多重实时荧光PCR检测牛、山羊和绵羊源性成分

根据牛、山羊和绵羊线粒体细胞色素b基因序列, 设计特异性引物和以不同荧光素标记的Taqman探针。通过对PCR反应体系和反应条件的优化筛选, 建立能同时鉴别牛、山羊和绵羊源性成分的多重实时荧光PCR方法。采用本文方法与国标GB/T 20190-2006方法分别对17种不同源性动物DNA和200份不同来源样品DNA进行牛羊源性成分检测, 数据显示两者检测结果符合率达100%, 特异性相当。与国标方法相比, 本试验方法不需电泳、酶切和测序, 即可在一个PCR反应中同时鉴别检测牛、山羊和绵羊3种源性成分, 检测效率提高近3倍; 灵敏度更高, 比国标方法灵敏10倍; 适用性更广, 除了饲料, 还适用于肉品、奶品、生皮和动物油脂等动物产品的牛羊源性成分检测。     

实时荧光PCR技术检测肉骨粉中牛羊源性成分的方法

建立了从肉骨粉中提取DNA的稳定、简便易操作的方法。根据牛、羊线粒体DNA基因片段设计特异性引物和Taq Man探针,建立了实时荧光PCR技术检测肉骨粉中牛、羊源性成分的快速、特异、敏感的方法。     

Taqman多重实时荧光PCR同步定量检测6种动物源性成分方法的建立

旨在建立一种可同时检测猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅6种动物源性成分的六重实时荧光定量PCR方法。根据猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅细胞核基因组保守序列,参照序列比对结果选择差异位点设计6对特异性引物和6条以不同荧光素标记的Taqman探针。通过对PCR反应体系和反应条件的优化筛选,建立能同步定量检测猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅源性成分的六重实时荧光PCR方法。应用此方法分别对18种不同源性动物DNA和200份不同来源样品进行猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅源性成分检测,结果表明,所建立的六重实时荧光PCR方法灵敏度高,对六种动物的最低核酸检测量分别为0.049ng、0.048ng、0.085ng、0.13ng、0.162ng、0.074ng(50μl体系);特异性强,对狗、兔、鼠、驴、马、骆驼等其他12种动物无特异性扩增;200份样品的检测结果表明六重qPCR检测方法敏感,同一反应体系下实现一次对6种动物快速定量检测,耗时短、效率高、适用性广,可用于肉品、奶品、皮毛和饲料等动物产品猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅源性成分单一或混合物种的鉴别诊断。     

食品及饲料中马属动物源性成分的PCR检测研究

采用马和驴mtDNA中特异性片段引物 ,利用聚合酶链反应技术 (polymerasechainreaction ,PCR) ,建立了饲料中马属动物源性动物成分的快速检测方法。通过内切酶HaeⅢ、Sau3A和AluⅠ可对扩增结果进行验证并能够区分马成分和驴成分。扩增产物测序结果表明 :驴扩增产物序列与数据库序列完全一致 ,马样品扩增产物与数据库序列的同源性达 99%。该方法的检测低限分别为 0 5 %(w w)和 0 2 5 %(w w) ,可作为食品及饲料中马属动物成分鉴别检测的有效方法。     

鳕鱼成分的实时荧光PCR检测方法

研究建立了鳕鱼成分的实时荧光PCR检测方法。依据鳕鱼的16S rRNA基因序列设计一对PCR引物及探针,对12种鳕鱼样品和71种非鳕鱼动植物样品进行实时荧光PCR检测,结果显示,只有12种鳕鱼样品产生荧光信号,其他非鳕鱼样品均不产生荧光信号,实验表明此方法具有特异性,其检测限为0.01 ng/μl鳕鱼DNA和0.01%鳕鱼肉粉。对市售的鳕鱼样品进行实际样品检测,均能很好地检出鳕鱼成分。此法特异性强,灵敏度高,可作为鳕鱼成分鉴定的检测方法。     

实时荧光PCR检测食品中致敏原芥末成分

对植物原料产品和植物源性食品中芥末成分的快速鉴定是避免过敏性疾病发生的重要措施。依据芥末Sin A1管家基因的核酸序列设计特异性引物和探针,对3种芥末样品和21种非芥末植物样品进行实时荧光PCR检测,结果显示,过敏原芥末管家基因的样品FAM通道有荧光信号检出,非芥末样品FAM通道均无荧光信号检出。灵敏度实验表明,植物原料产品中对芥末的检测低限可达到1 mg/kg。此外对市售的芥菜籽等样品和深加工的芥末致敏原参考物质(葡萄糖)进行实际样品的检测,均能很好检出致敏原芥末成分。     

