中华按蚊CPF家族表皮蛋白基因的全基因组鉴定及其特征分析

【目的】鉴定中华按蚊Anopheles sinensis基因组上的CPF家族表皮蛋白基因,分析其基因结构和特征,推测其可能的生物学功能;同时比较研究代表性蚊种的CPF家族基因,提供CPF家族基因的信息框架。【方法】基于中华按蚊An.sinensis、冈比亚按蚊An.gambiae、微小按蚊An.minimus、埃及伊蚊Aedes aegypti、致倦库蚊Culex quinquefasciatus和黑腹果蝇Drosophila melanogaster全基因组序列,以冈比亚按蚊CPF家族基因序列为询问序列,采用BLASTP,TBLASTN和HMM方法鉴定这些物种的CPF家族基因;利用生物信息学方法预测中华按蚊CPF家族基因的结构、剪切模式、信号肽、跨膜区、结构域和3D结构等;采用最大似然法(maximum likelihood,ML)构建这些物种的系统发生关系,推断CPF家族基因的起源和进化。【结果】中华按蚊、冈比亚按蚊、微小按蚊、埃及伊蚊、致倦库蚊和黑腹果蝇全基因组共有4,4,4,3,3和3个CPF家族基因。中华按蚊的CPF基因被分别命名为As CPF1,As CPF2,As CPF3和As CPF4,这些As CPF基因的全长c DNA序列分别为736,2 021,531和1 001 bp,分别编码219,345,148和185个氨基酸。As CPF1,As CPF2和As CPF3仅含有一个内含子,但As CPF4含有3个内含子,所有内含子均为0位内含子。As CPF1,As CPF2,As CPF3和As CPF4分别有3,2,1和2个不同的选择性剪切子。As CPF3的表达量最高,其次是As CPF4,As CPF2和As CPF1。推测的As CPF1,As CPF2,As CPF3和As CPF4的理论分子量分别为22.86,36.47,15.08和18.66 k D,等电点分别为9.08,8.97,9.44和9.16。As CPF家族蛋白含有保守的44个氨基酸基序和C-末端基序;As CPF1,As CPF3和As CPF4具有信号肽,为分泌型蛋白,而As CPF2缺乏信号肽,为非分泌蛋白。二级结构分析显示,4个As CPF均具有α-螺旋,无规卷曲和延伸链,只有As CPF4有一段跨膜片段,位于第5-27位氨基酸。系统发育分析显示,CPF3基因可能是最早分化出来的CPF家族基因,CPF1和CPF2基因可能是同一祖先基因经过一个基因重复事件分化形成的,CPF4基因很可能是按蚊所特有的,是最晚分化出来的CPF基因。以冈比亚按蚊为对照,替换率分析显示,中华按蚊CPF表皮蛋白的Ka/Ks值均小于1,表现出纯化选择。【结论】对中华按蚊CPF家族基因在全基因组上的鉴定和特征分析,及对代表性蚊虫CPF家族基因的比较分析,揭示了蚊虫CPF家族基因的多样性、结构和氨基酸特征以及起源和进化,这为该家族基因的进一步研究和利用提供了信息基础。     

