大鼠肺动脉平滑肌培养细胞内Ca~(2+)反应的多样性

用Ｃａ２＋荧光色素Ｆｌｏｕ－３／ＡＭ负荷原代培养的大鼠肺动脉平滑肌细胞,在共聚焦激光显微镜下观察细胞内Ｃａ２＋对各种缩血管物质反应的非均一性。实验结果提示：各种Ｃａ２＋通道的反应与细胞培养时间相关。８０％以上的Ｃａ２＋贮库具有ＣＩＣＲＣａ２＋通道,在肺血管管平滑肌细胞可能存在一种只具有ＣＩＣＲ通道的Ｃａ２＋贮库,ＣＩＣＲ的Ｃａ２＋释放作用强于ＩＣＲＣａ２＋通道     

肝素通过增加细胞周期抑制因子p27 减轻大鼠低氧性肺动脉高压

目的:研究肝素防治大鼠低氧性肺动脉高压的作用机制。方法:复制慢性低氧性肺动脉高压大鼠模型,将大鼠分为常氧对照组(Hypoxia),常氧加肝素组(Normoxia+H),缺氧模型组(Hypoxia)及缺氧加肝素组(Hypoxia+H)共四组。待模型复制完毕后,测定大鼠RVPSP和RV/LV+S,然后进行组织病理分析,测定MA%和MT%以确定肺动脉高压的程度。利用Western-blot实验与RT-PCR实验检测肺动脉中p27蛋白水平及RNA水平的变化。结果:慢性低氧显著增加了大鼠RVPSP、RV/LV+S、MA%和MT%,引起了大鼠肺动脉压力的增高、右心室肥厚和肺中小动脉的中膜增厚及外膜增生,肝素的使用减轻了慢性缺氧条件下大鼠的RVPSP和RV/LV+S,降低了MA%和MT%,有效降低了肺动脉高压、右心室肥厚,并减轻了肺中小动脉的中膜增厚和外膜增生。Western-blot实验发现使用肝素的缺氧组大鼠肺动脉中p27蛋白表达增加,而RT-PCR实验发现p27的转录水平变化不显著。结论:结果显示肝素可能通过增加p27的表达,从而抑制肺动脉平滑肌细胞的增殖,减轻了肺动脉血管的狭窄及降低了肺动脉高压。     

氯化钴诱导低氧与气体低氧对大鼠原代肺动脉平滑肌细胞增殖作用的比较研究

该研究比较了氯化钴(cobalt chloride, CoCl₂)诱导低氧与气体低氧对大鼠原代肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells, PASMCs)增殖及氧化应激的影响。采用不同剂量(25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、400μmol/L) CoCl₂诱导细胞或将细胞置于低氧培养箱中,通过MTT、CCK-8和EdU检测比较CoCl₂诱导低氧与气体低氧对大鼠原代PASMCs增殖的影响,并通过Western blot、流式细胞术比较CoCl₂诱导低氧与气体低氧对低氧敏感蛋白低氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)表达量和细胞内活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)含量的影响。结果显示,CoCl₂或气体低氧刺激细胞24 h均可增加PASMCs增殖活力、HIF-1α蛋白表达量和ROS含量。气体低氧下PASMCs增殖活力显著...     

低氧对培养的不同内径的肺动脉平滑肌细胞增殖的影响

目的和方法：分离培养三种不同内径的肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）,用^3H－TdR掺入速率和细胞计数作为细胞增殖的指标,观察低氧对其增殖作用的影响。结果：低氧对三种不同内径的PASMCs（内径分别为＞1000μm、500－800μm、300-400μm）增殖促进作用显著不同,其^3H－TdR掺入速率和细胞计数分别增加23.5％和11.1％、60.0％和33.8％、141.4％和52.0％,选择对低氧最敏感的PASMCs（内径为300－400μm）,进一步探讨低氧促PASMCs增殖作用的细胞机制：钙拮抗剂verapail、蛋白激酶C抑制剂staurosporine(Stau)和细胞Na-H交换抑制剂amiloride可显著降低低氧情况下PASMCs^3H－TdR掺入速率和细胞计数。结论：低氧对三种不同内径的PASMCs增殖促进作用显著不同; Ca^2 、蛋白激酶C和Na^2 －H^ 交换的激活,可能是低氧促PASMCs增殖的重要胞内信息转导机制。     

