小菜蛾应对球孢白僵菌感染的免疫应答基因分析

通过室内生物测定,筛选对小菜蛾Plutella xylostella具有高毒力的球孢白僵菌Beauveria bassiana菌株,分析小菜蛾应对球孢白僵菌浸染的免疫应答基因。采用新一代Illumina高通量测序技术对接种/感染48h与未接种的小菜蛾样品分别进行转录组测序,筛选差异表达基因;结合生物信息学分析差异表达基因的功能、分类及涉及的信号通路等。结果表明接种小菜蛾48h后诱导2 434个基因发生差异表达,包括1 080个上调基因和1 354个下调基因。GO分类结果表明,这些差异表达基因（DEGs）被注释到45个GO term中,包括23个生物学过程,12个细胞组分和10个分子功能。KEGG分析表明,1 308个DEGs被富集到25个功能途径,这些DEGs包括497个上调基因和811个下调基因。分析发现,DEGs编码蛋白包含肽聚糖识别蛋白、丝氨酸蛋白酶55、丝氨酸蛋白酶抑制剂以及细胞色素P450 6K1类的免疫相关蛋白。另外,组蛋白、磷酸泛酰半胱氨酸脱羧酶、双链RNA结合蛋白、黑芥子酶等基因在球孢白僵菌侵染过程中也高表达,推测这些基因可能参与小菜蛾应对球孢白僵菌侵染的免疫反应。研究结果为进一步研究小菜蛾免疫相关基因的功能奠定了基础。     

家蚕病原球孢白僵菌的原生质体再生回复及核型分析

家蚕病原球孢白僵菌（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ ｂａｓｓｉａｎａ）原生质体的分离制备、性状及再生回复,并用脉冲凝胶电泳（ＰＦＧＥ０技术分析了其核型。以６ｍｇ／ｍＬ Ｄｒｉｓｅｌａｓｅ为酶解液,０．７ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ液（ｐＨ５．８）为渗透压稳定剂,在３０℃下轻轻振荡处理幼嫩菌丝１．５ｈ,是的生质体分离的适宜条件。原生质体的无核率为２６．５％,有核率为７３．５％,其中单核率为５３．５％。再生回复的形式可观     

感染球孢白僵菌的烟粉虱若虫免疫应答转录组分析

【目的】筛选烟粉虱Bemisia tabaci(Gennadius)若虫应对白僵菌Beauveria bassiana侵染的应答基因,以进一步研究烟粉虱免疫反应的分子机制。【方法】采用新一代高通量测序技术对感染和非感染白僵菌的烟粉虱4龄若虫进行了测序分析,并筛选了差异表达基因;利用生物信息学工具对转录组测序得到的基因进行了功能注释、分类以及参与的信号通路展示。【结果】组装得到非冗余Unigene 232 554个,其N50和N90分别为1 153 bp和260 bp,平均长度为67 424 bp。对所有的基因进行差异表达分析发现:以P<0.05为标准筛选得到了1 166个差异表达基因,其中上调表达基因有474个,下调表达基因有692个,其中,与免疫相关的基因有405个;GO富集分析发现:有416个GO term有富集现象,包括156个生物学过程(66 402个Unigenes),89个细胞组分(27 645个Unigenes)和154个分子功能(73 417个Unigenes);KEGG代谢通路分析将烟粉虱转录组1 145个DEG匹配到309个通路上,其中76个通路得到了富集。【结论】对405个可能参与到烟粉虱若虫对白僵菌侵染的免疫识别和防御的基因进行了测序。研究结果为从分子水平上开展应用虫生真菌防治烟粉虱的研究奠定信息学基础。     

球孢白僵菌毒素对家蚕糖代谢水平的影响

为明确球孢白僵菌毒素对宿主昆虫糖代谢水平的作用,本研究检测了家蚕幼虫感染球孢白僵菌和注射球孢白僵菌毒素之后组织中海藻糖和糖原含量的变化,以及糖代谢相关基因表达水平的变化;分析了注射毒素和添食海藻糖之后对家蚕幼虫存活率的影响、以及添加毒素之后对BmN细胞的损伤作用。结果表明,家蚕幼虫感染球孢白僵菌和注射毒素后海藻糖和糖原含量显著降低;Bombyxin A2和BmIBP2基因显著上调表达,而糖代谢酶系基因则显著下调表达。注射毒素显著降低家蚕5龄幼虫的存活时间,而补充海藻糖能够延长家蚕幼虫的存活时间。添加毒素能够使家蚕BmN细胞发生凝集作用而最终崩解死亡,并诱导Bombyxin A2和BmIBP2基因显著上调表达以及糖代谢酶系基因显著下调表达。以上结果说明,球孢白僵菌可能通过分泌毒素,作用于家蚕类胰岛素信号通路,调节家蚕自身糖类物质的代谢与合成,破坏家蚕能量代谢与储存平衡,引起家蚕组织细胞凋亡并最终导致家蚕死亡。本研究结果对农林害虫的生物防治、家蚕等经济昆虫僵病防治技术的研究以及球孢白僵菌毒素用于新型降糖药物的筛选和中药僵蚕的开发利用均具有重要意义。     