中华按蚊血红素过氧化物酶家族基因的全基因组鉴定、特征和进化

【目的】在全基因组上鉴定中华按蚊Anopheles sinensis血红素过氧化物酶(heme peroxidase,HPX)家族基因,并预测其基本特征,探究双翅目中5种代表性昆虫HPX基因的系统发育关系和进化。【方法】以NCBI数据库中黑腹果蝇Drosophila melanogaster和家蚕Bombyx mori等昆虫HPX基因编码的氨基酸序列为询问序列,通过本地Blast搜索鉴定中华按蚊基因组上HPX家族基因,并鉴定了冈比亚按蚊Anopheles gambiae、致倦库蚊Aedes aegypti和埃及伊蚊Culex quinquefasciatus基因组上的HPX基因;基于冈比亚按蚊HPX基因的命名系统,对中华按蚊HPX基因进行命名;运用生物信息学方法预测了中华按蚊HPX基因的特征,包括基因的结构及在scaffold的定位,氨基酸的替换率和保守结构域,蛋白质3D结构等,通过与冈比亚按蚊共线性分析定位了中华按蚊HPX基因在染色体上的位置;基于HPX核苷酸序列,采用PAUP4.0和MEGA6.0软件利用最大相似法构建了5个双翅目代表性种HPX基因的系统发生树。【结果】中华按蚊基因组共有20个HPX基因,冈比亚按蚊、埃及伊蚊和致倦库蚊基因组分别有18,14和12个HPX基因。这4种蚊虫的HPX蛋白都被分类进入Peroxinectin,Peroxidasin,DBLPX和DUOX 4个亚家族,其氨基酸的分子量介于61.6~186.6 k D之间(除As HPX8为29.6 k D)。中华按蚊20个HPX基因共具有98个外显子,75个内含子,其外显子与内含子分布模式在基因间差异较大。中华按蚊HPX基因被定位到10个scaffold上,对应到冈比亚按蚊的2R,3R,2L,3L和X染色体。这些中华按蚊HPX基因编码的氨基酸序列(除DUOX)都具有1个血红素结合位点和5个Ca~(2+)结合位点,在N端和C端各具有2个半胍氨酸位点并界定了两个二硫键。中华按蚊与冈比亚按蚊同源基因对的ω值都小于1,说明HPX基因在进化过程中没有受到明显的环境选择压力。系统发育关系研究表明,5种双翅目昆虫的HPX基因可以分为16个组,其中11个组在进化上呈明显的单系,具有至少83%的bootstrap支持。【结论】本研究提供了中华按蚊的HPX基因的基础信息。不同蚊虫种具有相似分子量的HPX蛋白,这与HPX家族蛋白结构的高度保守性有关。蚊虫的DUOX随着主要功能位点的缺失逐渐失去其功能,这与其特殊环境适应相关。DBLPX亚家族的peroxidase结构域在HPX家族所有亚家族中是最保守的。     

中华按蚊化学感受蛋白(CSP)家族基因的全基因组鉴定和特征分析

【目的】在全基因组水平鉴定中华按蚊Anopheles sinensis化学感受蛋白(chemosensory protein,CSP)家族基因,预测该家族基因的特征,研究代表性双翅目昆虫CSP基因的系统发育和进化。【方法】在NCBI数据库中下载CSP氨基酸序列作为询问序列,通过Blast和HMM方法在全基因组水平搜索和鉴定中华按蚊、冈比亚按蚊An.gambiae、埃及伊蚊Aedes aegypti和致倦库蚊Culex quinquefasciatus的CSP家族基因并命名;通过生物信息学方法预测中华按蚊CSP家族基因的特性(基因结构、基因组定位、剪切模式、Ka/Ks比值)、保守结构域和蛋白质结构等;通过MEGA软件用最大似然法(maximum likelihood,ML)推断该家族基因的系统发育。【结果】中华按蚊、冈比亚按蚊、埃及伊蚊和致倦库蚊基因组分别有8,8,43和27个CSP家族基因。中华按蚊CSP家族基因(AsCSPs)都有全长的转录组序列,编码116(AsCSP7)~335(AsCSP5)个氨基酸;7个AsCSPs分布于Scaffold51上,AsCSP8分布于Scaffold116;AsCSP1~AsCSP8分别有3,2,1,1,1,2,1和2个选择性剪切模式;AsCSP3的表达量最高,其FPKM值达到385.46。AsCSPs的N端信号肽由17~37个氨基酸组成,均含有4个保守的半胱氨酸位点(CYS68,CYS75,CYS94和CYS97),这些位点界定了两个二硫键(CYS68-CYS75和CYS94-CYS97)。系统发育分析结果显示,4种蚊虫的8个CSP基因各自形成明显的支系,被命名为组CSP1~CSP8(CSP1-CSP8 group)。埃及伊蚊和致倦库蚊分别有35和18个CSP基因形成了一个不为按蚊所共有的特殊支系,被命名为Culicinae-specific组。替换率结果显示,中华按蚊与冈比亚按蚊同源基因对的Ka/Ks值都小于1,说明CSP家族基因在进化过程中主要是受到纯化选择作用。【结论】本研究为蚊虫,特别是中华按蚊基因组CSP家族基因提供了信息框架,为进一步开展该家族基因的功能研究奠定了基础。     