低氧诱导因子与低氧性肺动脉高压发病机制的研究进展

低氧性肺动脉高压(HPH)是慢性肺源性心脏病和慢性高原病等发病的重要病理生理变化之一,其特点主要是以低氧性肺血管收缩反应增强和肺小动脉中层平滑肌细胞的异常增生(重建)为主。虽然HPH的发病机制仍不清楚,但近来研究表明内皮素(ET)、血管内皮生长因子(VEGF)、促红细胞生成素(Epo)和一氧化氮(NO)是HPH的重要致病因子。它们可在低氧诱导因子—1(HIF—1α)介导或在增加的血流切应力和氧应激反应刺激下产生,并发挥相应的作用。本文将对HIF在低氧性肺动脉高压发病中的重要作用及其进展作一简要概述。     

ET—1,NO和缺氧对肺动脉平滑肌细胞钙内流及胶原合成的影响

肺血管平滑肌细胞是肺血管收缩反应的主要执行者,也是肺血管结构重建的重要参与者。本研究观察了内皮素－１（ＥＴ－１）一氧化氮（ＮＯ）和缺氧对培养的新生小牛肺动脉平滑肌细胞（ＰＡＳＭＣ）钙内流以及胶原合成的影响,结果表明ＥＴ－１和缺氧可促进ＰＡＳＭＣ的钙内流;ＮＯ供应剂硝普钠（ＳＭＰ）可抑制ＥＴ－１诱导的钙内流,其作用呈剂量依赖性,ＳＮＰ还可以剂量依赖地抑制了ＰＡＳＭＣ的胶原合成,而缺氧可促进ＰＡＳＭＣ     

5-HD对慢性低氧肺动脉高压大鼠肺动脉平滑肌PKC-α表达的作用

目的：研究线粒体ATP敏感钾通道（mitoKATP）抑制剂5-羟基癸酸盐（5-HD）对慢性低氧肺动脉高压大鼠的影响及其潜在机制。方法：雄性sD大鼠48只,随机分成4组（n=12）：①正常对照组;②慢性低氧组;③慢性低氧＋5-HD组;④慢性低氧＋Diazoxide（mitoKATP开放剂）组;除正常对照组外,其余3组置于氧舱内（氧浓度10％±0．3％）,每天低氧8h,并接受不同的干预,共4周。干预结束后右心导管法测各大鼠肺动脉压,RT-PCR和Western blot检测各组大鼠肺动脉PKC—α蛋白和mRNA的表达。结果：①慢性低氧组肺动脉压显著高于正常组（P〈0．01）,同时慢性低氧＋Diazoxide组与慢性低氧＋5．HD组肺动脉压较慢性低氧组显著减低（P〈0．01）。②慢性低氧组PKC—α蛋白及mRNA的相对表达显著高于正常组（P〈0．05）。结论：5-HD对慢性低氧肺动脉高压起保护作用,其机制可能是抑制线粒体ATP敏感钾通道。     

5-HD对慢性低氧肺动脉高压大鼠肺动脉平滑肌PKC-ɑ表达的作用

目的:研究线粒体ATP敏感钾通道(mitoKATP)抑制剂5-羟基癸酸盐(5-HD)对慢性低氧肺动脉高压大鼠的影响及其潜在机制。方法:雄性SD大鼠48只,随机分成4组(n=12):①正常对照组;②慢性低氧组;③慢性低氧+5-HD组;④慢性低氧+Diazoxide(mitoKATP开放剂)组;除正常对照组外,其余3组置于氧舱内(氧浓度10%±0.3%),每天低氧8 h,并接受不同的干预,共4周。干预结束后右心导管法测各大鼠肺动脉压,RT-PCR和Westernblot检测各组大鼠肺动脉PKC-ɑ蛋白和mRNA的表达。结果:①慢性低氧组肺动脉压显著高于正常组(P<0.01),同时慢性低氧+Diazoxide组与慢性低氧+5-HD组肺动脉压较慢性低氧组显著减低(P<0.01)。②慢性低氧组PKC-ɑ蛋白及mRNA的相对表达显著高于正常组(P<0.05)。结论:5-HD对慢性低氧肺动脉高压起保护作用,其机制可能是抑制线粒体ATP敏感钾通道。     