基于实时荧光PCR方法的牦牛肉源性成分鉴别

为了建立牦牛肉源性检测的实时荧光PCR方法,本研究基于比较牦牛与黄牛、鸡、猪、羊、鸭等动物的Cytb基因序列差异,设计其特异性引物.特异性实验结果表明,猪肉、鸡肉和黄牛肉的DNA均不与引物发生交叉反应;灵敏度实验表明方法的最低检出限可达0.004 ng/μL;抗干扰实验结果表明,当牦牛肉的添加量为1％时仍可检出;对市场...     

实时荧光定量PCR技术在转基因食品检测领域中的应用

随着基因工程技术在农业生产中应用的深入,越来越多具有改良特征的转基因植物在全球范围内得到广泛种植,随之而来的转基因食品也迅猛发展,转基因产品大规模商业化引起了对安全性问题的担忧。为保证转基因产品标签制度的顺利实施,建立快速、准确、高通量的定量检测方法十分必要。我们综述了国内外转基因食品检测技术的研究进展,重点阐述了实时荧光定量PCR技术在转基因食品检测领域中的应用,并展望了通过构建质粒标准分子的方法来实现对更多转基因植物品系的定量检测。     

可可粉中几种外源植物源性成分的PCR检测

大豆粕、芝麻粕、花生壳和板栗壳是常见的几种可可粉外源掺假成分,根据它们所特有的基因片段设计引物,以高等植物18S rDNA基因为内参照基因,应用改良CTAB法抽提材料DNA,对分离的DNA进行PCR扩增并分析,建立了可可粉中这几种外源植物成分的快速检测方法。用建立的PCR方法对可可基因组进行扩增,均无特异条带;扩增出的PCR产物测序结果表明与目标片段一致;将各材料DNA倍比稀释,分别对各个稀释度的DNA进行PCR扩增。结果表明,该方法对大豆粕、芝麻粕、花生壳和板栗壳DNA检测的敏感度分别可达82．5pg／μl、32．5pg／μl、124pg／μl和157pg／μl。模拟样品试验发现,该方法的最低检测限（w／w）分别达0．5％、0．5％、5％和5％,可作为可可粉及其制品中这几种外源成分鉴别检测的有效方法。     

实时荧光PCR快速检测食品中致敏原芹菜成分

探讨采用实时荧光PCK技术建立检测食品中致敏原芹菜成分的方法.试验结果表明:针对芹菜管家基因Mrd基因设计的特异性检测引物和探针进行检测时,31种样品经实时PCR扩增,只有芹菜和西芹样品产生阳性的荧光信号,其余样品均不产生荧光信号.灵敏度试验结果表明:该方法对芹菜致敏原基因的检测灵敏度较高,可检测到芹菜过敏原样品中10mg/kg～1mg/kg的含量.     

实时荧光定量PCR在固氮酶基因检测中的应用

实时荧光定量PCR是近年发展起来的一种新的实时定量检测特定核酸技术,它是核酸探针技术、荧光共振能量传递技术和PCR技术的有机结合。与常规PCR相比,它具有特异性更强、能有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点,扩大了PCR的应用范围。概述实时荧光定量PCR技术在固氮酶(nifH)基因检测中的应用与研究进展,并探讨该技术的发展和应用前景。     

实时荧光定量PCR在猪肺炎支原体检测中的应用

实时荧光定量PCR技术是一种利用荧光检测方法来定量核酸的技术,具有高度的灵敏性、特异性和精确性.综述了荧光定量PCR技术的基本原理及其在猪肺炎支原体检测中的应用.     

实时荧光定量PCR检测HPV—DNA在宫颈癌筛查中应用

目的：探讨HPV感染与宫颈病变的关系。方法：对2008年2月-2009年3月期间在通山县人民医院皮肤性病科和妇科门诊就诊的1256位女性的宫颈拭子标本进行HPV DNA实时荧光定量PCR检测,比较不同宫颈病变级别组HPV的阳性率。结果：各病变组与正常组比较差异有显著性,P〈0.01,且随病变级别增加总阳性率逐渐上升。结论：HPV在人群具有较高的感染率,且HPV感染与宫颈病变的发生有关。实时荧光定量PCR检测HPV DNA可成为一种广泛应用的临床检验技术,作为筛查宫颈癌及癌前病变的首选方法。     

