蛋白质组学在水稻与微生物互作研究中的应用

应用蛋白质组学方法揭示植物与微生物的互作机制是当前植物病理学研究的热点之一。结合水稻感染水稻条纹病毒后的蛋白质组学分析经验,综述了蛋白质组学在水稻与微生物互作研究中的应用,包括水稻与真菌、细菌、病毒互作的蛋白组学和突变体蛋白质组学。在总结研究现状的基础上,提出了水稻与微生物互作的蛋白质组学研究中存在的问题,并对该领域的发展前景进行展望。     

运用代谢组学研究RSV与水稻的互作初探

水稻条纹叶枯病严重威胁着我国的水稻生产,该病由水稻条纹病毒（Rice stripe virus,RSV）引起。目前,对水稻与RSV互作机制的认识还较少,这是制定有效措施来对RSV进行防控的一大障碍。代谢组学是新近发展起来的一种研究手段,它通过考察生物体系包括细胞、组织或整个生物体在受到刺激或扰动后,在代谢水平上的应答,来研究一系列的生物现象。运用代谢组学对水稻与RSV的互作进行了初步探索。GC-MS分析表明,RSV的侵染能显著影响水稻的代谢谱,且在代谢组水平上,不同抗感性的水稻对RSV的响应存在着差异。与NIST质谱数据库中的信息比较,从武育粳3号健康植株中鉴定到内源性代谢物12种、武育粳3号发病植株中11种、KT95-418健康植株中9种、KT95-418发病植株中14种。     

利用酵母双杂交系统研究植物与病毒蛋白相互作用的进展

在长期进化中,植物形成了抵御病毒等病原微生物侵染的精细防御系统。在病毒侵染、复制和传播过程中,其编码的一些蛋白,如外壳蛋白、运动蛋白、复制酶类等能够与植物基因编码的蛋白发生相互作用。酵母双杂交系统是体外研究蛋白质间相互作用的有利工具,不但可以用于研究已知蛋白质的互作,还可以发现新蛋白,揭示特定蛋白互作网络与作用机制,在植物蛋白与病毒蛋白互作研究中已得到广泛的利用。本文主要综述利用酵母双杂交系统研究植物与病毒蛋白相互作用的国内外进展。     

水稻条纹叶枯病的研究进展

水稻条纹叶枯病对水稻生产造成了广泛而严重的危害。水稻条纹叶枯病毒（RSV）是致病的元凶,而灰飞虱是传播者。RSV在植物体内能形成核糖核蛋白体（RNP）及内含体,但不形成病毒颗粒。每个RNP只含一种RNA。RSV的全基因组由4条单链RNA组成,编码7种蛋白,它们的具体功能正被逐渐阐明。目前对于RSV的致病机制和植物的抗病机制的研究也取得了进展。     

水稻条纹病毒胁迫下的水稻全基因组表达谱

水稻条纹叶枯病由水稻条纹病毒(Rice stripe virus, RSV)引起,对我国水稻生产危害严重.为了明确RSV侵染对水稻基因表达谱的影响,采用Affymetrix水稻全基因组芯片对RSV接种后出现条纹症状第7天的武育粳3号水稻病叶和相应的健康叶片进行了全基因组表达谱分析,得到3 517个差异基因,其中2 002个表达上调,1 515个表达下调.根据TIGR数据库注释(http://www.tigr.org/tdb/e2k1/osa1/)和MIPS基因功能分类标准(http://mips.gsf.de/projects/funcat)将差异基因归类为15个功能类别,多数差异基因与植物防御、信号传导及蛋白质、碳水化合物的代谢相关,一些转录因子的表达也发生了明显的变化.代谢途径分析表明,RSV侵染后磷酸戊糖途径、类黄酮合成途径和芸苔素合成途径的相关基因表达明显增强,赤霉素合成途径相关基因的表达受到了抑制.     

