抑前胸腺肽在家蚕体内的活性作用

家蚕Bombyx mori抑前胸腺肽是昆虫脑神经肽的一种,体外实验表明它能抑制处于活动时期的家蚕前胸腺合成蜕皮激素,因此抑前胸腺肽可能对昆虫的变态起着重要的作用。将抑前胸腺肽以不同的浓度分单一注射和加强注射导入家蚕体内,不同的时间间隔取样,利用蜕皮激素放射免疫分析方法,观察到了抑前胸腺肽在家蚕体内的活性作用以及引起家蚕体内血淋巴中蜕皮激素浓度的动态变化,首次证明了抑前胸腺肽在体内对家蚕前胸腺合成蜕皮激素有强烈的抑制作用。     

家蚕抑前胸腺肽类似物的活性鉴定和结构分析

以家蚕Bombyx mori抑前胸腺肽的氨基酸序列作为基础,通过氨基酸残基的添加、减少和置换,人工合成了一组与家蚕抑前胸腺肽结构类似的多肽。利用家蚕前胸腺体外培养技术,结合蜕皮激素放射免疫分析方法,鉴定了与抑前胸腺肽结构类似的多肽的生理活性,并对它们的活性特征、化学参数、结构和功能、信号传导途径进行了综合的比较和分析。类似物899808的生物学功能与抑前胸腺肽的相同而且活性近似;类似物899805和899809对家蚕前胸腺蜕皮激素的生物合成表现出随浓度增加而增加的促进作用,而低浓度下几乎不促进;899803、899804、899806和899807类似物对家蚕前胸腺蜕皮激素的生物合成的促进和抑制作用与它们的浓度有着依赖关系。实验结果表明,对抑前胸腺肽的氨基酸序列作任何改变,都导致其生理活性的下降、丧失甚至相反的活性。     

抑前胸腺肽PTSP

近年发现和鉴定的新型昆虫脑神经肽－抑前胸腺肽,对昆虫的变态起着重要的作用。本介绍它的研究背景、结构、功能、与促前胸腺素的相互作用关系及其分子生物学研究的结果,并对它的研究作了评价和展望。     

胸腺肽α1活性片段和其自旋标记衍生物的合成及免疫活性研究

报道了胸腺肽α１活性片段Ｔｈｙｍｏｓｉｎα１ＯＨ和其自旋标记衍生物的合成及对实验动物免疫功能的影响。实验结果表明人工合成胸腺肽α１活性片段及其自旋标记生物具有显著的免疫促进活性。     

家蚕浓核病毒 (中国镇江株)在不同感受性宿主体内的复制

家蚕浓核病毒中国镇江株是一株双生浓核病毒(bidensovirus)。其宿主感染后的病症与典型的家蚕浓核病毒(BmDNV-1伊那株)表现相似,病蚕软化,中肠的圆筒型细胞呈浓核症。该病毒的最大特点是基因组中含有二套DNA分子(VD1,VD2),这两种核酸分子以单链( VD1,-VD1, VD2,-VD2)线型方式被分开包装在各自的衣壳蛋白中,成为四种病毒体,而且它自身编码DNA聚合酶。有部分蚕品种对该病毒表现完全抗性,即不发病。分别对敏感性家蚕品种(华八35)和抗性家蚕品种(秋丰d)的幼虫进行经口接种病毒。在接种后,从2h到96h分9个时间点,对中肠组织进行取样。以家蚕细胞质肌动蛋白A3(actinA3)基因作为参比基因,用来标定取样组织细胞数。针对VD1和VD2分别设计特异引物,用荧光定量PCR的方法分别检测各个时间点的样品中的病毒基因组VD1和VD2拷贝数。结果表明:无论是在感性还是在抗性宿主体内,家蚕浓核病毒中国株的基因组VD1和VD2在各时间点拷贝数相近,表现出VD1和VD2是同步复制的;病毒侵入两种宿主中肠的初始量(接种后2h)基本相等,每个细胞约为6~10拷贝数。在敏感性宿主体内病毒感染过程表现为潜伏期,指数增长期,平台期。从接种后2h到12h为病毒潜伏期;12h到36h为指数增长期,倍增时间为1·71h,大约扩增15次;36h到96h为平台期,进入平台期病毒的拷贝数达到20万个。在抗性宿主体内病毒处于一种极低水平的增殖,从添毒后2h的6~10拷贝数到96h的150~200拷贝数,病毒复制倍增时间分别为3h和12h,大约扩增5次。推测家蚕对浓核病毒中国株的抗病性,只是一种慢性的带毒不发病的表现。     