家蚕病原球孢白僵菌的原生质体再生回复及核型分析

家蚕病原球孢白僵菌（Beauveriabassiana）原生质体的分离制备、性状及再生回复,并用脉冲凝胶电泳（PFGE）技术分析了其核型。以6mg／mLDriselase为酶解液,0.7mol／LNaCl液（pH5.8）为渗透压稳定剂,在30℃下轻轻振荡处理幼嫩菌丝1．5h,是原生质体分离的适宜条件。原生质体的无核率为26．5％,有核率为73.5％,其中单核率为53.5％。再生回复的形式可观察到三种,其培养基的渗透压稳定剂以0.7mol／L葡萄糖较为适当。球孢白僵菌至少具有6条染色体,估算大小为2.5～6.6Mb,核型大小为26.5Mb。     

家蚕抗真菌因子BmSPI39对球孢白僵菌入侵的表达响应

[目的]制备家蚕Bombyx mori抗真菌因子BmSPI39的多克隆抗体,分析BmSPI39对球孢白僵菌Beauveria bassiana入侵的表达响应.[方法]利用原核表达和固定化镍离子亲和层析技术获得高纯度的BmSPI39重组蛋白,利用胶内活性染色检测重组蛋白BmSPI39对枯草杆菌Bacillus subti...     

球孢白僵菌中聚酮合酶基因多样性分析

本研究利用基因挖掘技术从球孢白僵菌(Beauveria bassiana)基因组中获得聚酮合酶(PKS)基因,并对这些基因序列进行生物信息学分析预测其功能,同时检测这些基因在不同培养基培养条件下的表达情况。结果显示:球孢白僵菌中含有13个PKS(Bdass1~13)基因,结构域分析显示球孢白僵菌中有还原型PKS 8个,非还原型PKS 2个,杂合型NRPS/PKS 3个;聚类分析显示Bdass8参与卵孢白僵菌素生物合成,Bdass5可能参与洛伐他汀九酮体的生物合成、Bdass4可能参与伏马菌素的生物合成、Bdass11可能参与phenolthiocerol的生物合成;非还原型PKS中Bdass7和Bdass10可能参与分生孢子色素的合成,Bdass1、Bdass2、Bdass3、Bdass6、Bdass9、Bdass12、Bdass13分别与其他未知聚酮合酶形成独立的分支;不同的PKS基因在不同培养基培养条件下其表达情况差异非常显著,如Bdass8、Bdass10和Bdass11在5种培养基上均强烈表达,Bdass4、Bdass6在5种培养基上微弱表达,Bdass1、Bdass5、Bdass11、Bdass12、Bdass13仅在几种培养基上表达,Bdass2仅在INO培养上微弱表达,Bdass3、Bdass7在5种培养基上均不表达。该研究为球孢白僵菌中PKS基因的功能鉴定奠定基础。     

球孢白僵菌Pr1蛋白酶基因cDNA克隆与序列分析

从球孢白僵菌菌株Bb202中克隆了昆虫蛋白酶Pr1的基因。使用特异性引物,分别以基因组DNA和mRNA为模板进行PCR反应,得到了球孢白僵菌的Pr1蛋白酶基因cDNA和结构基因序列。测序结果表明球孢白僵菌Pr1蛋白酶结构基因全长大小为1606bp,含有3个内含子,分别为69、61和68bp。其ORF全长1140bp,预测编码379个氨基酸残基。成熟蛋白理论分子量为38.8kD,理论等电点为8.06。为进一步研究球孢白僵菌Pr1基因,并构建高毒力工程菌株提供了理论基础。     