实时荧光定量PCR及RT-PCR与常规PCR及RT-PCR检测对虾病毒效果的比较

常规PCR及RT-PCR已用于对虾DNA及RNA病毒检测,但存在费时、灵敏度较低、不能定量等问题。建立了TaqMan实时荧光定量PCR及RT-PCR方法,分别用于检测白斑综合症病毒(WSSV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)及桃拉综合征病毒(TSV)、黄头病毒(YHV)4种对虾病毒。与常规PCR及RT-PCR比较,所建立的TaqMan实时荧光定量PCR及RT-PCR检测上述4种对虾病毒不仅有很高的特异性,检测灵敏度也提高了10～100倍,同时还具有快速、简便、不污染环境、重复性好、实时定量等优点,可明显提高对虾病毒检验检疫工作质量及效率。     

实时荧光定量PCR技术在SPF鸡四种垂直传播疾病监测中的应用

目的探讨荧光定量PCR检测技术对SPF鸡四种垂直传播病毒的检测应用。方法采集60份SPF鸡及70份普通鸡群蛋清、泄殖腔试子样品,提取样品核酸,分别进行ARV、REV、CAV、ALV四种病毒实时荧光定量PCR检测,根据标准曲线及溶解曲线分析判读样品病毒拷贝数。结果 SPF鸡ALV 2份阳性,检出率3.3%,其余病毒检测均为阴性;普通鸡样品REV检测2份阳性,检出率2.9%,ALV 10份阳性,检出率14.3%。结论荧光定量PCR检测方法最低可检测到100个拷贝核酸,检测灵敏度较高,有望应用于SPF鸡临床样品的病原检测。     

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)¹. These cells play an important role in pathologies of many diseases associated with neuroinflammation such as multiple sclerosis (MS)². Microglia in a normal CNS express macrophage marker CD11b and exhibit a resting phenotype by expressing low levels of activation markers such as CD45. During pathological events in the CNS, microglia become activated as determined by upregulation of CD45 and other markers³. The factors that affect microglia phenotype and functions in the CNS are not well studied. MicroRNAs (miRNAs) are a growing family of conserved molecules (~22 nucleotides long) that are involved in many normal physiological processes such as cell growth and differentiation⁴ and pathologies such as inflammation⁵. MiRNAs downregulate the expression of certain target genes by binding complementary sequences of their mRNAs and play an important role in the activation of innate immune cells including macrophages⁶ and microglia⁷. In order to investigate miRNA-mediated pathways that define the microglial phenotype, biological function, and to distinguish microglia from other types of macrophages, it is important to quantitatively assess the expression of particular microRNAs in distinct subsets of CNS-resident microglia. Common methods for measuring the expression of miRNAs in the CNS include quantitative PCR from whole neuronal tissue and in situ hybridization. However, quantitative PCR from whole tissue homogenate does not allow the assessment of the expression of miRNA in microglia, which represent only 5-15% of the cells of neuronal tissue. Hybridization in situ allows the assessment of the expression of microRNA in specific cell types in the tissue sections, but this method is not entirely quantitative. In this report we describe a quantitative and sensitive method for the detection of miRNA by real-time PCR in microglia isolated from normal CNS or during neuroinflammation using experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a mouse model for MS. The described method will be useful to measure the level of expression of microRNAs in microglia in normal CNS or during neuroinflammation associated with various pathologies including MS, stroke, traumatic injury, Alzheimer''s disease and brain tumors.     

Detection and quantification of hepatopancreatic parvovirus in penaeid shrimp by real-time PCR assay

As one of the major pathogens, hepatopancreatic parvovirus (HPV) can cause severe diseases in penaeid shrimp. We developed a TaqMan-based real-time PCR assay for the HPV detection in China. A pair of primers (HPVF and HPVR) and a TaqMan probe were designed according to the HPV genomic sequence of Chinese isolate (GenBank: GU371276). Our data showed that the primers and TaqMan probe were specific for HPV, and they exhibited no cross-reaction with infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV), white spot syndrome virus (WSSV) and specific pathogen free (SPF) shrimp DNA. The assay had a detection limit of four plasmid HPV DNA copies per reaction. Furthermore, HPV was detected in 16 of 21 Fenneropenaeus Chinensis, 3 of 52 Litopenaeus vannamei and 2 of 2 Marsupenaeus japonicus penaeid shrimp samples. In addition, HPV was also detected in crabs. Therefore, this assay could be successfully used as a sensitive and rapid molecular-based diagnostic method to screen HPV-free animals and survey the prevalence of HPV in cultured populations of penaeid shrimp in China.