盐芥热激同源蛋白70基因(Thhsc70)的分子克隆及鉴定(英文)

热激蛋白70(hsp70s)具有分子伴侣的功能,其中在非胁迫条件下表达的hsp70s称为热激同源蛋白70(hsc70)。为更好地了解hsc70基因的特性,鉴定了盐芥(Thellungiella halophila(C. A. Mey. )O. E. Schulz)中编码胞质hsc70蛋白的基因Thhsc70。实验结果表明:在非胁迫条件下,Thhsc70基因具有组织特异性表达;Thhsc70基因受热胁迫和冷胁迫的诱导表达,但几乎不受盐诱导和干旱诱导。Thhsc70基因在拟南芥中过量表达后提高了转基因拟南芥的热耐受性和冷耐受性。     

盐芥热激同源蛋白70基因(Thhsc70)的分子克隆及鉴定

热激蛋白70(hsp70s)具有分子伴侣的功能,其中在非胁迫条件下表达的hsp70s称为热激同源蛋白70(hsc70).为更好地了解hsc70基因的特性,鉴定了盐芥(Thellungiella halophila(C.A.Mey.)O.E. Schulz)中编码胞质hsc70蛋白的基因Thhsc70.实验结果表明:在非胁迫条件下,Thhsc70基因具有组织特异性表达;Thhsc70基因受热胁迫和冷胁迫的诱导表达,但几乎不受盐诱导和干旱诱导.Thhsc70基因在拟南芥中过量表达后提高了转基因拟南芥的热耐受性和冷耐受性.     

热胁迫下八字地老虎hsc70基因在不同组织转录表达差异性分析

【目的】为探讨八字地老虎Xestia c-nigrum(Linnaeus)Xe-hsc70基因表达与高温耐受性之间的关系,比较热胁迫下Xe-hsc70基因在不同组织中诱导表达的差异。【方法】本研究以八字地老虎4龄幼虫为研究对象,采用RT-PCR和RACE技术克隆获得编码热激同源蛋白70(70 ku heat shock cognate,HSC70)的基因(命名为Xe-hsc70)cDNA全序列与基因组DNA序列(Genomic DNA,gDNA),并利用实时荧光定量PCR和Western blotting技术,比较分析不同热胁迫温度及不同热诱导时间下八字地老虎4龄幼虫体内马氏管、中肠、体壁、脂肪体与唾腺5个组织中Xe-hsc70基因在mRNA转录与蛋白表达两水平上相对表达量的变化。【结果】比较分析克隆得到的Xe-hsc70基因cDNA全序列和gDNA序列,结果表明Xe-hsc70基因含有8个内含子,最大内含子(561 bp)位于5′端非编码区,并含有一个类似热激应答原件HSE的核心结构序列(gaatatgCaGAAtgTTCcaGaa),其余内含子(长度在86~218 bp之间不等)均在编码区内,本研究首次报道了八字地老虎hsc70内含子的具体数目及位置。组织差异性分析显示:在常温25℃条件下,Xe-HSC70在脂肪体中表达量最高,在唾腺中表达量最低;经热激诱导后中肠、唾腺与体壁组织中Xe-HSC70的表达量与对照(25℃)相比显著上调,随着热激时间的延长,表达量呈现出先升高后恢复至对照水平的变化趋势,脂肪体和马氏管Xe-HSC70表达量与对照相比无明显变化。【结论】八字地老虎不同组织在应对热胁迫的过程中,抗逆机制具有明显的差异。Xe-HSC70的不断积累是八字地老虎对热胁迫不断适应的一个过程,其组织中Xe-hsc70基因的高表达在八字地老虎抗热胁迫的过程中起着重要作用,并为从分子水平上研究八字地老虎的抗逆机理提供依据。     