球孢白僵菌数量性状的典型相关分析

来源不同的球孢白例僵菌株的生物学性状（培养特征、产孢量、菌落生长速率及孢子萌发中时）、生态学性状（毒力、水分活性、紫外照射活率、水浴活率）及生物化学性状（草酸水平、蛋白酶产量、几丁质酶产量、葡萄糖苷酶产量、酯酶及脂肪酶产量）经观察测定,共得到１５个指标。对不同性状圾其组合进行典相关分析,结果表明生物学性状与生态学性状的相关主要为产一与菌株毒力及孢子水浴活率之间的相关生物学与生物化学性状间的相关主要     

两广地区家蚕白僵菌的SSRs遗传多样性

为查明广东和广西地区家蚕Bombyx mori病原白僵菌的来源及其菌株间的相互关系, 本研究利用了微卫星标记（simple sequence repeats, SSRs）技术, 分别对采自广东、 广西蚕区的白僵菌菌株居群之间和居群之内的遗传多态性进行了研究。结果发现, 两广白僵菌居群之间的基因分化系数（Gst）是0.0590, 多态位点百分率（PPL）为97.73%, Nei氏基因多样性指数（H）为0.1896, Shannon氏信息多样性指数（I）为0.3165, 表明两广家蚕来源的白僵菌居群间的遗传分化较小; 两个居群内部的遗传多态性研究结果分别是广东白僵菌居群的PPL=68.18%, H=0.1910, I=0.3044, 而广西白僵菌居群的PPL=65.91%, H=0.1713, I=0.1791, 表明广东白僵菌居群的遗传多样性水平较高, 广西白僵菌居群遗传多样性水平相对较低。最后, 利用Nei氏遗传距离进行了两广地区白僵菌菌株间地理来源关系的聚类分析, 结果表明实验室保存菌株单独聚为类群Ⅰ, 而不同采集地的菌株聚为类群Ⅱ。结果反映了生产来源的白僵菌菌株存在遗传多态性和基因分化现象, 暗示了家蚕白僵病病原来源的复杂性, 还说明应用SSRs技术进行家蚕白僵病病原的溯源是一条可行的途径。     

细菌感染后家蚕幼虫中肠差异表达基因的鉴定（英文）

作为遭遇各种微生物的前线, 昆虫的消化道在免疫反应中起到重要的作用。为了研究家蚕Bombyx mori肠道免疫反应, 我们利用基于ACP (annealing control primer)的反转录PCR技术, 从中肠组织中鉴定得到18个在经口器感染绿脓杆菌Pseudomonas aeruginosa 和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus后的差异表达基因,并利用荧光定量PCR分析了其中4个基因在感染后24 h内的动态变化。结果表明： 肽聚糖识别蛋白-L1（PGRP-L1)和一个丝氨酸蛋白酶前体基因特异性地受绿脓杆菌感染后上调; 30kP蛋白酶A基因受绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌2种细菌感染后上调。我们的研究鉴定了经口器感染后家蚕中肠中参与入侵细菌识别和免疫信号途径的基因, 可为对这些基因进一步的功能研究提供线索。     

家蚕半乳糖凝集素BmGalectin-4的表达、纯化及性质分析

【目的】鉴定一种新的家蚕Bombyx mori半乳糖凝集素(galectin)基因,分析其序列和结构特征,测定其在微生物感染后的表达变化,分析其重组表达蛋白与微生物及微生物表面多糖分子的结合特性。【方法】利用TBlastN从家蚕基因组数据库中搜索得到一种新的半乳糖凝集素基因,命名为BmGalectin-4。利用生物信息学分析其序列和结构特征,用半定量RT-PCR检测家蚕分别感染病原菌绿脓杆菌Pseudomonas aeruginosa、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus和白色念珠菌Candidiasis albicans后BmGalectin-4在不同组织中的表达变化,采用原核表达技术对该基因进行重组表达,并利用亲和层析得到纯化的蛋白。通过ELISA检测BmGalectin-4与细菌和真菌的结合;通过Western blot检测它与多糖的结合。【结果】序列分析显示,BmGalectin-4是一种串联重复型半乳糖凝集素,含有2个糖识别结构域,其结构非常保守。RT-PCR检测表明,BmGalectin-4在家蚕脂肪体、血细胞和中肠中都有表达,且感染细菌和真菌后其表达有显著变化。纯化的重组BmGalectin-4与革兰氏阳性菌、阴性菌和真菌有较强的结合,与微生物表面多糖的结合试验表明其识别有较高的特异性。【结论】BmGalectin-4 是一个典型的串联重复型半乳糖凝集素,可能参与家蚕对病原微生物的免疫防御反应。本研究为进一步研究昆虫中半乳糖凝集素的功能奠定了基础。     