番茄环纹斑点病毒与马铃薯Y病毒复合侵染烟草的细胞病理特征

在自然情况下, 番茄环纹斑点病毒(TZSV)和马铃薯Y病毒(PVY)通常复合侵染同一植株。该文首次报道了TZSV和PVY复合侵染烟草(Nicotiana sp.)植株的细胞病理特征, 并与单独侵染进行了比较分析。复合侵染的烟草植株细胞中, TZSV病毒颗粒明显增多, 并聚集于囊膜内形成包涵体, 与PVY的风轮状及片层状内含体和病毒颗粒聚集体交叉分布于细胞质(内含线粒体明显增多)中, 线粒体、叶绿体和细胞核结构较完整; 两种病毒的颗粒、包涵体和内含体数量均较单一侵染增多, 且对寄主亚细胞结构的破坏较单一侵染为轻, TZSV和PVY及其与寄主的互作可能存在协生作用。     

植物病毒在细胞间转运的机理探讨

植物病毒在寄主体内的移动包括细胞间转运和系统性转运两个部分。在这两个过程中,如何有效地利用和修饰胞间连丝,是病毒成功侵染的关键。病毒通过编码运动蛋白与寄主因子互作靶定于细胞质膜,然后通过一系列复杂机制修饰胞间连丝从而顺利完成细胞间转运。综述了植物病毒在细胞间转运过程中与寄主发生的一系列互作,着重阐述了病毒与胞间连丝之间互作的机制,旨在为相关研究工作提供参考。     

第二代测序技术用于水稻和稻瘟菌互作早期转录组的分析

稻瘟菌为了实现对水稻的有效侵染,在侵染水稻时可能通过表达和转运一定数量的效应蛋白进入到水稻细胞,抑制和干扰水稻的先天免疫机制。文章利用Solexa第二代测序技术,通过开展水稻和稻瘟菌互作早期转录组的测定和分析,克隆和鉴定在互作早期表达的稻瘟菌效应蛋白基因。利用序列同源比对,我们从总计约12.5 M条序列标签中,分离和鉴定了338 942条来源于稻瘟菌的序列,并最终定位到779个稻瘟菌预测基因。其中108个基因很可能参与了水稻和稻瘟菌互作过程,42个基因为预测的分泌蛋白基因。通过RT-PCR分析,最终确认了42个预测分泌蛋白基因中有12个基因在侵染水稻早期有显著的表达,而其中有4个基因表现为侵染早期特异表达。文章尝试利用第二代测序技术实现稻瘟菌侵染早期特异表达基因,尤其是分泌蛋白基因的快速克隆和鉴定,为稻瘟菌效应蛋白基因的克隆和功能鉴定提供了较为有意义的探索。     

禽传染性支气管炎病毒Nsp2蛋白与宿主蛋白eIF2α的互作鉴定

Nsp2蛋白是冠状病毒的非结构蛋白,在病毒早期感染中具有重要作用。【目的】为初步筛选可能与禽传染性支气管炎病毒(avian infectious bronchitis virus,IBV) Nsp2蛋白互作的宿主蛋白,鉴定Nsp2蛋白与真核翻译起始因子2α亚基(eIF2α)的相互作用。【方法】以pCAGGs-Flag-Nsp2和pCAGGs-Flag载体转染后的鸡胚肾(CEK)细胞为研究对象,利用免疫共沉淀(Co-IP)和液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)技术筛选出可能与IBVNsp2蛋白发生互作的宿主蛋白eIF2α,通过免疫共沉淀和间接免疫荧光试验进一步验证二者相互作用。【结果】经免疫共沉淀与质谱分析后筛选到97个可能与Nsp2蛋白互作的宿主蛋白,其中宿主抗病毒反应的关键蛋白eIF2α与Nsp2蛋白的相互作用通过免疫共沉淀和间接免疫荧光试验,表明二者存在直接互作关系,并共定位于细胞质中;此外,Nsp2蛋白表达和IBV感染都能显著提高宿主内源性eIF2α的转录水平。【结论】利用免疫共沉淀联合质谱技术筛选到CEK细胞中存在的97种可能与IBV Nsp2互作的候选蛋白,利用免疫共沉淀与...     