大豆蚜对不同浓度吡虫啉药剂胁迫的适应性

【目的】本研究旨在探索大豆蚜对半致死浓度LC_(50)、亚致死浓度LC_(30)吡虫啉的适应性,掌握吡虫啉对大豆蚜种群在田间发生趋势、进化及分布的影响,从而指导田间精准施药,为保护生态环境和推动可持续农业发展提供新思路。【方法】采用浸渍法,用大豆蚜初孵若虫亚致死浓度LC_(30)及半致死浓度LC_(50)的吡虫啉胁迫大豆蚜初孵若虫,监测大豆蚜实验种群的生长发育特性和繁殖力变化趋势,组建种群生命表。另用4龄若虫亚致死浓度LC_(30)及半致死浓度LC_(50)的吡虫啉胁迫大豆蚜,分析连续5代大豆蚜对吡虫啉的抗性。【结果】受LC_(50)、LC_(30)吡虫啉药剂胁迫的大豆蚜种群的存活率均经历了急剧下降期、平缓下降期和次急速下降期3个时期,根据Deevey种群存活曲线两个处理均为凹曲线;日产蚜峰值出现顺序依次为:LC_(30)(处理组Ⅰ)、对照组、LC_(50)(处理组Ⅱ);受LC_(30)、LC_(50)和对照组吡虫啉药剂胁迫的大豆蚜世代平均历期的比值是0.929∶1.068∶1;净增值率(R_0)的比值是0.297∶0.141∶1;周限增长率(λ)的比值是0.892∶0.798∶1;倍增时间(T_d)的比值是1.4∶2.35∶1;吡虫啉药剂胁迫大豆蚜种群产生的抗性在第2-3代差异显著,分别为1.78倍和2.23倍;LC_(30)(处理组Ⅰ)吡虫啉药剂胁迫大豆蚜种群产生的抗性在第4-5代差异显著,分别为1.61倍和1.90倍。【结论】大豆蚜对不同浓度吡虫啉胁迫的适应性存在差异。应针对施药浓度、方法制定相应的防治方案,降低大豆蚜产生抗性风险。     

褐飞虱热胁迫下内参基因的筛选及热激蛋白基因表达分析（英文）

【目的】褐飞虱Nilaparvata lugens(Stl)是为害水稻的重要害虫之一,温度是影响其暴发、迁飞的主要环境因子之一。本研究旨在探讨研究褐飞虱对高温胁迫适应性的热激蛋白基因表达调控模式。【方法】分别以不同的高温(30℃~40℃)处理褐飞虱雌、雄虫1 h和2 h,利用荧光定量PCR技术检测其体内的β-actin 1,β-actin2,β-actin3,28S rRNA,18S rRNA和α-2-tubulin 6个内参基因的表达量,用geN orm和BestK eeper软件分析确定最稳定表达的内参基因,并检测热胁迫后hsp70和hsp90基因在处理褐飞虱成虫体内的表达模式。【结果】geN orm软件分析结果表明,热胁迫后褐飞虱内参基因稳定性在雌虫体内为:β-actin1=β-actin328S rRNAα-2-tubulin18S rRNAβ-actin2;在雄虫体内为:β-actin1=β-actin3α-2-tubulin28S rRNA18S rRNAβ-actin2。BestK eeper软件分析结果显示,在热胁迫的雌、雄虫体内β-actin1均最稳定,18S rRNA次之,β-actin2最不稳定。两种软件分析结果基本一致。以β-actin1为校正内参基因,荧光定量PCR分析hsp70和hsp90在不同热胁迫条件下的表达模式,结果表明,各高温处理下hsp70表达量与对照26℃下的表达量没有显著性差异;而hsp90基因表达模式表现为被高温诱导上调表达,在雌、雄虫体内表达量达到最高的处理条件分别为40℃和38℃处理2 h。【结论】β-actin1基因可以作为热胁迫下褐飞虱雌雄虫体内基因表达模式分析的校正内参基因使用。褐飞虱hsp90基因能被高温诱导表达,该基因可能在褐飞虱适应热胁迫过程中起着重要的作用。     