家蚕BmPGRP-S5蛋白的抑菌活性及其在细胞免疫中的作用

【目的】肽聚糖识别蛋白(peptidoglycan-recognition proteins, PGRP)可以特异性识别细菌细胞壁中的肽聚糖peptidoglycan, PGN),并通过免疫缺陷(immune deficiency, IMD)途径和Toll途径诱导昆虫抗菌肽的产生。本研究旨在探讨家蚕Bombyx mori肽聚糖识别蛋白BmPGRP-S5的抑菌活性及在引发家蚕细胞免疫中的作用。【方法】用果蝇胚胎S2细胞表达BmPGRP-S5蛋白;通过细菌生长曲线法检测BmPGRP-S5蛋白对大肠杆菌Escherichia coli K₁₂D₃₁、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus和巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium的抑菌活性;ELISA检测BmPGRP-S5蛋白与大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis胞壁组分的结合力;通过测定吸光值和观察家蚕血淋巴黑化反应分析BmPGRP-S5对细菌胞壁组分激活酚氧化酶原(prophenoloxidase, PPO)的影响,并通过异硫氰酸荧光素(FITC)标记法检测BmPGRP-S5对家蚕血细胞吞噬细菌的影响。【结果】获得表达纯化的BmPGRP-S5蛋白。BmPGRP-S5蛋白对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌K₁₂D₃₁和巨大芽孢杆菌无抑菌效果,加入40 μmol/L的Zn²⁺后,其对巨大芽孢杆菌的抑菌效果明显增强。ELISA结果表明,BmPGRP-S5蛋白与来自金黄色葡萄球菌的PGN和枯草芽孢杆菌脂磷壁酸(LTA)的结合能力较强,同时也促进了这两种细菌胞壁组分激活家蚕血淋巴酚氧化酶原,加快胞璧组分介导的家蚕血淋巴黑化反应。加入BmPGRP-S5蛋白后,家蚕血细胞对金黄色葡萄球菌的吞噬率提高到53.33%左右,对大肠杆菌K₁₂D₃₁的吞噬率在25.83%左右,对巨大芽孢杆菌的吞噬率达30.83%左右,与对照组相比显著增强。【结论】BmPGRP-S5抑菌作用依赖于Zn²⁺,可能与其酰胺酶活性有关。BmPGRP-S5可以通过识别细菌胞壁组分PGN或LTA在家蚕的黑化反应和细胞吞噬中发挥作用。本研究使用的BmPGRP-S5蛋白是通过在果蝇 S2 细胞进行重组表达获得,更能真实地反映其在昆虫体内生理状态下的功能活性。因此,本研究的结果对进一步开发利用BmPGRP-S5有指导意义。     

人白细胞介素-11基因在家蚕培养细胞和虫体内的表达

将缺少编码信号肽序列的人白细胞介素－11（hIL-11)546核苷酸cDNA,重组于质粒pBacPAK8构建重组转移载体pBacIL-11,与经线性化修饰的家蚕核型多角体病毒（BmBacPAK)DNA共转染家蚕培养细胞株BmN,获得了插入hIL-11基因的重组病毒。Southern杂交表明重组病毒基因组中含有hIL-11基因片段,RNA斑点杂交表明hIL-11基因得到了转录。重组病毒感BmN细胞株、家蚕幼虫和蛹,在细胞培养上清、细胞抽提物、幼虫和蛹的体液样品中,SDS－PAGE电泳分析都能检测得到表达产物的特异性条带;采用IL－11依赖细胞株B9－11和MTT法测定表达产物的生物活性,表明rIL-11基因分别在培养细胞和蚕体内得到了高效表达。     

香菇多糖体内抗氧化活性研究

目的：探究香菇多糖的体内抗氧化活性。方法：以灌胃生理盐水的小鼠为正常对照组,将香菇多糖药物组分为低、中、高3种剂量组。小鼠在灌胃3w后,由眼眶取血,按照试剂盒要求测定小鼠血清中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活力以及丙二醛（MDA）含量。结果：香菇多糖可显著提高小鼠血清中SOD和GSH-Px的活力,同时减少血清中MDA含量。结论：香菇多糖对小鼠体内抗氧化活性的提高具有显著作用。     

