利用PCR方法鉴定甲醇酵母转化子的表型

本文以含外源基因的甲醇酵母表达载体ｐＰＩＣ９／Ｅ２Ｆ－１－ＤＢ质粒ＤＮＡ电转化甲醇酵母ＧＳ１１５,小规模抽提所得转化子的总ＤＮＡ,并以其为模板,以乙醇氧化酶（ＡＯＸ１）５’端序列和３’端的ＴＴ序列为引物,进行ＰＣＲ反应。ＰＣＲ产物走０．８％Ａｇａｒｏｓｅ电泳,通过对ＰＣＲ产物的电泳带型分析,鉴定出甲醇酵母转化子的表型,即Ｍｕｔ＾＋或Ｍｕｔ＾ｓ。这一鉴定结果为转化子的诱导表达产物的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ图     

Forskolin对放射性转化细胞TGF基因及部分癌基因表达的影响

＾３Ｈ－ＴｄＲ放射性转化细胞经１×１０＾－５ｍｏｌ／Ｌ Ｆｏｓｋｏｌｉｎ处理２４ｈ后,ＴＧＦａ,ｃ－ｍｙｃ,ｃ－Ｋ－ｒａｓ基因的ｍＲＮＡ表达下降;ＴＧＦβ,ｃ－ｆｏｓ基因表达无明显变化。非转化细胞经相同条件处理,ＴＧＦａ,ＴＧＦβ,ｃ－ｍｙｃ及ｃ－Ｋ－ｒａｓ基因表达无显著改变。提示：Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ介导的转化细胞的生长抑制作用与ＴＧＦａ,ｃ－ｍｙｃ,ｃ－Ｋ－ｒａｓ基因的转录表达下降有关。     

人主动脉硫酸乙酰肝素蛋白聚糖对培养的人血管壁细胞生长的作用

通过培养的人主动脉平滑肌细胞（ｈＡＳＭＣ）及脐静脉内皮细胞（ｈＵＶＥＣ）,应用３Ｈ－ＴｄＲ参入、Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析、逆转录多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）、放射免疫分析（ＲＩＡ）、和紫外比色法等技术观察了人主动脉中硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（ＨＳＰＧ）对ｈＡＳＭＣ和ｈＵＶＥＣＤＮＡ合成的作用及对血小板源生长因子（ＰＤＧＦ）、ＰＤＧＦ受体、转化生长因子β（ＴＧＦ－β）、内皮素－１（ＥＴ－１）或碱性成纤维细胞生长因子（ｂＦＧＦ）基因表达和肾素－血管紧张系统（ＲＡＳ）的影响,结果显示,ＨＳＰＧ明显抑制培养的ｈＡＳＭＣ基础的ＤＮＡ合成（ｃｐｍ值为：１０３８５±３２６３ｖｓ,２５５４１±６４２１,Ｐ＜０．０１）及外源性ＰＤＧＦ诱导的ＤＮＡ合成（ｃｐｍ值为：９８７８±１９４７ｖｓ．１３４８１±４４ｌ０,Ｐ＜０．０５）;抑制ＰＤＧＦＡ链、ＴＧＦ－Ｂｐ和ＥＴ－１ｍＲＮＡ表达,提高ＰＤＧＦａ和β受体ｍＲＮＡ的表达;显著降低ｈＡＳＭＣ培养液中血管紧张素Ⅱ（ＡｎｇⅡ）的浓度和血管紧张素转换酶（ＡＣＥ）的活性,推测ＨＳＰＧ抑制ＰＤＧＦＡ链、ＴＧＦ－β及ＥＴ－１ｍＲＮＡ表达,降低ＡＣＥ活性及ＡｎｇⅡ浓度是其抑制ｈＡＳＭＣ增殖的重要机     

