应用转化细胞分泌的乙型肝炎病毒e抗原检测人血清中的乙型肝炎病毒e抗体

应用乙型肝炎病毒核心抗原基因转化的小鼠L细胞分泌的乙型肝炎病毒e抗原,采用ELISA法与Abbott公司抗-HBe EIA诊断盒平行比较,检测了31份抗-HBe阳性和19份抗-HBe阴性的人血清,结果完全相符。经多次重复试验,本法的OD490nm值的误差不超过8％。OD490nm值与血清稀释度之间呈直线关系。细胞培养液不经纯化即可应用,一般做1:4稀释。细胞分泌的抗原无感染性,价格低廉,不会因结合人血清蛋白而产生非特异性反应。因此比一般诊断盒中所用的人血清HBeAg有很大的优越性。     

乙型肝炎病毒e抗原定量检测的性能验证和临床应用探索

乙型肝炎病毒e抗原(hepatitis B e antigen, HBeAg)的定量检测对乙型肝炎临床诊疗具有一定的重要性,但其定量检测还未成为常规检验项目。本研究对HBeAg定量检测系统进行性能验证,比较HBeAg定量和定性检测的相关性和一致性,分析HBeAg定量结果和乙型肝炎病毒DNA(hepatitis B virus DNA, HBV DNA)的关系,为HBeAg定量检测在临床诊疗的应用提供依据。通过收集710例2019年3月至5月于复旦大学附属华山医院就诊的慢性乙型肝炎患者血清样本,参照美国临床实验室标准化协会(The Clinical & Laboratory Standards Institute, CLSI)相关文件的要求,对雅培ARCHITECTi4000SR全自动免疫分析仪检测的HBeAg定量试剂的精密度、分析灵敏度、线性范围/可报告范围、携带污染率进行验证和评价;采用化学发光微粒子免疫检测技术(chemiluminescence microparticle immuno assay, CMIA)对618例患者进行HBeAg定性和定量检测;采用荧光定量PCR对慢性乙型肝炎患者进行HBV DNA检测,比较HBV DNA和HBeAg定量结果的相关性。本研究证实HBeAg定量试剂检测性能验证结果良好;HBeAg定量和定性检测相关性良好;126例同时有HBeAg定量检测和HBV DNA定量检测的结果显示,两种方法呈正相关且一致性良好。HBeAg定量检测可用于常规实验室检测来辅助HBV感染的临床诊疗。     

乙型肝炎病毒e抗原的生物学功能及血清学转换的免疫学基础

目前在临床乙型肝炎的治疗中,乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)消失及其抗体的出现已成为重要的疗效指标.本文回顾了HBeAg的发现及其生物学和医学意义,对HBeAg与乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)的免疫原性进行了比较,阐述了HBeAg血清学转换的免疫学基础,并对出现HBeAg血清学转换的意义作了分析.     

乙肝e抗原在大肠杆菌中的高效表达和优化

目的:探讨乙型肝炎病毒e抗原基因在大肠杆菌中进行高效融合表达,并对表达条件进行优化和影响因素的分析.方法:从乙肝患者阳性血清中提取DNA,设计引物扩增目的基因,按常规方法克隆入pET-GST载体谷胱甘肽-S-转移酶(GST)基因的下游,获得的重组质粒转化大肠杆菌BL21,用IPTG诱导目的基因片段的表达,经超声处理后SDS-PAGE电泳.对表达条件进行正交试验优化,并分析其影响因素的大小.结果:HBeAg以包涵体形式表达出来,其表达的GST融合蛋白的分子质量大约为44KD.最佳的表达条件为温度为30℃,IPTG浓度为0.6mmol/L,诱导时间为2h.其影响因素大小依次为诱导温度＞诱导时闻＞IPTG浓度.结论:乙肝e抗原基因在大肠杆茵中获得了高效表达.     