粘虫hsc70克隆及其密度胁迫下的表达模式

【目的】昆虫种群密度的升高往往成为一种胁迫因子。粘虫在低密度下形成散居型,而在高密度下则形成群居型。本研通过比较hsc70在两型粘虫中的表达模式,究旨在探索hsc70在粘虫Mythimna separata响应密度胁迫中的作用。【方法】采用RT-PCR和RACE技术克隆粘虫hsc70cDNA全长序列,利用生物信息学软件分析该基因及其编码蛋白质的序列特性;运用实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)分析该基因在两型粘虫不同发育阶段(卵、1-6龄幼虫、蛹和成虫)、5龄幼虫不同组织(头、表皮、前肠、中肠、后肠和马氏管)以及群居和分离处理后mRNA表达量的变化。【结果】克隆得到的HSC70基因命名为Mshsc70(GenBank登录号:MH669276),全长cDNA长2 184 bp,开放阅读框为1 965 bp,编码653个氨基酸。序列分析发现MsHSC70具有HSP70家族典型的结构域,即IDLGTTYS(11-18aa),IFDLGGGTFDVSLL (198-211 aa)和IVLVGGSTRIPKVQQ (341-355 aa)。序列比对结果显示,MsHSC70与斜纹夜蛾Spodopteralitura,棉铃虫Helicoverpaarmigera,大螟Sesamiainferens、甘蓝夜蛾Mamestra brassicae HSC70的相似性高达99%;基于HSC70的系统发育分析显示,粘虫与夜蛾科(Noctuidae)昆虫的亲缘关系最近。Mshsc70在两型粘虫的各个发育阶段均表达,hsc70的表达量在1龄和5龄中的表达量较散居型显著上调,而在2-3龄中的表达量显著下调。除表皮和前肠外,群居型粘虫的其他组织中hsc70的表达量显著高于散居型。散居型粘虫经群聚饲养36h后,hsc70显著上调表达,表达量是对照的3.17倍,而群居型粘虫经分离饲养36 h后,hsc70的表达量与对照无显著差异。【结论】粘虫的种群密度是决定粘虫hsc70表达的一个重要因子。     

温度和毒死蜱对灰飞虱雌成虫热激蛋白70和90基因的诱导表达特性研究

【目的】为了明确灰飞虱Laodelphax striatellus对温度和杀虫剂等环境胁迫因子的适应性进化机制,本文研究了高温和毒死蜱对该害虫热激蛋白70和90基因的诱导表达特性。【方法】利用生物测定法研究了灰飞虱的热激存活率和对毒死蜱的敏感性,采用实时荧光定量PCR技术测定了不同诱导温度、LC25剂量的毒死蜱诱导不同时间以及不同品系的Lhsp70-1、Lhsp70-2、Lhsp90-1和Lhsp90-2 4个基因表达量的变化。【结果】在27℃和31℃条件下,耐高温品系对毒死蜱的敏感性比对照品系分别降低1.39倍和1.95倍,42℃热激后毒死蜱抗性品系的存活率比敏感品系高23.58%。经过30、34、38和42℃热激1 h后,灰飞虱雌成虫Lhsp70-2、Lhsp90-1和Lhsp90-2的表达量分别上升1.4~2.5、1.7~3.3和1.1~2.0倍,Lhsp70-1表达量下降1.0~1.7倍;LC25剂量的毒死蜱处理0.5、8和12 h后,以上4个基因的表达量变化不显著或呈下降趋势。然而毒死蜱长期筛选后Lhsp70-2、Lhsp90-1和Lhsp90-2表达量分别上升2.32、1.53和2.28倍,高温长期筛选后Lhsp90-1表达量上升1.58倍。【结论】Lhsp90-1表达量增加很可能是灰飞虱对高温和毒死蜱产生交互适应性的重要原因。     

温室粉虱和烟粉虱3个隐种中热激蛋白基因hsp70和hsp90含量的比较分析

【目的】昆虫适应新环境的能力与其对温度的耐受能力密切相关。热激蛋白HSP70和HSP90具有提高生物体温度耐受性的功能。烟粉虱Bemisia tabaci (Gennadius)不同隐种和不同种粉虱对温度的适应能力有差异,这与它们的热激蛋白基因拷贝数的差异可能相关。【方法】利用实时荧光定量PCR方法,检测入侵型烟粉虱MED隐种和MEAM1隐种、本地型烟粉虱AsiaⅡ1隐种以及温室粉虱Trialeurodes vaporariorum (Westwood)基因组DNA中热激蛋白基因hsp70和hsp90的拷贝数。【结果】不同种类的粉虱和烟粉虱不同隐种体内的hsp70和hsp90的含量均有较大差异,其中hsp70和hsp90拷贝数在入侵型烟粉虱MED和MEAM1隐种中含量较其他两种均高,而在土著种AsiaⅡ1隐种中含量最低,在温室粉虱中居中。此外,相同物种雌雄成虫hsp70和hsp90的拷贝数也不同,雌虫hsp70和hsp90拷贝数约为雄虫的2倍。【结论】不同种粉虱及烟粉虱不同隐种的hsp70和hsp90的拷贝数可能与其耐热性差异相关。本研究为解释不同种粉虱、烟粉虱不同隐种及其不同性别的耐热性差异机制提供了进一步的依据。     