抗真菌蛋白Rs—AFPs基因在大肠杆菌中的表达

将抗真菌蛋白Ｒｓ－ＡＦＰ１和Ｒｓ－ＡＦＰ２全长ｃＤＮＡ插入表达质粒ｐＥＴ－２２ｂ／ＮｃｏＩ＋ＳａｃＩ位点,构建成融合蛋白表达载体ｐＲＡＦ１和ｐＲＡＦ２．将不含信号肽编码序列的Ｒｓ－ＡＦＰ１和Ｒｓ－ＡＦＰ２ｃＤＮＡ分别插入ｐＥＴ－２２ｂ／Ｎｃｏｌ＋Ｓａｃｌ和ｐＥＴ－２２ｂ／Ｎｄｅｌ＋ＳａｃＩ位点,构建成不含信号肽序列的融合蛋白表达载体ｐＲＡＦ３、ｐＲＡＦ４和非融合蛋白表达载体ｐＲＡＦ５和ｐＲＡＦ６．将构建的上述各种表达载体转化Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１,挑菌落培养,ＩＰＴＧ诱导,使Ｒｓ－ＡＦＰｓ基因得到表达,并用体外抑菌试验检测表达产物的活性,结果表明,各种表达载体的表达产物均具有不同程度的抑菌活性,其中,ｐＲＡＦ３和ｐＲＡＦ４表达产物的抑菌活性较明显．     

c-fos基因在内皮素-1促肺泡Ⅱ型细胞表面活性物质合成中的作用

应用反义技术探讨ｃ－ｆｏｓ基因ＥＴ－１调控肺泡Ⅱ型细胞（ＡＴⅡ）表面活性物质（ＰＳ）合成的胞内信号转导中的作用,结果显示：（１）内皮素－１（ＥＴ－１）可提高ＡＴⅡ细胞的＾３Ｈ－胆碱掺入。（２）蛋白激酶Ｃ（ＰＫＣ）激活剂ＰＭＡ可使ＡＴⅡ细胞的＾３Ｈ－胆碱掺入量增加,ＰＫＣ抑制剂Ｈ７可抑制ＥＴ－１的促ＰＳ合成效应。（３）ＥＴ－１和ＰＭＡ可显著提高Ｆｏｓ蛋白表达量,Ｈ７和ｃ－ｆｏｓ反义寡核苷酸（ＯＤＮ）     

酵母K.fragilis甘油醛—3—磷酸脱氢酶基因的克隆

根据已克隆的马克斯克鲁维酵母（Ｋ．ｍａｒｘｉａｕｓ）,乳酸克鲁维酵母（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）与酿酒酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｅｉａｅ）甘油醛－３－磷酸脱氢酶（ＧＡＰ）基因的核苷酸序列同源性分析设计ＧＡＰ探针,以该探针与脆壁克鲁维酵母（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）ＣＢＳ３９７基因文库进行原位杂交,得到一阳性克隆ｐＧ１并通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交实验得以证实。该克隆所携带的ＧＡＰ１基因的部分序列也已被测定。利用     

细胞转化过程中胞内钙离子浓度的变化

使用钙离子荧光探针Ｆｌｕｏ－３ＡＭ和ＤＮＡ荧光染料Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２联染细胞的方法,利用显微分光光度计ＭＰＶⅡ测量了两种温度敏感细胞—６Ｍ２和ｔｓＲＳＶＮＩＨ３Ｔ３－ＬＡ９０细胞及Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２和转化Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２细胞在不同细胞周期时相内钙的浓度,发现从Ｇ１期到Ｓ期到Ｇ２期,６ｍ２细胞当在３３℃培养时（转化状态）胞内钙的浓度〔Ｃａ＾２＋〕ｉ分别为８５．０,１３８．４２３９．０ｎｍｏｌ     

细胞外钙调素诱导番茄县浮细胞rbcS—3A基因表达

利用番茄（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ Ｍｉｌｌ．）县浮培养细胞为材料,以＾３２Ｐ标记的寡核苷酸（４０ｂｐ）为探针检测了细胞外钙调素对番茄细胞ｒｂｃＳ－３Ａ及ｒｂｃＳ－３Ｃ基因表达的影响。当向暗中培养的番茄悬浮细胞（第７天）中加入外源纯化钙调素（１０＾－７ｍｏｌ／Ｌ）并处理２４ｈ后,ｒｂｃＢ－３Ａ基因的表达明显增加,而相同深度的Ｓ－１００蛋白和ＢＳＡ则没有作用。加入外源钙调素（１     