基因工程表达的乙型肝炎病毒核心抗原转变为e抗原的研究

乙型肝炎病毒核心抗原及e抗原均为乙型肝炎病毒核衣壳的重要组成部分。自从发现病毒核心颗粒中存在着e抗原之后,它们之间的关系一直是人们研究的课题。有些报道认为,e抗原是核心抗原的组成成份。有人通过实验发现核心抗原和e抗原的氨基酸序列极其     

乙型肝炎病毒e抗原基因与绿色荧光蛋白基因的融合及其表达

质粒pS65T含有T7启动子驱动的绿色荧光蛋白突变型gfpS65T基因,经修饰后,在其中插入乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）基因,使两基因同框成为融合基因。在大肠杆菌BL21中由于T7启动子的控制,高效表达了具有双功能（抗原性和发光性）的融合蛋白（GFP－HBeAg）。融合蛋白MW为52kDa,N端有6个组氨酸残基,因而用Ni金属螯合层析柱对融合蛋白进行了分离纯化,利用诊断HBV的ELISA试剂盒检测了融合蛋白的抗原性,在荧光显微镜下观察到了融合蛋白的绿色荧光。并探讨了用其组装成新型免疫诊断试剂的可能性。     

重组人乙型肝炎病毒E抗原(HBeAg)的基因扩增与表达

本文从两例临床确诊为乙型肝炎患者的2mg肝穿刺标本中利用基因扩增方法,设计扩增出缺失羧基端34个氨基酸的乙型肝炎病毒C抗原(HBcAg)基因的0.45kb基因片段,将此片段克隆入表达载体,导入大肠杆菌中表达,结果获得每毫升培养液含有100万酶联反应单位的HBgAg,也存在1万酶联反应单位的HBcAg。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示,其表达产物占菌体总蛋白的30～37％,分子量为155kD。HBeAg基因结构及表达形式有待进一步研究和探讨。     

用杆状病毒载体在家蚕细胞中表达HBeAg基因

以ＰＣＲ技术扩增含有ＰｒｅＣ信号肽序列及完整的ＨＢｅＡｇ基因的序列（即ＨＢｃＡｇ基因５′端４４７ｂｐ）,在５′端加上合适的酶切位点,克隆到家蚕核多角体病毒转移载体ｐＢｍ０３０上,与野生型ＢｍＮＰＶＤＮＡ共转染家蚕ＢｍＮ细胞,空斑纯化后得到多角体基因失活的重组病毒。ＥＬＩＳＡ法测定表明培养液上清中ＨＢｅＡｇ效价达１∶３２０００,细胞内ＨＢｅＡｇ效价为１∶２０００,培养液及细胞内的ＨＢｃＡｇ含量极低（＜１∶１６０）。研究结果表明,ＢｍＮ细胞能正确识别与切割ＨＢｅＡｇ信号肽序列,所表达的ＨＢｅＡｇ效价高,纯度好,明显优于大肠杆菌表达系统     

家蚕BmN细胞的微载体培养及HBeAg的高效表达

选择微载体Ｃｙｔｏｄｅｘ３对家蚕ＢｍＮ（从ＳｉｌｋｗｏｒｍＢｏｍｂｙｘｍｏｒｉ获得的细胞系）细胞进行高密度培养,并获得成功。观察了家蚕ＢｍＮ细胞在微载体Ｃｙｔｏｄｅｘ３上的贴壁分布,研究了不同接种浓度与微载体浓度时细胞的生长情况,并筛选出最佳的技术参数。在１０００ｍＬ滚瓶中用微载体Ｇｙｔｏｄｅｘ３培养家蚕细胞,在合适的培养条件下（细胞接种浓度３．６×１０５细胞／ｍＬ、微载体浓度５ｇ／Ｌ）,５ｄ后,细胞的终密度达到２．８×１０６细胞／ｍＬ,细胞增长指数为７．９。在细胞指数生长期（传代后４８～６０ｈ）用载有ＨＢｅＡｇ基因的重组病毒（ｒＢｍＨＢｅ）接种（感染量为０．４ＰＦＵ／细胞）,５ｄ后,培养上清中ＨＢｅＡｇ滴度为１∶９．６×１０４,是用方瓶静止培养的家蚕细胞表达量的３倍。     