20E诱导家蚕抗菌肽CecropinB6的上调表达

蜕皮激素(20-hydroxyecdysone, 20E)是调控昆虫发育的重要激素,在昆虫的蜕皮和变态中起关键作用。近年来的研究表明,20E也调控昆虫抗菌肽的表达,揭示昆虫的发育和免疫之间具有重要的联系。家蚕是重要的经济昆虫,家蚕抗菌肽对蜕皮激素(20E)的应答及其调控机制仍有待研究。本文利用20E注射家蚕5龄第3天幼虫,qRT-PCR结果表明20E处理的脂肪体中抗菌肽CecropinB6基因(BmCecB6)的表达上调。通过对抗菌肽BmCecB6上游启动子的截短和双荧光素酶活性分析,结果显示BmCecB6响应20E的调控位点在启动子-448～-170区域,该区域内存在潜在的FoxO、E74A和BR-C等结合位点。本研究表明20E抑制了ILS通路水平,暗示ILS下游的转录因子FoxO被激活。进一步对BmCecB6的启动子进行FoxO结合位点的缺失突变,双荧光素酶检测结果表明20E对BmCecB6的诱导活性并没有丧失,推测BmCecB6对20E的应答不是通过转录因子FoxO结合BmCecB6启动子中的顺式调控元件直接调控的。20E激活BmCecB6表达的分子调控机制还需要进一步深入研究。     

鸡α干扰素在家蚕中的表达及抗病毒活性测定

鸡α干扰素在防御病毒感染及治疗病毒性疾病中起着重要的作用。旨在利用家蚕杆状病毒表达系统研制有活性的鸡α干扰素。首先对鸡α干扰素基因(ChIFN-α)进行了优化与合成,将其克隆到杆状病毒转移载体pVL1393中,与ORF1629缺损的亲本病毒BmBcmid共转染,纯化重组病毒,再感染家蚕幼虫,收集蚕血淋巴以检测α干扰素基因的表达。Western blot分析结果显示,成功表达出分子量约为19 kD的鸡α干扰素。采用细胞病变抑制法在Vero-VSV*GFP系统中测定表达产物的抗病毒活性。所的表达的鸡α干扰素具有明显的抗病毒活性,活性不低于3.2×105 U/mL。利用杆状病毒载体系统成功地表达了具有抗病毒活性的鸡α干扰素的成熟蛋白,为开发廉价高效的鸡干扰素生物制剂奠定了物质基础。     

Construction of the Bac-to-Bac System of Bombyx mori Nucleopolyhedroviru

To construct the Bac-to-Bac expression system of Bombyx mori nucleopolyhedrovirus (BmNPV), a transfer vector was constructed which contained an Escherichia coli (E. coli) mini-F replicon and a lacZ: attTN7: lacZ cassette within the upstream and downstream regions of the BmNPV polyhedrin gene. B. mori larvae were cotransfected with wild-type BmNPV genomic DNA and the transfer vector through subcutaneous injection to generate recombinant viruses by homologous recombination in vivo. The genomic DNA of budded viruses extracted from the hemolymph of the transfected larvae was used to transform E. coli DH10B. Recombinant bacmids were screened by kanamycin resistance, PCR and restriction enzyme (REN) digestion. One of the bacmid colonies, BmBacJS13, which had similar REN profiles to that of wild-type BmNPV, was selected for further research. To investigate the infectivity of BmBacJS13, the polyhedrin gene was introduced into the bacmid and the resultant recombinant (BmBacJS13-ph) was transfected to BmN cells. The budded viruses were collected from the supernatant of the transfected cells and used for infecting BmN cells. Growth curve analysis indicated that BmBacJS13-ph had a similar growth curve to that of wild-type BmNPV. Bio-assays indicated that BmBacJS13-ph was also infectious to B. mori larvae.     