中华按蚊含LY结构域的胰蛋白酶基因的分子特征及表达模式分析

【目的】在全基因组鉴定中华按蚊Anopheles sinensis 含LY结构域的胰蛋白酶(LY-trypsin)基因,探究其分子特征、表达模式以及系统发育关系。【方法】以NCBI数据库中冈比亚按蚊An. gambiae、埃及伊蚊Aedes aegypti、黑腹果蝇Drosophila melanogaster和致倦库蚊Culex quinquefasciatus胰蛋白酶家族基因的氨基酸序列为询问序列,通过本地Blast搜索鉴定中华按蚊基因组中胰蛋白酶基因,将中华按蚊LY-trypsin基因依据其结构域特征及系统发生关系进行命名LY-trypsin。运用生物信息学方法预测中华按蚊LY-trypsin基因的结构、在scaffold的定位、结构域、系统发育关系,及其在中华按蚊不同发育时期、成蚊不同组织和吸血前后雌成蚊中的表达模式。【结果】在中华按蚊全基因组上共鉴定得到27个中华按蚊LY-trypsin基因;在黑腹果蝇、冈比亚按蚊、致倦库蚊和埃及伊蚊基因组中未鉴定到LY-trypsin基因。中华按蚊27个LY-trypsin基因分别编码329~1 125个氨基酸,分子量在36.8~125.5 kD之间,等电点在4.73~8.94间。其中, 20个LY-trypsin具有信号肽,信号肽长度在10~62个氨基酸之间。这27个中华按蚊LY-trypsin基因的外显子数为1~5个,内含子长62~20 093 bp。这27个中华按蚊LY-trypsin基因被定位在11个scaffold上,其编码蛋白均有YWTD保守基序(LY基序);其中16个LY-trypsin基因所编码的氨基酸序列具有含丝氨酸、组氨酸和天冬氨酸催化三联体的活性位点。系统发育结果表明,27个中华按蚊LY-trypsin基因聚类为4个分支。在不同发育阶段,半数以上的中华按蚊LY-trypsin基因显示出相似的表达模式,在幼虫阶段均高水平表达;在中华按蚊不同成蚊组织中,LY-trypsin基因均有不同程度的表达;吸血前后雌蚊中仅有个别基因表达,并未发现表达特异性。【结论】本研究在中华按蚊基因组中首次鉴定出LY trypsin基因,并揭示了这些LY-trypsin基因的分子特征和表达模式,为LY-trypsin基因的进一步研究提供了信息框架。     

中华按蚊OCT家族基因的多样性及序列特征

【目的】在全基因组水平鉴定、分类和命名中华按蚊Anopheles sinensis有机阳离子转运体(organic cation transporter, OCT)家族基因,为昆虫OCT基因提供信息框架。【方法】从NCBI, VectorBase和EMBL数据库下载冈比亚按蚊An. gambiae、黑腹果蝇Drosophila melanogaster和秀丽隐杆线虫Caenorhabditis elegans已知的OCT氨基酸序列作为询问序列,基于中华按蚊基因组与转录组测序数据,通过本地Blast搜索鉴定中华按蚊基因组上OCT基因;运用生物信息学方法预测中华按蚊OCT基因的基因结构、Scaffold定位和保守基序等特征,通过最大似然法构建中华按蚊OCT基因的系统发育树。【结果】中华按蚊共有54个OCT家族基因,分属于OCTA, OCTB和OCTC 3个亚家族,分别有33, 15和6个基因。除AsOCTA20和AsOCTB2外,其余OCT基因编码的氨基酸序列均具有MFS_1和Sugar_tr跨膜结构域(transmembrane domain, TMD),大多数OCT氨基酸序列有12个TMD。所有OCT氨基酸序列都有GRK-(PT)-VL, PES-(APVS)和EQFPT-(VI)-RN 3个保守基序,各亚家族还有各自的保守基序。4对基因(AsOCTB4a和AsOCTB4b, AsOCTA10a和AsOCTA10b, AsOCTA19a和AsOCTA19b,以及AsOCTA23a和AsOCTA23b)源自基因重复事件。AsOCTC基因较为原始,AsOCTB基因较为进化,都是明显的单系; AsOCTA基因介于两者之间,进化关系较为复杂。【结论】本研究丰富了中华按蚊基因组数据,为后续中华按蚊OCT基因功能特别是杀虫剂抗性机制方面的功能研究奠定了基础。     