大鼠细小肺动脉平滑肌细胞原代培养和鉴定方法的研究

目的：建立一种重复性好、培养周期短及传代次数多的大鼠细小肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）培养方法。方法：在无菌条件下,分离雄性SD大鼠肺细小动脉,剥离外膜和剔除内皮细胞,经胶原酶I消化,培养PASMCs。0.4%台盼蓝染色测定细胞活力;倒置相差显微镜观察;免疫细胞化学法和免疫荧光染色法,进行平滑肌α-肌动蛋白（α-SMactin）鉴定。结果：形态学观察、免疫细胞化学法及免疫荧光染色法鉴定表明培养细胞为PASMCs;细胞存活率在96.5%以上;原代培养后4～7d即可传代,并且生长特点、细胞形态不易发生改变。结论：采用胶原酶I消化法培养PASMCs,方法简单、酶消化时间易控制、培养周期短、重复性好,培养的原代PASMCs具有数量多和生长迅速的特点。     

出、入肺血中ET-1、VEGF含量与慢性低氧性肺动脉高压的相关性研究

目的：观察间断性减压低氧大鼠出、入肺血血浆、肺组织匀浆和体循环动脉匀浆中内皮素-1（ET-1）的含量变化,以及出、入肺血血清中血管内皮生长因子（VEGF）的含量变化及其与低氧性肺动脉高压的关系。方法：建立间断性减压低氧模型,采用插管法分别测定左侧颈总动脉压力（CAP）、右心室平均压分别代表体循环压力和平均肺动脉压力（mPAP）,放射免疫测定法测定ET-1含量,双抗体夹心ABC—ELISA法测定VEGF含量。结果：①低氧2周组（H2）、低氧3周组（H3）大鼠平均肺动脉压力、右心肥厚指数（RV／LV＋S）均分别显著高于对照组,而各组平均颈动脉压力之间无明显变化（P〉0．05）。②对照组大鼠出肺血中ET含量比入肺血中低（P〈0．05）。H2、H3组大鼠出、入肺血中ET-1含量较对照组均明显增高（P〈0．01）,且H2、H3组大鼠出肺血中ET-1含量均高于入肺血中ET-1含量（P〈0．05）,刚好与对照组相反。H2、H3组大鼠肺组织匀浆中ET—1含量与对照组肺组织和低氧组体循环动脉组织匀浆比较,均明显增高（P〈0.01）,而各组体循环动脉组织匀浆中ET-1含量间无明显差异（P〉0．05）：③对照组大鼠出、入肺血中VEGF含量无明显差异（P〉0．05）,H2、H3组大鼠出肺血血清中VEGF含量较对照组明显增高（P〈0.01）。结论：在慢性低氧可使肺组织产生ET-1和VEGF增多,这可能是慢性肺动脉高压发生、发展的重要机制之一。肺动脉局部缩血管物质ET-1增高,而体循环动脉局部ET-1不增高。可能是长期慢性低氧可导致肺动脉高压的形成,却不发生高血压的机制之一。     

兔肺内小动脉平滑肌细胞培养

肺内小动脉用低浓度胰蛋白酶从肺动脉灌洗后,分离并剪碎,反复用培养基清洗。将沉淀的组织块行肺内小动脉平滑肌细胞培养。培养的细胞经光镜、透射电镜及免疫组化验证为典型的平滑肌细胞。此法简单、方便,可推广应用于各种小血管平滑肌细胞培养,为阻力血管、容量血管疾病的研究提供了理想的实验材料。     