环腺苷一磷酸对人Ⅰ型17β羟类固醇脱氢酶在绒癌细胞系中表达的调节作用

由Ｈ ＳＤ１７Ｂ１基因编码的人Ⅰ型１７β－羟类固醇脱氢酶（１７β－ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｔｙｐｅ１简称Ⅰ型１７ＨＳＤ）催化雌酮与雌二醇之间的转化。本文研究环腺苷一磷酸简化（ｃＡＭＰ）对该酶在培养的绒癌胞系（ＪＡＲ和ＪＥＧ－３）中表达的调节作用。用８－ｂｒｏｍｏ－ｃＡＭＰ处理两种绒癌细胞后,观察到在伴随１．３ｋｂⅠ型１７ＨＳＤｍＲＮＡ表达的同时,Ｉ型１７ＨＳＤ蛋白浓度     

碱性成纤维细胞生长因子对大鼠肾小球系膜细胞原癌基因c-fos和c-myc表达的影响

在建立大鼠肾小球系膜细胞（ＭＣ）体外培养方法的基础上,通过３Ｈ－ＴｄＲ参入实验,ＲＮＡ印迹分析和斑点杂交观察ｂＦＧＦ对ＭＣＤＮＡ合成及原癌基因ｃ－ｆｏｓ和ｃ－ｍｙｃ表达的影响．结果表明,ｂＦＧＦ作用于ＭＣ１８ｈ,ＭＣ的３Ｈ－ＴｄＲ参入率明显增加（Ｐ＜０．０５）,２４ｈ达到高峰（Ｐ＜０．０１）;ｂＦＧＦ显著诱导原癌基因ｃ－ｆｏｓ和ｃ－ｍｙｃ表达,其表达活性分别于３０ｍｉｎ和１ｈ达到高峰．提示ｂＦＧＦ是ＭＣ的强效丝裂原,其对ＭＣＤＮＡ合成的促进作用与诱导原癌基因ｃ－ｆｏｓ和ｃ－ｍｙｃ表达有关．     

Screening of human vascular endothelial growth factor (VEGF) receptor Flt-1 domain and study on its biological activity

Four human vascular endothelial growth factor receptor Flt-1 cDNA fragments containing extracellular domain loops 2, 1-2, 2-3 and 1-3 respectively were amplified from human placen-tal cDNA library by PCR and used for screening ligand binding domains by yeast two-hybrid system. The result showed that, not only loop 1-3, but also the smaller fragment loop 2-3 could bind to hVEGF165. Recombinant expression plasmids pPIC9K/Flt-1(1-3) and pPIC9K/Flt-1 (2-3) were constructed and transformed to Pichia. pastoris host strain GS115, cultured in flasks, and expressed under the induction of 1 % methanol. The expressed product existed in supernatant in the form of soluble molecules and contained more than 60% of total protein after being induced for 4d. After being purified by CM-Sepharose FF and Sephacryl S-100 chromatography, its purity reached above 90%. Biological assay in vitro showed that the binding capacity of expressed soluble Flt-1 (2-3) to hVEGF165 and its inhibiting effect on the proliferation of human um     

Screening of human vascular endothelial growth factor (VEGF) receptor Flt-1 domain and study on its biological activity

Four human vascular endothelial growth factor receptor Flt-1 cDNA fragments containing extracellular domain loops 2, 1–2, 2–3 and 1–3 respectively were amplified from human placental cDNA library by PCR and used for screening ligand binding domains by yeast two-hybrid system. The result showed that, not only loop 1–3, but also the smaller fragment loop 2–3 could bind to hVEGF₁₆₅. Recombinant expression plasmids pPIC9K/Flt-1(1–3) and pPIC9K/Flt-1(2–3) were constructed and transformed toPichia. pastoris host strain GS115, cultured in flasks, and expressed under the induction of 1% methanol. The expressed product existed in supernatant in the form of soluble molecules and contained more than 60% of total protein after being induced for 4d. After being purified by CM-Sepharose FF and Sephacryl S-100 chromatography, its purity reached above 90%. Biological assayin vitro showed that the binding capacity of expressed soluble Flt-1 (2–3) to hVEGF₁₆₅ and its inhibiting effect on the proliferation of human umbilical veins endothelial cells (HUVEC) stimulated with hVEGF₁₆₅ were close to those of sFlt-1(1–3). Animal test showed that sFlt-1(2–3) could inhibit the formation of regenerate blood vessels stimulated with hVEGF₁₆₅ significantly.     