细胞色素P450基因AsCYP6Z2在中华按蚊溴氰菊酯抗性维持中的作用

【目的】探究细胞色素P450基因AsCYP6Z2是否与中华按蚊Anopheles sinensis抗拟除虫菊酯有关。【方法】克隆中华按蚊AsCYP6Z2基因的编码区。采用实时定量PCR(real-time quantitative PCR, qPCR)检测该基因在中华按蚊溴氰菊酯敏感品系(WX-LS)和抗性品系(YN-LR)雌蚊不同发育阶段的表达和在敏感品系雌蛹不同组织中的表达。雌蛹腹部后端分别在25 mg/mL溴氰菊酯溶液和纯丙酮溶液(对照)中体外培养后,采用qPCR检测AsCYP6Z2在溴氰菊酯处理组和丙酮对照组中的表达差异。于化蛹后10 h分别注射dsAsCYP6Z2(RNAi组)和dsEGFP(对照组),采用qPCR检测AsCYP6Z2在RNAi组和对照组中的表达差异;采用生物测定方法测定RNAi组和对照组中雌成蚊接触0.05%溴氰菊酯药膜1 h内的击倒率及雌成蚊接触0.05%溴氰菊酯药膜1 h并恢复24 h时的死亡率。通过分子对接预测该基因与溴氰菊酯相互作用的氨基酸残基。【结果】克隆获得了AsCYP6Z2基因(GenBank登录号： MT840336)的编码区,其开放阅读框(ORF)长1 251 bp,编码416个氨基酸,无信号肽和跨膜结构域。发育表达谱表明,AsCYP6Z2基因主要在化蛹30 h至成蚊3 h期间高表达,且抗性品系的基因表达量明显高于敏感品系的;组织表达谱显示该基因在腹部后端的表达量较高,其次是在腹部前端和胸部,在头部的表达量最低。雌蛹腹部后端在25 mg/mL溴氰菊酯溶液中培养12 h和24 h后,处理组中AsCYP6Z2的表达量相比于对照组(纯丙酮培养组)分别上调4倍和13倍。RNAi干扰AsCYP6Z2后,RNAi组中AsCYP6Z2基因的表达量相较于对照组(dsEGFP注射组)下调了约80%。雌成蚊接触0.05%溴氰菊酯药膜1 h后,RNAi组中的个体比对照组中的约提前20 min出现明显的击倒现象,且击倒率明显高于对照组;雌成蚊接触0.05%溴氰菊酯药膜1 h并恢复24 h后,RNAi组中的个体死亡率相比对照组增加了17%, 表明沉默AsCYP6Z2基因导致蚊虫对溴氰菊酯的敏感度显著增加。溴氰菊酯与AsCYP6Z2预测蛋白的分子对接研究结果显示,溴氰菊酯可以进入AsCYP6Z2蛋白的结合口袋,并且与Cys-155形成Pi-硫相互作用以及产生较稳定的氢键,侧链也可与AsCYP6Z2的Ala-165, Val-72, Leu-76, Leu-82和Ala-24等氨基酸残基形成稳定的疏水相互作用网络。【结论】研究结果表明AsCYP6Z2基因参与中华按蚊溴氰菊酯抗性表型的维持,这为进一步探究该基因在拟除虫菊酯类杀虫剂代谢过程中的分子机理奠定了前期基础。     

林氏按蚊线粒体全基因组序列的测定及基于线粒体基因组的按蚊属系统发育分析(英文)

【目的】对林氏按蚊Anopheles lindesayi完整的线粒体基因组进行测序及分析,依据已知的线粒体基因组构建并讨论按蚊属蚊虫的分子系统发育关系。【方法】对林氏按蚊线粒体基因组进行测序、注释,并对其基本特征和基本组成进行分析。基于串联的13个蛋白质编码基因的核苷酸序列和氨基酸序列,用ML法和贝叶斯法构建林氏按蚊和按蚊属其他32种蚊虫的系统发育树,据此探讨按蚊属蚊虫的系统发育关系和系统分类。【结果】林氏按蚊线粒体基因组全长为15 366 bp,包含13个蛋白质编码基因,22个tRNA基因,2个rRNA基因和一段控制区。林氏按蚊线粒体基因组呈现明显的AT偏斜和GC偏斜,AT偏斜为正,GC偏斜为负。除了COX1使用TCG和ND5使用GTG作为起始密码子以外,其他蛋白质编码基因的起始密码子均遵循ATN原则;终止密码子为TAA或者T。除了tRNA^Ser(AGN)以外,其他的tRNA基因均呈现典型的三叶草二级结构。控制区AT含量最高,为94.54%。滑窗分析显示蛋白质编码基因是用于构建亚属或属水平系统发育关系的最佳分子标记。系统发育树强烈支持塞蚊亚属Cellia、按蚊亚属Anopheles、徕蚊亚属Nyssorhynchus和柯特蚊亚属Kerteszia均为单系群。小五斑按蚊An. atroparvus和四斑按蚊An. quadrimaculatus A这两个种聚到一起,从传统的形态分类上讲,它们和林氏按蚊均属于按蚊亚属按蚊系蚊虫。但本研究构建的4个系统发育树均显示,(小五斑按蚊An. atroparvus+四斑按蚊An. quadrimaculatus A)和林氏按蚊被属于迈蚊系的中华按蚊分开,这为两个系的分类提供了新的论点。【结论】本研究获得了林氏按蚊的完整的线粒体基因组,探析了按蚊属的线粒体基因组特征和系统发育关系,为进一步研究蚊科线粒体基因组和系统发育关系提供了依据。     