内皮素－1对缺氧肺动脉平滑肌细胞的增殖作用

内皮素（ＥＴ）是至今所发现的最强的内源性血管收缩肽,近年来发现ＥＴ－１能促进血管平滑肌细胞增殖。本研究表明ＥＴ－１对缺氧培养的肺动脉平滑肌细胞（ＰＡＳＭＣ）有剂量依赖的增殖作用,缺氧可促进ＰＡＳＭＣ的ＤＮＡ合成且增加ＥＴ－１的丝裂原作用。ＥＴ－１的丝裂原作用主要由其Ａ型受体（ＥＴＲ＿Ａ）所介导,ＥＴＲ＿Ａ的特异拮抗剂ＢＱ１２３可显著抑制缺氧以及缺氧与ＥＴ－１协同所产生的增殖作用,而且发现ＥＴＲ＿Ａ在缺氧培养的ＰＡＳＭＣ中的表达显著高于常氧对照组ＰＡＳＭＣ。本研究表明ＥＴ－１参与了缺氧性肺动脉结构重组,而缺氧可增强ＰＡＳＭＣ对ＥＴ－１的增殖反应性。     

观察肺动脉平滑肌单细胞舒缩活动的实验模型

为观察肺动脉平滑肌细胞(SMC)的反应性建立了单细胞收缩模型。猪肺动脉SMC在经传代培养后接种于载玻片上,放入实验灌流浴槽,并以胰蛋白酶轻度消化制成单个SMC。高钾(40mmol/L,n=17)、苯肾上腺素(PE,10~(-5)mol/L,n=16)、钙离子携带剂A23187(10~(-7)mol/L,n=15)及PGF_(2α)(10~(-6)mol/L,n=16)可引起单个SMC的收缩,用药后细胞表面积分别缩小29％、15％、23％及15％,其中PE的作用在酚妥拉明(10~(-5)mol/L)存在时被抑制(n=10,P<0.05)。结果提示,培养的肺动脉SMC可作为观察单个细胞舒缩活动的实验模型。     

缺氧对体外培养的肺动脉平滑肌细胞形态及增殖的影响

本实验应用形态学、免疫组化染色,＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入、流式细胞等技术探讨缺氧（〈１％Ｏ２和２．５％Ｏ２）对肺动脉平滑肌细胞（ＰＡＳＭ）形态及增殖的影响。结果表明：缺氧２４ｈ使ＰＡＳＭ表型从收缩型向合成型转换,胞浆内ＳＭ－ａ ａｃｔｉｎ减少,线粒体和粗面内质网增多,缺氧４８ｈ以后线粒体肿胀,空泡化,内质网扩张,胞浆内出现髓鞘样结构。流式细胞分析显示缺氧ＰＡＳＭ Ｇ２／Ｍ期细胞比例明显增多（Ｐ〈０．００     

表皮生长因子对离体大鼠肺动脉及肺动脉平滑肌细胞作用的研究

本研究着重探讨表皮生长因子（ＥＧＦ）对大鼠肺动脉的收缩作用及对肺动脉平滑肌细胞分裂增殖的影响。浓度为１×１０－９－１×１０－７ｍｏｌ／Ｌ的ＥＧＦ可引起大鼠肺动脉剂量依赖性收缩（ｒ＝０．９６８,Ｐ＜０,００１）,其Ｅｍａｘ为１００．６ｍｇ,ＥＣ５０为１１．９６ｎｍｏｌ／Ｌ。在同时存在０．５％胎牛血清（ＦＣＳ）时,ＥＧＦ能促进平滑肌细胞的３Ｈ－ＴｄＲ参入率,该作用与剂量呈正相关（ｒ＝０．８２３,Ｐ＜０．０５）,其ＥＣ５０为６．５×１Ｏ－１２ｍｏｌ／Ｌ。１×１０－９ｍｏｌ／Ｌ的ＥＧＦ＋０．５％ＦＣＳ能产生与１０％ＦＣＳ相当的促细胞分裂增殖能力（在培养的第１,３,５,７天,二者促分裂增殖能力相差不明显,Ｐ均＞０．０５,第９天时,前者大于后者,Ｐ＜０．０５）。１×１０－９ｍｏｌ／ＬＥＧＦ单独存在时对平滑肌细胞未显示出明显的致分裂活性。上述作用提示ＥＣＦ在某些肺血管病变如缺氧性肺动脉高压中可能有一定意义。     