芸香苷对家蚕谷胱甘肽-S-转移酶部分基因的诱导表达

谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-S-transferases, GSTs) 是对一种机体的解毒代谢起重要作用并可以被诱导的酶系。为了从分子水平上探究家蚕Bombyx mori GSTs 基因与植物次生物质芸香苷代谢的关系, 本实验采用双跟踪标定定量PCR (dual-spike-in qPCR)方法, 用 5×10^-1, 5×10^-2, 5×10^-3 ng/μL 3 个浓度芸香苷溶液处理家蚕5龄幼虫, 并对各组织中 GSTs Epsilon 家族不同基因的转录水平进行检测。结果显示, 浓度为 5×10^-2 ng/μL 的芸香苷溶液能诱导GSTs 基因的转录水平发生显著变化。在中肠中, BmGSTe1, BmGSTe2 和 BmGSTe6的诱导转录水平较高, 在诱导后24 h达到最大值; 在脂肪体中BmGSTe1, BmGSTe6和BmGSTe7的转录水平相对较高且分别在诱导后 2 h, 2 h和4 h 达到最大值; 而GSTs基因在马氏管中表达量均很低或者检测不到表达。与 5×10^-2 ng/μL 浓度相比, 5×10^-1 ng/μL 的芸香苷溶液诱导后各基因的转录水平上升的幅度较小并且达到峰值的时间不同, 而 5×10^-3 ng/μL 浓度的芸香苷溶液并不能使GSTs基因的诱导转录水平发生变化。结果提示, 家蚕 GSTs Epsilon 家族基因对芸香苷的代谢具有重要作用。     

家蚕复眼突变系光泽眼（lu）和光泽小眼（ve）的复眼形态观察

家蚕Bombyx mori复眼突变系光泽眼(lustrous, lu）及光泽小眼(varnished eye, ve）都是由单基因控制的隐性突变, 目前为止, 其突变基因及突变机理还未知。为了了解其复眼突变性状内外部形态结构差异, 本研究以家蚕正常品系大造Dazao （Dz）为对照, 利用光学显微镜及扫描电镜对家蚕Dz, lu和ve的成虫复眼和幼虫单眼表面进行观察, 并利用石蜡切片HE染色技术对3个品系复眼内部结构进行观察。结果表明： 突变体lu和ve的复眼表面形态除了典型的富有光泽外, 复眼形状、 大小和小眼形态、 排列及数量上都与正常型明显不同。突变体lu和ve的角膜、 晶锥、 感杆束及色素细胞均发生了异常。lu和ve不仅是复眼表面形态发生了变化, 其内部结构也发生了很大的变化。本研究为lu和ve突变基因的克隆及突变机理的阐明提供了参考信息。     

氟化物对家蚕耐氟和氟敏感品种肠道中留存产酶菌群落组成和多样性的影响

【目的】研究氟化物对家蚕Bombyx mori肠道内留存产酶菌的影响, 有助于了解家蚕耐氟和氟敏品种的耐氟力差异。【方法】分别给家蚕耐氟品种T6和氟敏品种734添食NaF溶液浸泡后的新鲜桑叶, 至5龄第3天取材。采用筛选培养基筛选产蛋白酶、 纤维素酶、 脂肪酶、 淀粉酶的菌株, 并结合16S rDNA系统发育关系, 对菌株进行分类鉴定。【结果】家蚕肠道内产消化酶细菌有芽孢杆菌属Bacillus、 葡萄球菌属Staphylococcus、 肠杆菌属Enterobacter和不动杆菌属Acinetobacter和微小杆菌属Exiguobaterium, 其中芽孢杆菌Bacillus sp.、 葡萄球菌Staphylococcus sp. 和不动杆菌Acinetobacter sp.细菌可同时产4种酶。氟中毒后T6肠道内产酶菌由5种减少到4种, 734肠道内产酶菌由2种减少到1种。【结论】家蚕肠道内留存的产酶菌与家蚕自身的耐氟能力相关。     