基于mtDNA和rDNA基因序列的中国按蚊属塞蚊亚属种类的系统发育研究（双翅目：蚊科）

【目的】应用mtDNA和rDNA基因特征重建中国按蚊属塞蚊亚属已知种类的系统发育关系, 以阐明亚属内各蚊种的亲缘关系。【方法】对采自中国的按蚊属塞蚊亚属Anopheles (Cellia) 20种蚊的mtDNA-COⅡ和 rDNA-28S-D3序列进行测定和分析, 以按蚊属按蚊亚属Anopheles (Anopheles)的中华按蚊An. (An.) sinensis和赫坎按蚊An. (An.) hyrcanus为外群, 采用COⅡ和D3单基因, 以及“COⅡ+D3”联合数据组以邻接法（NJ）、 最大简约法（MP）、 最大似然法（ML）和贝叶斯法（BI）等重建这些种类的系统发育树。【结果】 mtDNA-COⅡ和rDNA-28S-D3序列的长度范围分别为685 bp和375～410 bp, 在塞蚊亚属蚊种间的遗传距离分别为0.015～0.117和0.003～0.111。各系统树显示外群被合理分开,除在COⅡ树中新塞蚊系为并系外,各系均聚为单系群,新迈蚊系和迈蚊系亲缘关系最近。联合数据组构建的系统合意树显示中国塞蚊亚属各蚊种形成4支,除伪威氏按蚊与多斑按蚊种团未聚为单系群外,其他各种团和复合体成员种均分别聚在一起,各分支的置信值均大于50%。【结论】本研究获得的分子系统发育树清楚地显示了中国按蚊属塞蚊亚属各种类及系之间的系统发育关系, 对其分类和防治研究具有参考价值。     

中华按蚊全基因组微卫星的鉴定、特征及分布规律

【目的】中华按蚊Anopheles sinensis是我国及东南亚重要的传疟媒介。本研究在全基因组上鉴定和分析中华按蚊微卫星并注释微卫星相关基因的功能,为遗传分子标记的筛选提供依据,也为昆虫微卫星比较基因组学进一步研究提供基础。【方法】用MISA程序鉴定中华按蚊基因组微卫星;用Excel 2010统计微卫星长度,结合微卫星序列信息编写Perl脚本计算微卫星碱基含量;结合微卫星位置信息编写Perl脚本定位微卫星出现的基因区域,并对基因区的微卫星进行GO功能注释;运用WEGO比较中华按蚊和冈比亚按蚊An.gambiae含微卫星相关基因功能注释。【结果】共鉴定出105 981个微卫星,出现的密度是365.5个/Mb。其中100 391个(94.7%)微卫星是完整型微卫星,其余5 590个(5.3%)是复合型微卫星。单碱基微卫星最为丰富,共58 837个,占总微卫星数量的55.5%,其余依次是二碱基(30 345个,占28.6%)、三碱基(15 104个,占14.3%)、四碱基(1 530个,占1.4%)、五碱基(121个,占0.1%)和六碱基(44个,少于0.1%)微卫星。(A)n为最主要的微卫星,其次是(AC)n,(AG)n,(C)n,(AGC)n,(ATC)n,(ACG)n和(ACC)n,数量都在2 000个以上。中华按蚊基因组微卫星长度以10~20 bp为主(87.1%)。这些微卫星的AT含量(63%)明显高于GC含量(37%),仅三碱基微卫星的GC含量(53%)略高于AT含量(47%)。90 632个微卫星(85%)分布在基因间区,15 349个(15%)微卫星分布在基因区。在基因区,2 782个(3%)微卫星分布在外显子区,12 567个(12%)分布在内含子区。GO注释比较中华按蚊和冈比亚按蚊含微卫星的基因,发现这两个物种各小类基因所占总基因数的百分比基本一致,但电子传递类(electron carrier)基因在中华按蚊所占百分比(0.9%)明显高于冈比亚按蚊(0.1%)。【结论】这是蚊虫中首个在全基因组上系统的微卫星研究工作,为进一步通过微卫星作为分子标记开展中华按蚊种群遗传学、遗传变异、功能基因的遗传定位和调控机制研究奠定了基础,也为昆虫微卫星的多样性和进化研究积累了科学素材。     