一种新型家蚕核多角体病毒Bac to Bac系统的构建

用家蚕核型多角体病毒的全基因组ＤＮＡ与Ａｃ－ＢａｃｉｍｉｄＤＮＡ共转染家蚕ＢｍＮ细胞,构建转座一穿梭载体Ｂｍ－Ｂａｃｍｉｄ。另一供体质粒以转座方式将乙肝病毒ｅ抗的基因ＨＢｅＡｇ整合到Ｂｍ－Ｂａｃｍｉｄ的ａｔｔＴｎ７位点上成为重组ｒＢｍＨＢｅ。结果表明Ｂｍ－Ｂａｃｍｉｄ既能在大肠杆菌中以质粒的形式复制,又能在家蚕ＢｍＮ细胞和草地夜蛾Ｓｆ９细胞中复制,形成感染性病毒粒子。Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎ     

HBV prec/c shRNA慢病毒真核表达载体的构建和鉴定

目的构建针对HBV prec/c区的shRNA真核表达载体psiHBV,感染HepG2 2.15细胞后观察其对HBeAg表达的抑制作用,为探讨防治HBV感染的新措施提供实验依据。方法针对HBV prec/c基因序列,构建shRNA表达载体psiHBV1、psiHBV2和无关序列psiHBVc。psiHBV与慢病毒辅助系统质粒共转染293T细胞组装慢病毒颗粒后,感染HepG2 2.15细胞,RT-PCR检测prec/c mRNA的转录,微粒子化学发光分析仪(MEIA)检测细胞上清和细胞裂解液中HBeAg表达。结果重组质粒双酶切和测序鉴定与预期结果相符合;组装慢病毒颗粒感染HepG2 2.15细胞后,prec/c mRNA转录降低;与对照组比较,HBeAg的表达水平也显著降低,病毒颗粒对HBeAg表达的抑制作用差异有统计学意义(P<0.01)。结论成功构建针对HBVprec/c的慢病毒载体psiHBV1、siHBV2,慢病毒介导的RNA i能抑制HBV表达,为应用RNA干扰技术治疗乙型肝炎提供了实验依据。     

我国常见乙型肝炎病毒基因型与基本核心启动子及前C区突变关系的初步研究

收集81份HBV DNA阳性血清标本,经PCR扩增和序列测定确定其中有50份属于基因型C,31份属于基因型B;C基因型的基本核心启动子BCP T1762/A1764的突变率(38%)明显高于B基因型(12.9%,P<0.05);前C区A1896的突变在B、C两基因型间无显著性差异,B基因型为9.7%,C基因型为12%,P>0.05;HBeAg的表达与否与BCP双突变或前C区A1896突变均无明显相关性。经定量PCR检测证明,HBeAg阳性组中的HBV DNA含量明显高于抗-HBe阳性组,P<0.05。组内BCP双突变株和野生株及前C1896突变株和野生株的HBV DNA含量无显著性差异。     

K-Ras~(G12D)基因突变体慢病毒载体的构建及其鉴定

目的:构建K-RasG12D基因突变体慢病毒载体。方法:从病人组织中提取RNA通过RT-PCR反转录获得cDNA作为K-RasG12D基因模板,通过PCR法扩增出K-RasG12D基因突变体片段。将酶切的片段克隆入真核表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-RFP中,构建K-RasG12D基因突变体逆转录病毒真核表达载体。将连接产物转化至感受态大肠埃希菌DH5α,挑取转化平板上的细菌克隆,在抗生素培养液中培养过夜后进行PCR鉴定。经测序正确后转染293T细胞系,利用重组质粒PCR及串联基因表达的检测等方法对目的基因的转录与表达进行分析与鉴定。结果:所构建的K-RasG12D突变体基因逆转录病毒真核表达载体经PCR鉴定和测序鉴定正确,转染293T细胞后可以观察到可检测到高强度表达的RFP荧光信号。结论:成功构建了重组真核表达载体,为下一步建立稳定转染细胞系及进一步研究K-Ras突变在癌症发病中的作用奠定了基础。