低温冷藏提高家蚕滞育卵NAD含量和胞质苹果酸脱氢酶活性

为了调查5℃低温处理是否改变家蚕Bombyx mori卵滞育NAD代谢, 本研究利用HPLC和分光光度法测定了经25℃和5℃分别处理的滞育卵中NADH 含量、 NAD⁺含量、 乳酸脱氢酶（LDH）活性和胞质苹果酸脱氢酶（cMDH）活性。结果表明： 5℃处理的NAD（NADH + NAD⁺）含量和cMDH活性分别增加了106%和53%, 并且显著高于25℃处理（P< 0.01）; 但是两种处理的NADH/NAD⁺比值和LDH活性没有显著差异（P> 0.05）。据此推测, 5℃低温处理加强了家蚕滞育卵NAD⁺合成和再生能力。     

家蚕生物钟基因Bmcryl与Bmcry2的克隆及生物信息学分析

隐花色素基因(cryptochrome gene,Cry)是已确认的主要生物钟基因之一,它广泛分布于细菌和真核生物中.昆虫Cry基因分为Cry1,和Cry2两类,果蝇只有Cry1,蜜蜂等膜翅目昆虫只有Cry2.为了研究鳞翅目模式昆虫家蚕Bombyx mori的昼夜生物钟分子调控机制和昆虫CRY蛋白的进化,本研究克隆了家...     

PI3K和受体型酪氨酸激酶介导家蚕麻痹肽免疫诱导信号的传递

【目的】普遍存在于鳞翅目昆虫中的ENF肽具有非常相似的结构和生理功能, 对昆虫的发育、 免疫、 应激反应等方面都起着重要的调控作用。有研究报道, 作为ENF肽家族成员之一的家蚕Bombyx mori麻痹肽（paralytic peptide, PP）通过激活MAPK来调控家蚕的免疫应答, 但其完整的分子作用机制尚不明确。本研究旨在解析传递家蚕PP免疫诱导信号的分子通路。【方法】首先通过荧光定量PCR检测了多种昆虫细胞系在PP诱导下抗菌肽基因的转录水平, 并利用Western blot检测p38 MAPK的磷酸化水平, 然后利用不同信号传递分子的抑制剂处理BmE细胞筛选参与传递PP免疫诱导信号的分子。【结果】PI3K抑制剂LY294002和受体型酪酸激酶抑制剂Genistein抑制了PP对BmE细胞抗菌肽基因表达的诱导作用; 且BmE细胞和家蚕血细胞在PP的诱导下, Akt和大小约为70 kDa的细胞膜蛋白均出现磷酸化水平的动态变化。【结论】PI3K/Akt信号通路和Genistein敏感性的受体型酪氨酸激酶介导了PP免疫诱导信号的传递。     

镉胁迫对家蚕脂肪体脂质过氧化物含量及抗氧化酶活性和mRNA表达的影响

【目的】探讨鳞翅目模式昆虫家蚕Bombyx mori作为重金属污染的监测指示生物在镉胁迫下的酶反应及相关的基因表达。【方法】给家蚕幼虫期全龄添食镉(Cd²⁺), 调查不同性别家蚕5龄幼虫脂肪体中脂质过氧化物丙二醛（MDA）的含量, 超氧化物歧化酶（SOD）、 过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性及其基因表达水平的变化。【结果】Cd²⁺胁迫对雌雄家蚕MDA 含量均具有浓度效应关系, MDA含量随Cd²⁺胁迫浓度的升高而增加。Cd²⁺胁迫下, SOD和CAT活性表现为先升后降的变化趋势, Pearson相关性分析显示SOD和CAT活性变化有显著相关性(雄: R=0.770, P=0.001; 雌: R=0.854, P=0.000）。雌性家蚕脂肪体中CAT活性变化和Cat mRNA水平的表达具有正相关性（R=0.712, P=0.003）。雄性家蚕脂肪体中GSH-Px活性随Cd²⁺胁迫浓度的升高而增加, 显示浓度 效应关系, 12.5~50 mg/kg Cd²⁺胁迫组GSH-Px活性与对照相比有显著差异（P<0.05）, 其活性和GSH-Px mRNA水平的表达具有正相关性（R=0.834, P=0.000）; 雌性家蚕脂肪体中GSH-Px活性表现为先升后降的变化趋势, 12.5 mg/kg Cd²⁺胁迫组GSH-Px活性与对照相比有显著增加（P<0.01）。【结论】结果表明, 急性镉胁迫对家蚕脂肪体有明显的毒性作用, 其作用机制与脂质过氧化加剧和抗氧化酶活性变化有关。家蚕对重金属镉的解毒机制有性别相关性。