冈比亚按蚊犬尿氨酸甲酰胺酶抑制剂的虚拟筛选

【目的】利用计算机模拟技术,对冈比亚按蚊Anopheles gambiae犬尿氨酸甲酰胺酶(kynurenine formamidase,KFase)的潜在抑制剂进行虚拟筛选,以获得可以削弱冈比亚按蚊作为中间宿主传播疟疾等蚊媒疾病的候选杀蚊剂。【方法】下载冈比亚按蚊KFase的氨基酸序列,通过BLAST方法查询不同物种中的同源蛋白质,并利用MEGA6最大似然法(maximum likelihood method)构建进化树,选择适于作为模板的同源蛋白黑腹果蝇Drosophila melanogaster KFase晶体结构(PDB ID:4E14),对冈比亚按蚊KFase进行三维建模。利用随机森林算法对小分子化合物数据库进行筛选,并对筛选结果进行处理,模拟自然条件下有机小分子与冈比亚按蚊KFase的结合以及分子对接,从而筛选出冈比亚按蚊KFase的潜在抑制剂。【结果】获得3个小分子化合物与冈比亚按蚊KFase结合的亲和能较低,分别是:N-(2,4-diketo-1H-pyrimidin-6-yl)-2-fluoro-benzamide;3-(4-fluorophenyl)-2,4-dioxo-1,2,3,4-tetrahydropyrimidine-5-carboxylic acid;N-(2-oxo-2,3-dihydro-1Himidazo[4,5-b]pyridin-5-yl)-succinamic acid。它们与冈比亚按蚊KFase结合的亲和能分别为:-9.0,-8.7和-8.9 kcal/mol。【结论】N-(2,4-diketo-1H-pyrimidin-6-yl)-2-fluoro-benzamide,N-(2-oxo-2,3-dihydro-1H-imidazo[4,5-b]pyridin-5-yl)-succinamic acid和3-(4-fluorophenyl)-2,4-dioxo-1,2,3,4-tetrahydropyrimidine-5-carboxylic acid是冈比亚按蚊犬尿氨酸甲酰胺酶的潜在竞争性抑制剂,这些化合物是否可作为杀蚊剂的候选化合物有待实验验证。     

中华按蚊电转化显微注射技术平台的构建及其在基因瞬时过表达中的应用

【目的】构建在中华按蚊 Anopheles sinensis 中的电转化显微注射技术平台,并利用该技术平台实现活体基因瞬时过表达对其进行验证,为开展系统的基因功能研究奠定基础。【方法】以CUY21EDIT Ⅱ电转仪为主体构建中华按蚊中的电转化显微注射技术平台;使用同源重组法构建 EGFP 和 Bm-iAANAT 基因的瞬时过表达质粒,在中华按蚊化蛹3 h时注射该质粒进入蛹体,随即使用电转仪对注射后的蛹进行电击,待注射个体发育至化蛹39 h时,利用体视荧光显微镜观察蛹体表皮着色和发光情况,并通过荧光定量PCR检测 EGFP 和 Bm-iAANAT 的表达。【结果】构建了用于显微注射的 PIZ-modi-Aepub-EGFP-SV 40和 PIZ-modi-Aepub-AANAT- T2A-EGFP-SV 40过表达载体。 PIZ-modi-Aepub-EGFP-SV 40注射组中华按蚊在化蛹39 h时约87.5%的个体成活并正常黑化,这其中约92.7%的个体的表皮检测到明显的绿色荧光,注射无启动子载体 PIZ-modi-EGFP-SV 40并进行电击的阴性对照组和注射过表达载体 PIZ-modi-Aepub-EGFP-SV 40但未进行电击的阳性对照组个体则没有明显的绿色荧光;并且荧光定量PCR结果显示,注射组中发光个体的 EGFP 基因明显高表达。 PIZ-modi-Aepub-AANAT-T 2 A-EGFP-SV 40注射组的蛹在化蛹39 h时有80.4%个体存活,这其中92.2%的个体相对于注射无启动子载体 PIZ-modi-AANAT- T2A -EGFP-SV 40的阴性对照组和注射过表达载体 PIZ-modi-Aepub-AANAT- T2A -EGFP-SV 40但未进行电击的阳性对照组个体黑化明显受阻,且有明显的绿色荧光;并且荧光定量PCR结果显示,报告基因 Bm-iAANAT 和 EGFP 的表达明显提高。【结论】成功构建了在中华按蚊中的电转化显微注射技术平台;通过此技术平台能够便捷、快速和高效地实现报告基因在活蛹中的瞬时过表达,并产生了目的表型。这为中华按蚊功能基因组研究奠定了基础。     