香菇菌C91-3凋亡相关蛋白24414在毕赤酵母GS115中的表达与鉴定

目的通过构建毕赤酵母表达载体将香菇菌C91-3凋亡相关蛋白24414在毕赤酵母GS115中进行表达,同时对表达产物进行鉴定。方法从香菇菌C91-3菌丝体中提取总RNA,根据转录组测序结果,用3＇-Full RACE、5＇-Full RACE方法获得24414基因,并将其克隆到毕赤酵母的表达载体pPIC9K中,构建真核重组表达质粒pPIC9K-24414。用电转化的方法将此质粒转化到毕赤酵母GS115中并进行诱导表达,对表达产物用Westen-blot方法进行鉴定。结果通过菌落PCR和基因序列分析确定插入pPIC9K中的片段为24414基因片段,通过Westen-blot方法确定所表达蛋白为目的蛋白。结论重组质粒pPIC9K-24414成功构建,目的凋亡相关蛋白24414在毕赤酵母GS115中成功表达,为进一步研究香菇菌C91-3凋亡相关蛋白24414的生物学功能奠定了基础。     

Flt-1 in colorectal cancer cells is required for the tumor invasive effect of placental growth factor through a p38-MMP9 pathway

Background

Placenta growth factor (PlGF), a dimeric glycoprotein with 53% homology to VEGF, binds to VEGF receptor-1 (Flt-1), but not to VEGF receptor-2 (Flk-1), and may function by modulating VEGF activity. We previously have showed that PlGF displays prognostic value in colorectal cancer (CRC) but the mechanism remains elucidated.

Results

Overexpression of PlGF increased the invasive/migration ability and decreased apoptosis in CRC cells showing Flt-1 expression. Increased migration was associated with increasing MMP9 via p38 MAPK activation. Tumors grew faster, larger; with higher vascularity from PlGF over-expression cells in xenograft assay. In two independent human CRC tissue cohorts, PlGF, MMP9, and Flt-1 expressions were higher in the advanced than the localized disease group. PlGF expression correlated with MMP9, and Flt-1 expression. CRC patients with high PlGF and high Flt-1 expression in tissue had poor prognosis.

Conclusion

PlGF/Flt-1 signaling plays an important role in CRC progression, blocking PlGF/Flt-1 signaling maybe an alternative therapy for CRC.     

人甲状旁腺激素(1-34)二联体与人血清白蛋白融合蛋白的构建及表达

构建人甲状旁腺激素(1-34)二联体与人血清白蛋白融合蛋白的表达载体,并表达得到该融合蛋白.通过设计强特异性的引物,利用重叠PCR技术,定向定量的拼接得到hPTH(1-34)二联体-HSA融合蛋白的基因;将构建好的融合基因插入表达载体pPIC9K,大量扩增重组质粒,并用Sal I线性化,电击转化毕赤酵母GS115,经组氨酸缺陷和G418抗性双重筛选得到阳性转化子;挑选阳性转化子进行甲醇诱导表达.测序结果表明得到的重组质粒pPIC9K-hPTH(1-34)二联体-HSA与目标设计完全一致;基因组PCR鉴定结果证明成功构建了hPTH(1-34)二联体-HSA融合基因的毕赤酵母(GS115)表达系统;SDS-PAGE电泳表明融合蛋白获得了表达,尿微量白蛋白试剂盒测定甲醇诱导表达3d后融合蛋白的产量为127 mg/L.     

灰葡萄孢菌激发子pebC1在毕赤酵母中的分泌表达及其生物活性分析

为了实现激发子PebC1编码基因在毕赤酵母中的分泌表达,采用PCR方法从灰葡萄孢菌BC-4-2-2-1菌株中扩增获得激发子PebC1的编码序列,将其亚克隆至酵母分泌型表达载体pPIC9K中,以此片段构建了pPIC9K-pebC1重组表达质粒。重组表达质粒经Bgl Ⅱ线性化处理,电击转化至毕赤酵母宿主菌GS115,经MD、G418-YPD平板和PCR法筛选,获得了重组毕赤酵母菌GS115/pPIC9K-pebC1。用甲醇诱导重组酵母菌表达目标蛋白,发酵液经SDS-PAGE电泳分析,在约39 kDa处出现特异目标条带。Western blotting检测结果说明,重组表达产物具有良好的抗原性。生物活性检测表明,酵母重组表达蛋白PebC1能够诱导拟南芥和黄瓜幼苗对灰霉病的抗性。     