苹果黄蚜细胞色素P450基因AcCYP6CY14的表达及其在抵抗吡虫啉中的作用

【目的】研究苹果黄蚜Aphis citricola细胞色素P450基因AcCYP6CY14的表达及其在抵抗吡虫啉中的作用。【方法】搜索苹果黄蚜转录组数据库,获得细胞色素P450基因AcCYP6CY14的cDNA部分序列,采用RT-PCR技术克隆目的基因cDNA序列全长。利用实时定量PCR(Real-time quantitative PCR,RT-qPCR)技术测定目的基因在苹果黄蚜不同发育阶段的表达水平。采用浸虫法,用浓度为LC30的吡虫啉对苹果黄蚜3龄若蚜进行诱导,RT-qPCR检测吡虫啉诱导不同时间后P450基因的表达情况。利用RNA干扰(RNAi)技术沉默苹果黄蚜3龄若蚜的P450基因,并研究该基因沉默后,苹果黄蚜对吡虫啉的敏感性。【结果】获得苹果黄蚜细胞色素P450基因的cDNA全长序列,为1 542 bp,编码513个氨基酸,命名为AcCYP6CY14(GenBank登录号:MH717248)。研究发现该基因在苹果黄蚜各个发育阶段均有表达,在3龄若蚜中表达量最高。经吡虫啉诱导12 h后,该基因的相对表达量显著高于对照。dsRNA饲喂结果显示,苹果黄蚜取食ds AcCYP6CY14 24 h后,将其转接到新鲜的苹果嫩稍上,24、48、72 h后,该基因的表达量显著下调。沉默该P450基因后,苹果黄蚜对吡虫啉的敏感性极显著升高(P0.01),死亡率提高了65.2%。【结论】克隆得到了苹果黄蚜P450基因AcCYP6CY14的cDNA全长序列,该基因在苹果黄蚜整个生育期均有表达,且在3龄若蚜中表达量最高,推测该基因可能参与了苹果黄蚜对吡虫啉的解毒代谢。     

嗜热四膜虫五个hsp70基因的表达分析

鉴定得到嗜热四膜虫13个含有完整保守结构域的hsp70基因,对其中5个高度相似且无内含子的hsp70基因进行表达分析。在37、39和41℃热激条件下,实时荧光定量PCR结果表明,hsp70-2基因对热激响应最敏感。在四膜虫生长、饥饿和接合生殖这3种生理或发育状态下,Microarray结果显示,hsp70-4基因恒定且高表达;在热激条件下,hsp70-4基因的表达水平随着温度的升高而略微增加,证实hsp70-4基因为热休克相关蛋白hsc70基因;克隆的hsp70-4基因全长2208bp,开放阅读框长1959bp,编码653个氨基酸。Microarray结果提示,hsp70-3可能参与四膜虫饥饿早期(0～12h)的耐受和接合生殖后期(6～10h)的新大小核形成,老大核凋亡等事件;hsp70-5可能参与四膜虫饥饿晚期(12～15h)的耐受和接合生殖早期(0～6h)的小核减数分裂、小核交换和原核(pronuclear)融合事件。Blast2GO分析表明,与hsp70-3和hsp70-5共表达的基因分别参与不同的生物学过程,进一步反映了hsp70-3和hsp70-5这两个基因在功能上是存在差异的。     

Cloning of heat shock protein genes from the brown planthopper,Nilaparvata lugens,and the small brown planthopper,Laodelphax striatellus,and their expression in relation to thermal stress

Three heat shock protein (HSP) genes (hsp70, hsc70, hsp90) were partially cloned from the brown planthopper Nilaparvata lugens and the small brown planthopper Laodelphax striatellus (Homoptera: Delphacidae), which are serious pests of the rice plant. Sequence comparisons at the deduced amino acid level showed that the three HSPs of planthoppers were most homologous to corresponding HSPs of dipteran and lepi‐dopteran species. Identities of both heat shock cognate 70 and HSP90 were higher than HSP70 in both species. Identity of the HSP70 between the two planthopper species was only 81%, a value much lower than seen among fly and moth groups. Effects of heat and cold shocks were demonstrated on expression of the three hsp genes in the two planthopper species. Heat shock (40 °C) upregulated the hsp90 level but did not change the hsc70 level in either the nymph and adult stages of either species. On the other hand, the hsp70 level was only upregulated in L. striatellus. This heat shock response was prompt and lasted only for 1 h after treatment. In contrast, cold shock at 4°C did not change the expression levels of any hsp in either species.