二斑叶螨不同抗性品系最佳内参基因的筛选及CYP392E亚家族基因的表达分析

【目的】 筛选二斑叶螨Tetranychus urticae敏感品系（SS）、 抗阿维菌素品系(Av-R)和抗螺虫乙酯品系（Sp-R）中合适的内参基因, 研究二斑叶螨不同抗性品系CYP392E亚家族基因表达水平的变化。【方法】采用实时荧光定量PCR （quantitative real time PCR, qRT-PCR）技术, 对二斑叶螨α-tubulin, β-actin, ELFn, GAPDH, 5.8S rRNA基因和SDHA共6个看家基因的表达稳定性进行分析以期筛选出合适的内参基因, 并在此基础上进一步分析二斑叶螨不同品系P450酶系CYP392E亚家族基因的表达量差异。【结果】在二斑叶螨SS, Av-R和Sp-R品系中稳定性最高的内参基因为ELFn。以ELFn为内参基因, CYP392E7基因相对表达量在二斑叶螨Av-R品系中显著高于SS品系(P<0.05), 为后者的2.18倍, 而在Sp-R品系和SS品系中差异不显著; 其余基因的相对表达量在2个抗性品系中均没有增加, Av-R品系的CYP392E4, CYP392E9和CYP392E10基因以及Sp-R品系的CYP392E1和CYP392E9基因相对表达量甚至显著下调, 分别为SS品系的48%, 74%, 65%, 63%和73%。【结论】在二斑叶螨SS, Av-R和Sp-R品系中ELFn为理想的内参基因, Av-R品系CYP392E4, CYP392E7, CYP392E9和CYP392E10基因相对表达量的显著变化可能与二斑叶螨对阿维菌素的抗性形成有关, Sp-R品系CYP392E1和CYP392E9基因也可能与二斑叶螨对螺虫乙酯的抗性形成有一定联系。     

斯氏按蚊中Toll受体参与抵抗微生物感染和调控肠道菌群稳态

【目的】Toll信号通路是昆虫天然免疫系统的重要组分,其中Toll受体在激活昆虫病原菌侵染免疫应答方面发挥了关键作用。本研究旨在探究斯氏按蚊Anopheles stephensi Toll受体基因在抵抗微生物侵染和维持肠道菌群稳态过程中的功能。【方法】根据冈比亚按蚊Anopheles gambiae Toll受体家族的蛋白氨基酸序列,通过序列同源比对鉴定斯氏按蚊中相应的Toll受体基因;运用荧光定量PCR检测Toll受体基因在未感染病原菌的斯氏按蚊脂肪体中的相对表达量,以及在真菌球孢白僵菌Beauveria bassiana和革兰氏阴性细菌胡萝卜软腐欧文氏菌Erwinia carotovora subsp. carotovora侵染斯氏按蚊过程中的表达变化;最后,在斯氏按蚊雌成蚊胸部显微注射AsToll1A和AsToll5A的双链RNA进行RNA干扰后,检测RNAi处理的斯氏按蚊受真菌侵染后的存活率、肠道细菌含量变化以及抗菌肽基因表达变化。【结果】在斯氏按蚊中共鉴定到8个Toll受体基因,即AsToll1A, AsToll5A, AsToll6, AsToll7, AsToll8, AsToll9, AsToll10和AsToll11。通过荧光定量PCR检测发现,未感染病原菌的斯氏按蚊雌成蚊脂肪体中AsToll5A表达量最高,AsToll1A表达量次之,其余Toll受体基因表达量极低。在球孢白僵菌和胡萝卜软腐欧文氏菌侵染过程中,与对照(注射PBS)比较,AsToll1A和AsToll5A在斯氏按蚊中的表达量显著升高,其余Toll受体基因表达变化不显著或降低。RNA干扰结果表明,AsToll1A或AsToll5A的表达受到抑制后,斯氏按蚊对球孢白僵菌的抵抗能力显著降低,肠道细菌总量与对照(dsGFP)比较显著增多。而且,抑制AsToll1A后抗菌肽基因DEF1和GAM1的表达受到显著抑制;抑制AsToll5A后仅有GAM1表达量下调。【结论】斯氏按蚊Toll受体在结构和功能上具有高度的保守性,其中AsToll1A和AsToll5A能响应病原真菌和革兰氏阴性细菌侵染并且影响肠道菌稳态。     