Construction of the Bac-to-Bac System of Bombyx mori Nucleopolyhedroviru

To construct the Bac-to-Bac expression system of Bombyx mori nucleopolyhedrovirus(BmNPV),a transfer vector was constructed which contained an Escherichia coli(E.coli)mini-F replicon and a lacZ:attTN7:lacZ cassette within the upstream and downstream regions of the BmNPV polyhedrin gene.B.mori larvae were cotransfected with wild-type BmNPV genomic DNA and the transfer vector through subcutaneous injection to generate recombinant viruses by homologous recombination in vivo.The genomic DNA of budded viruses extracted from the hemolymph of the transfected larvae was used to transform E.coli DH10B.Recombinant bacmids were screened by kanamycin resistance,PCR and restriction enzyme(REN)digestion.One of the bacmid colonies,BmBacJS13,which had similar REN profiles to that of wild-type BmNPV,was selected for further research.To investigate the infectivity of BmBacJS13,the polyhedrin gene was introduced into the bacmid and the resultant recombinant(BmBacJS13-ph)was transfected to BmN cells.The budded viruses were collected from the supernatant of the transfected cells and used for infecting BmN cells.Growth curve analysis indicated that BmBacJS13-ph had a similar growth curve to that of wild-type BmNPV.Bio-assays indicated that BmBacJS13-ph was also infectious to B.mori larvae.     

家蚕拟抗微生物肽Gloverins基因（Bmglv）的原核表达及抗菌活性鉴定

家蚕Bombyx mori基因组全测序于2004年完成后,由家蚕基因组注释发现了35条拟抗微生物肽基因序列。本研究选取其中的5条Gloverins同系物（isoforms）基因(BmglvB,BmglvA2 ,BmglvA3,BmglvA5和BmglvA6 ),克隆至pET-21d载体,转化Escherichia coli Rosetta^TM（DE3）宿主菌进行表达;克隆表达的5个家蚕Gloverins同系物基因大部分以可溶形式表达,经Ni-NTA亲和层析纯化和Sephadex G-10脱盐处理后,采用平板孔穴抑菌法测定其抗菌活性。结果表明：注释发现的5条家蚕拟抗微生物肽Gloverins同系物基因,具有与在其他昆虫中已鉴定报道的Gloverin相似的抗革兰氏阴性细菌的功能,实验确认了它们就是家蚕Gloverins抗微生物肽基因。     

家蚕对马尾松毛虫质型多角体病毒的敏感性

用虫体克隆技术,对马尾松毛虫质型多角体病毒湖南株（DpCPV-HN）进行了分离纯化,鉴定为质型多角体病毒1型。以家蚕春蕾×镇珠杂种F₁代及自交的F₂代4或5日龄幼虫进行毒力测定,以纯化的家蚕质型多角体病毒对F₁代幼虫的毒力测定为对照。结果表明：家蚕品种春蕾×镇珠对家蚕质型多角体病毒敏感,马尾松毛虫质型多角体病毒湖南株能引起其感染发病;马尾松毛虫质型多角体病毒湖南株感染家蚕品种春蕾×镇珠F₁代幼虫和F₂代幼虫28天后的半致死剂量（LD₅₀）分别为885个和18个CPB(质多角体),前者为后者的49倍。马尾松毛虫质型多角体病毒湖南株感染后的家蚕,其结茧率、化蛹率、羽化率、全茧量、茧层量和单蛾产卵数均有所下降,全茧量、茧层量、茧层率和单蛾产卵数与病毒感染剂量之间无显著关联。     

Analysis of precocious metamorphosis induced by application of an imidazole derivative to early third instar larvae of the silkworm,Bombyx mori

When an imidazole derivative (KK-42) was applied to day 1 third instar larvae of the silkworm, Bombyx mori, 100% underwent precocious metamorphosis at the end of the fourth instar. Thus, the fourth instar becomes the last instar in these KK-42–treated larvae. The endocrine systems underlying the precocious metamorphosis were analyzed in the present study. Hydroprene application during the prolonged third instar after KK-42 treatment can prevent precocious metamorphosis, and the results showed dose-dependent and stage-specific effects. From analysis of the developmental changes in ecdysteroid levels in both KK-42–treated larvae and KK-42– and hydroprene-treated larvae, we conclude that changes in JH levels during the third larval instar can modify the secretion pattern of prothoracic glands and that during the next larval instar, very low ecdysteroid levels during the early stages of the presumptive last (fourth) larval instar are directly related to precocious metamorphosis. Arch. Insect Biochem. Physiol. 36:349–361, 1997. © 1997 Wiley-Liss, Inc.