用GAP启动子在毕节酵母中组成型表达人血管抑制素

为探索用GAP启动子(PGAP)取代AOX1启动子(PAOX1),在毕节酵母(P．pastortis)中组成型表达外源蛋白的可能性,应用PCR方法从P．pastoris染色体中扩增了GAP启动子,以其取代诱导型表达载体pPIC9K上的PAOX1,构建了组成型表达载体pGAP9K。将人血管抑制素(AS)基因重组于pGAP9K的多克隆位点,获得含As基因的重组质粒pGAP9K-AS。转化P．pastorisGSll5,对获得的高拷贝转化子P．pastorisGSll5(pGAP9K-AS)进行组成型表达,同时以诱导型转化子P．pastoris GSll5(pPIC9K-AS)作为对照。SDS-PAGE结果显示：组成型转化子于培养4d后AS的表达水平已达到高峰,分泌量为58mg／L;而诱导型转化子诱导4d后表达的AS仅是组成型表达的70％,诱导6d后达到高峰,表达量也只是组成型表达系统表达高峰时(4d)的86％。CAM分析和抗癌实验结果显示：P．pastortis GS115(pGA．P9K-S)和P．pastoris GS115(pPIC9K-AS)表达的AS均具有抑制血管生成和C57BL／6J实验小鼠的B16黑色素瘤的生长,其平均瘤重抑制率分别达到90．61％和90．54％。以上结果表明,以GAP启动子构建的组成型表达系统具有发酵时间较短、表达水平较高、不用甲醇诱导、操作系统比较简单等优点,PGAP可以取代PAOX1在P．pastoris中表达AS及其他外源蛋白。     

辣根过氧化物酶同功酶C3基因在毕赤酵母中的表达

目的：克隆与表达辣根过氧化物酶同功酶C3（HRPC3）基因。方法：用PCR方法从辣根的总DNA中,扩增得到一种辣根过氧化物酶同功酶C3基因,将PCR产物连接到pMD18-T载体上,测序证明正确后,再将目的基因正确插入到巴斯德毕赤酶母表达载体pPIC9K中,含有目的基因的重组pPIC9K质粒在毕赤酶母中进行表达与分析。结果：应用毕赤酶母作为受体菌,成功表达了HRPC3基因,其活性为56IU/L。结论：毕赤酶母直接表达出了具有生物活性的辣根过氧化物酶同功酶C3。     

人纤溶酶原K1-3基因的克隆、表达和产物的纯化及抗癌活性分析

纤溶酶原K1－3功能区是近年发现的血管生成抑制因子,具有抑制肿瘤生长和转移的活性。以人血管生成抑制素cDNA为模板用PCR技术扩增了K1－3功能区的基因,DNA序列分析后克隆至质粒pPIC9上获得重组质粒pPIC9K13转化毕节酵母GS115,用PCR和G418法筛选高拷贝转化子,进行摇瓶发酵。SDS－PAGE和Western blot分析结果证实K1－3基因已在GS115分泌表达,并具有免疫活性。选用30L和80L罐进行高密度发酵,甲醇诱导48h细胞密度达到OD250－300,比摇瓶提高5－6倍,表达量150－200mg/L,发酵上清液经Streamline SP离子交换及Phenyl-Sephorose疏水层析纯化,在SDS－PAGE上显示一条带,纯度96％,动物实验证明纯化产物具有抗血管生成和抗肿瘤的活性。     

中性纤维素酶外切葡聚糖酶CBHⅡ的异源表达

利用聚合酶链式反应（PCR）技术,从本实验室保存的1株特异腐质霉EIM-50上克隆到中性纤维素酶外切葡聚糖酶基因（CBHⅡ）全长序列,大小约为1 586 bp。将其克隆到pPIC9K上,成功构建重组质粒pPIC9K-CBHⅡ,并经电转化引入毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115,进行异源表达。SDS-PAGE银染结果表明,该重组质粒在毕赤酵母中获得了异源表达。gel pro Analyser软件分析其表达蛋白的表观分子量约为62.548ku。用BandScan软件分析其蛋白表达量为2.3%,即0.738μg/mL（mg/L）。