中华按蚊气味结合蛋白基因AsinOBP1的克隆和表达分析

【目的】蚊虫的行为在很大程度上依赖于嗅觉系统, 例如寻找宿主和产卵场所等。中华按蚊Anopheles sinensis是我国最重要的传疟媒介之一, 但有关中华按蚊嗅觉信号传递过程的研究甚少。本研究旨在克隆和表达分析中华按蚊的气味结合蛋白（odorant binding proteins, OBPs）基因, 为进一步研究中华按蚊嗅觉传递的分子机制奠定基础。【方法】通过分析中华按蚊的转录组数据克隆气味结合蛋白基因, 采用RT-PCR和实时定量PCR技术分析该基因在成虫不同组织和在吸血前后的表达模式。【结果】克隆到一个气味结合蛋白基因, 命名为AsinOBP1 (GenBank登录号为KJ958382)。AsinOBP1基因开放阅读框长435 bp, 编码144个氨基酸, 具有典型的6个半胱氨酸位点。RT-PCR组织表达谱分析发现, AsinOBP1在检测的所有成虫触角、下颚须、喙和头部组织中都有表达, 而在足和去掉头部以外的躯体组织中不表达。定量分析发现AsinOBP1在雌蚊触角中的表达水平最高, 吸食血液后, AsinOBP1的表达水平显著下降; 仅用小鼠气味处理后, AsinOBP1的表达水平也显著下降。【结论】研究结果说明AsinOBP1可能是嗅觉组织特异性表达的基因, 与雌蚊寻找宿主等行为有关, 其功能还需深入研究。     

中华按蚊血红素加氧酶基因 AsHO-1的鉴定及其在血餐后虫体中的表达动态

【目的】雌蚊需要吸食血液以完成营养生殖循环,血液蛋白的消化会释放大量的游离血红素。血红素是促氧化剂,必须严格调控血红素的动态平衡。血红素加氧酶 (heme oxygenase, HO) 在血红素的动态平衡调控中起着关键的作用,但不同昆虫HO代谢血红素的途径有差异。本研究旨在鉴定和表达分析中华按蚊 Anopheles sinensis 的 HO-1基因,研究HO-1和血红素在血餐后的动态变化过程,为进一步研究中华按蚊血红素的动态平衡调控机制奠定基础。【方法】通过分析中华按蚊的转录组数据鉴定HO-1基因,采用实时定量PCR技术分析该基因在不同组织和在取食血液、葡萄糖前后的表达谱,并测定取食血液后中肠中不同时间的血红素浓度。【结果】鉴定到中华按蚊血红素加氧酶1基因,命名为 AsHO-1（GenBank登录号为KP994552）。AsHO-1开放阅读框长729 bp,编码242个氨基酸。定量PCR表达分析发现,AsHO-1在幼虫和成虫的中肠和中肠外组织（仅去掉中肠的虫体）中都有表达,中肠外组织中的表达水平显著高于中肠中的表达水平。AsHO-1在吸食血液后的中肠中上调明显,而在中肠外组织中的表达变化较小。吸食葡萄糖后,中肠中AsHO-1在6-12 h表达上升,最高上升了4.2倍,而在吸食血液后AsHO-1在12-24 h表达上升,最高上升了11.67倍。中肠中的血红素含量在吸食血液后的3 h即开始迅速上升,6 h达到最高,18 h开始下降。【结论】研究结果说明AsHO-1在血餐后表达水平显著上调,有可能与血红素的动态调节有关,但有待进一步验证。除中肠外,AsHO-1基因还在幼虫期和在成蚊的中肠外组织中高表达,说明AsHO-1基因还可能参与中华按蚊的其他多种生理过程。