)的鸡胚尿囊液(ELD5010-7.5/mL),经10倍连续稀释,将经典的鸡胚病原分离法和NASBA进行比较,二种方法的灵敏度相当。用A/Chicken/HK/1000/97(H5N1)病毒人工感染SPF鸡、商品鸡,采用NASBA和病原分离法同时对人工感染鸡的粪拭子、血液进行了动态检测;采集感染死亡鸡的组织脏器,共检测了101个组织脏器,两种方法的符合率为90%(87/97)。     

共表达H5和H9亚型禽流行性感冒病毒血凝素基因的重组禽痘病毒及其免疫效力

为了构建更为安全有效能同时抵抗高致病性H5亚型和低致病忡H9亚型禽流行性感冒(禽流感)病毒的基因工程疫苗,将H5和H9亚型禽流感病毒分离株的血凝素(HA)基因,分别由鸡痘病毒早晚期启动子PS和PE／L调控其转求,定向插入鸡痘病毒转移载体p11s中,获得H5A和H9A基因分别处于PS及PE／L启动子转录调控下的重组转移载体p11SH5H9。以FuGene^TM6转染法将p11SH5H9转染至已感染鸡痘病毒282E4疫苗株(wt-FPV)的鸡胚成纤维细胞(CEF)中。p11SH5H9与wt—FPV基因组DNA之间的同源重组产生了重组鸡痘病毒rFPV11SH5H9。通过在含X-gal的营养琼脂上连续挑选蓝色病毒蚀斑获得并纯化rFPV-11SH5H9。以间接免疫荧光法试验证实,纯化的rFPV-11SH5H9感染的CEF能同时表达H5A和H9A。初步的动物试验表明,用10^5PFU的rFPV-11SH5H9免疫无特定病原体(SPF)鸡,免疫后血凝抑制(HI)抗体监测阳性率均为100％(8／8);该重组病毒能显著抑制H9亚型AIV滴鼻、点眼后7日龄SPF鸡从气管和泄殖腔排毒,同时也能抵抗H5亚型AIV肌肉注射后对7日龄SPF鸡致死性攻击,保护率均为100％,显示出一定的应用前景。     

H9N2禽流感病毒反向遗传系统转录／表达载体的构建和验证

设计带有BsmBI、BsaI或AarI酶切位点的引物,用RT-PCR扩增H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的8个基因全长片段,克隆入双向转录/表达载体pHW2000,并在PB2、PB1和NA基因中共引入了3个沉默突变标签。将其2个表面基因(HA和NA基因)加上任意1个内部基因,而其它5个内部基因来自A/WSN/33,进行了6种3 5组合形式的基因重排,把相应组合的转录/表达质粒共转染COS-1细胞,均产生了预期组合、有感染性的H9N2亚型流感病毒,表明亲缘关系遥远的流感病毒可以互相获取基因片段产生重组病毒,提示表面结构基因和单个内部基因不足以限制H9N2AIV在哺乳动物细胞上的宿主范围,同时也验证了构建的8个转录/表达载体均能有效工作,为进一步研究H9N2亚型AIV基因结构与功能、AIV与宿主之间的关系打下了基础。