非洲猪瘟病毒内囊膜蛋白p17与宿主互作蛋白的初步鉴定

非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的感染导致猪的死亡率高达100%,给养猪业造成毁灭性灾难。因此,开展针对ASFV感染复制的研究有着重大的意义。目前发现ASFV有超过150个开放阅读框,其中D117L基因编码的内囊膜蛋白p17参与病毒二十面体结构的形成,但是对p17调控宿主细胞功能的机制知之甚少。研究通过免疫沉淀技术联合蛋白质谱分析,初步筛选出与ASFV p17潜在的宿主互作蛋白。通过进一步免疫共沉淀技术和激光共聚焦实验确认了p17与线粒体外膜蛋白TOMM70(translocase of outer mitochondrial membrane 70)、热休克蛋白HSPA8(heat shock 70 kDa protein 8)的互作。该研究为进一步探索p17在ASFV感染过程中的功能提供了重要信息。     

Glutamate Receptor-interacting Protein 1 Protein Binds to the Microtubule-associated Protein

To identify the interaction proteins for the α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionate (AMPA) receptor subunit glutamate receptor-interacting protein 1 (GRIP1), GRIP1 interactions with microtubule-associated protein (MAP)-1B light chain (LC) were investigated. GRIP1 interacts with MAP-1A and MAP-1B in the yeast two-hybrid assay, as is indicated also by glutathione S-transferase (GST) pull-down and coimmunoprecipitation with MAP-1B LC antibody in brain fractions. These results suggest a novel mechanism for localizing AMPA receptors to synaptic sites.     

植物磷胁迫蛋白和铁胁迫蛋白研究进展

综述了近十年来国内外有关研究植物磷胁迫蛋白和铁胁迫蛋白的文献。着重阐述了磷胁迫和铁胁迫条件下的植物蛋白质变化,如新的蛋白和新的多肽的特异产生,以及相关的分子生物学进展。     

植物磷胁迫蛋白和铁胁迫蛋白研究进展

综述了近十年来国内外有关研究植物磷胁迫蛋白和铁胁迫蛋白的文献,着重阐述了磷胁迫和铁胁迫条件下的植物蛋白质变化,如新的蛋白和新的多肽的特异产生,以及相关的分子生物学进展。     

运动神经元生存蛋白SMN与Sm蛋白的结合作用

脊髓性肌萎缩症（spinal muscular atrophy,SMA）是一类与运动神经元存活基因（survival of motor neurons gene,SMN gene）突变有关的神经系统变性疾病,而SMN基因的转录产物即为SMN蛋白（survival of motorneurons protein,SMN protein）。SMN蛋白与多种蛋白结合后发挥作用,如SMN-Sm蛋白的相互作用在富含尿嘧啶的小核核糖核蛋白体（uridine—richsmallribonucleo—proteins,UsnRNPs）转运装配中有重要意义。SMN蛋白是通过其Tudor结构域与剪接体sm蛋白的二甲基化修饰的富含精氨酸一氨基乙酸域（ar—ginineandglycine—rich,RG）结合。     

丝裂原活化蛋白激酶激活蛋白激酶(MK)研究进展

丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路介导多种重要的细胞生理反应.对下游蛋白激酶的磷酸化是MAPK家族成员发挥生理作用的重要方式.在MAPK的下游存在3个结构上相关的MAPK激活蛋白激酶(MAPKAPKorMK),即MK2,MK3和MK5.在被MAPK激活后,MK可将信号传递至细胞内不同靶标,从而在转录和翻译水平调节基因表达,调控细胞骨架和细胞周期,介导细胞迁移和胚胎发育.最近,在基因敲除研究的基础上,不同MK亚族成员之间的功能区分已经逐渐明晰,使我们对于MK的认识有了长足的进步.     