ET－1，NO和缺氧对肺动脉平滑肌细胞钙内流及胶原合成的影响

肺血管平滑肌细胞是肺血管收缩反应的主要执行者,也是肺血管结构重建的重要参与者。本研究观察了内皮素１（ＥＴ１）,一氧化氮（ＮＯ）和缺氧对培养的新生小牛肺动肺平滑肌细胞（ＰＡＳＭＣ）钙内流以及胶原合成的影响。结果表明ＥＴ１和缺氧可促进ＰＡＳＭＣ的钙内流,ＮＯ供应剂硝普钠（ＳＭＰ）可抑制ＥＴＩ诱导的钙内流,其作用呈剂量依赖性,ＳＮＰ还可以剂量依赖地抑制ＰＡＳＭＣ的胶原合成,而缺氧可促进ＰＡＳＭＣ的胶原合成。     

血管内皮舒张因子在氧自由基所致慢性缺氧大鼠肺内动脉收缩中的作用

以黄嘌岭(X)-黄嘌呤氧化酶(XO)系统产生氧自由基,应用微量生物测定法观察慢性缺氧(5000m,10d)对大鼠氧自由基所致肺内动脉收缩的影响及内皮舒张因子(EDRF)在其中的作用。慢性缺氧大鼠有内皮的肺内动脉环对氧自由基的收缩反应较正常环境中的对照动物明显增强,加入EDRF灭活剂还原型血红蛋白(RHb)后更加显著;而加入超氧化物歧化酶(铜锌SOD)后则减弱,甚至消除。反之,不论加入RHb或SOD对氧自由基所致去内皮肺内动脉环的收缩反应均无明显影响。上述结果表明慢性缺氧引起肺内动脉收缩增强与EDRF有密切关系:慢性缺氧可能使EDRF的作用减弱,肺内动脉对氧自由基的反应性增强。表示EDRF及其与氧自由基的关系在慢性缺氧性肺动脉高压的形成中可能具有十分重要的意义。     

眼镜蛇毒直接溶解因子对人肝癌细胞株细胞内游离钙动态变化的影响

用荧光染料FIuo-3标记人肝癌细胞株H_(7402)细胞内游离钙,在粘附式细胞仪观察检测单个细胞内游离钙水平的动态变化,细胞在无钙环境中,直接溶解因子(DLF)刺激下细胞内游离钙迅速升高,达到峰值后下降;在细胞培养皿中加入1mmol/L CaCl_2,DLF使胞浆游离钙持续升高;加入10mmol/L CaCl_2,DLF刺激后胞浆游离钙水平无明显变化,表明DLF能引起胞内Ca~(2 )释放和胞外Ca~(2 )内流,细胞外高浓度Ca~(2 )能阻断DLF升高细胞内Ca~(2 )浓度的 作用。     

氯化钠对培养的大鼠主动脉平滑肌细胞的心房钠尿肽受体的调节

培养的卒中型自发性高血压大鼠(SHR_(sp))及其对照 WKY 大鼠主动脉平滑肌细胞(VSMC)上存在心房钠尿肽(ANP)的特异性受体,它们与~(125)I-ANP 的最大结合量(B_(max))是:SHR_(sp)3.65±0.13和 WKY 1.89±0.09 pmol/mg pr(P<0.01);解离平衡常数(Kd)值分别是72.6±10.2和42.0±4.8×10~(-12)mol/L(P<0.01)。 两种细胞内介导舒血管作用的第二信使、环磷酸乌苷(cGMP)的基础浓度无显著差异,对相同剂量 ANP 刺激引起 cGMP 分别增加139(SHRsp)和271(WKY)倍。可见 SHRsp 的 VSMC ANP 受体数量虽比 WKY大鼠增多,但对相同剂量 ANP 引起的 cGMP 增加反应及 ANP 受体的亲和力均显著降低。高盐培养液孵育24h 后,细胞表面 ANP 受体的亲和力改变不明显,但受体数量下调,SHRsp 和 WKY 大鼠分别降至对照的34.8±8.2%和38.6±9.4%,细胞对 ANP 引起的 cGMP增加反应明显降低,且均以 SHR_(sp)较显著。提示后两种变化可能在高盐促进血压升高的机制中起作用。