规模化蛋白质相互作用的研究技术

蛋白质相互作用既是蛋白质执行功能的主要方式,也是细胞功能调控网络的结构基础。蛋白质间异常的相互作用及其连锁网络的紊乱是引起许多病理改变的原因。作为功能基因组和蛋白质组研究的重要内容,规模化蛋白质相互作用研究已成为近年国际上研究的热点之一。文章综述了当前规模化蛋白质相互作用研究中的常用技术和常用蛋白质相互作用数据库,研究者可根据研究需要和技术特点利用这些资源。     

Protein Solubility and Protein Homeostasis: A Generic View of Protein Misfolding Disorders

According to the “generic view” of protein aggregation, the ability to self-assemble into stable and highly organized structures such as amyloid fibrils is not an unusual feature exhibited by a small group of peptides and proteins with special sequence or structural properties, but rather a property shared by most proteins. At the same time, through a wide variety of techniques, many of which were originally devised for applications in other disciplines, it has also been established that the maintenance of proteins in a soluble state is a fundamental aspect of protein homeostasis. Taken together, these advances offer a unified framework for understanding the molecular basis of protein aggregation and for the rational development of therapeutic strategies based on the biological and chemical regulation of protein solubility.Virtually every complex biochemical process taking place in living cells depends on the ability of the molecules involved to self-assemble into functional structures (Dobson 2003; Robinson et al. 2007; Russel et al. 2009), and a sophisticated quality control system is responsible for regulating the reactions leading to this organization within the cellular environment (Dobson 2003; Balch et al. 2008; Hartl and Hayer-Hartl 2009; Powers et al. 2009; Vendruscolo and Dobson 2009). Proteins are the molecules that are essential for enabling, regulating, and controlling almost all the tasks necessary to maintain such a balance. To function, the majority of our proteins need to fold into specific three-dimensional structures following their biosynthesis in the ribosome (Hartl and Hayer-Hartl 2002). The wide variety of highly specific structures that results from protein folding, and which serve to bring key functional groups into close proximity, has enabled living systems to develop an astonishing diversity and selectivity in their underlying chemical processes by using a common set of just 20 basic molecular components, the amino acids (Dobson 2003). Given the central importance of protein folding, it is not surprising that the failure of proteins to fold correctly, or to remain correctly folded, is at the origin of a wide variety of pathological conditions, including late-onset diabetes, cystic fibrosis, and Alzheimer’s and Parkinson’s diseases (Dobson 2003; Chiti and Dobson 2006; Haass and Selkoe 2007). In many of these disorders proteins self-assemble in an aberrant manner into large molecular aggregates, notably amyloid fibrils (Chiti and Dobson 2006; Ramirez-Alvarado et al. 2010).     

p53相关蛋白激酶结合蛋白CGI-121

利用酵母双杂交技术从人的睾丸cDNA文库中鉴定得到p53相关蛋白激酶(PRPK)结合蛋白CGI-121,体外实验表明,重组CGI-121能抑制PRPK磷酸化p53第15位的Ser,未磷酸化p53进入泛素蛋白酶体途径,导致细胞增殖或肿瘤发生;然而,体内过表达CGI-121并没有显著的抑制PRPK磷酸化p53.Michael Downey等在研究cdcl3基因缺陷型酿酒酵母中筛选得到cdcl3-1突变体的抑制基因CGI-121,CGI-121是真核生物一个新的保守复合物--KEOPS复合物组成之一.KEOPS复合物具有促进端粒延伸和使端粒拆开的功能.CGI-121突变体在热敏感cdcl3-1酵母突变株中可以减少ssDNA的积累和缩短端粒;同时,在端粒功能异常芽殖酵母中CGI-121和piD261/Bud32促进端粒的拆开.然而,基因调控自身表达的机制以及在PRPK信号途径和KEOPS复合物中的扮演的角色有待于进一步研究.     

绿色荧光蛋白在蛋白质研究中的应用

绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）自发现以来,由于具有自发荧光等特性,在分子生物学和细胞生物学领域得到广泛应用。GFP作为一种报道分子,在研究蛋白质相互作用和构象变化、检测蛋白质表达、蛋白质和细胞荧光示踪中,起到了重要的作用。该文通过对绿色荧光蛋白特性的分析．介绍其作为荧光标记在蛋白质研究中的应用,并展望进一步的研究前景。     

Protein quantification

Protein quantification is an integral part of any investigation related to protein isolation, purification, characterization, and analysis. Although the methods considered in this lecture have multi-year history and applied widely in the laboratory practice, there are some crucial points, which must be taken into consideration while choosing the method permitting reliably and with a high specificity and reproducibility to quantify protein.