三套荧光显微成像系统在光敏剂亚细胞定位研究中的应用比较

目的：对三套荧光显微成像系统在国产新型光敏剂HMME亚细胞定位研究中的应用特点及适用范围进行了比较与评价。方法：分别应用LSCM、CCD、ICCD荧光显微成像系统,选择特异性细胞器荧光探针Rhodamine-123、DIOC6(3)标记细胞内线粒体和内质网。采用细胞器-细胞荧光强度比值法,对HMME进行单细胞内分布的定性与定量研究。结果：LSCM和CCD成像系统能采集到浓度达到160μg／ml时的HMME的荧光图像,获得荧光探针图像信息显示所标记的细胞内线粒体和内质网平均荧光强度比值(J1/J2值)都明显高于细胞内J1/J2值。而ICCD成像系统只需HMME浓度为5μg/ml,荧光图像特点都呈胞浆中荧光强度较高且分布不均,细胞核区荧光较弱的中空现象。ICCD系统对细胞器探针荧光图像在空间分辨上不理想。结论：LSCM与CCD成像系统限于其探测灵敏度,对于弱荧光性光敏剂,适用于其高孵育浓度条件下的亚细胞定位研究。二者获得的结果相一致：孵育24h,HMME在鼠肺内皮细胞线粒体和内质网有分布而几乎不进入细胞核。ICCD成像系统可不受孵育浓度条件的限制,实现光敏剂极微弱荧光的有效探测,但空间分辨率较低。     

激光共聚焦显微技术在瓮安生物群中的应用

激光共聚焦显微技术是一种以激光作为激发光源,通过特殊装置"针孔"来过滤离焦光线以提高光学分辨率和对比度的光学成像技术。由于大部分化石不能自发荧光,该技术在古生物学领域尚未实现大范围的应用。但若围岩能自发荧光而与化石之间具有一定衬度,或化石因含特殊成分能在特定波段激光照射下自发荧光而产生结构衬度,则可以运用激光共聚焦显微技术获得在普通光学显微镜及荧光显微镜下难以清晰观察到的信息。为推动激光共聚焦技术在古生物学领域中的应用,文中系统介绍了该技术的原理与使用方法,并以埃迪卡拉纪磷酸盐化特异埋藏的瓮安生物群微体化石为例,展示了该技术在化石成像中的若干优势。实验结果表明,瓮安生物群微体化石因富含磷灰石可自发荧光实现成像,使用激光共聚焦显微成像技术观察瓮安生物群化石薄片不仅可以获得较好衬度,而且还能提高成像的分辨率和清晰度。此外,在化石薄片的厚度范围内还可以实现化石结构三维重建。     

光片荧光显微镜特点及其应用

传统荧光显微镜由于对某些荧光分子存在光毒性、光损伤等方面的缺陷,无法满足对部分活体样本进行长时间观测的需求。光片荧光显微镜（light sheet fluorescence microscope,LSFM）是一种新型荧光显微镜,有别于激光共聚焦显微镜,其特殊的正交光路设计和高效的信号采集装置,使其具备低光毒性、低光漂白、低光损伤和高时空分辨率等优良特性,从而能对细胞及大尺度生物组织样本进行时空连续性较好的记录,尤其适宜于活体生物样品。基于此,概述了光片荧光显微镜的成像原理、成像优势、成像效果的改进与优化历程及其在生命科学领域应用所取得的研究成果,重点对近三年相关应用进行了汇总,并简要介绍了其在神经生物学、发育生物学、动物细胞生物学和植物科学领域中一部分代表性研究内容,最后,总结了光片荧光显微镜的优点与发展至今仍存在的不足,并对其在光遗传学和多组学研究中的潜在应用进行了展望,以期为研究人员提供较为系统的光片荧光显微镜相关基础知识、最新的研究应用进展以及未来的潜在应用方向,为研究人员提供参考。     

激光扫描共聚焦显微镜在花粉研究中的应用

激光扫描共聚焦显微镜（Laser scanning confocal microscope,LSCM）是普通光学显微镜、激光、计算机及其相应的软件技术结合的产物,能实现连续光学切片和生物三维结构重组及动态分析.作为一种先进的技术手段,LSCM技术已经为花粉生物学的研究提供了有价值的新资料,大大地推动了植物生殖生物学的发展.本文综述了LSCM技术在花粉粒形态（形状、大小及三维重建）、花粉的内部结构（如细胞骨架）、花粉的遗传学、花粉的发育、花粉的萌发、花粉自发荧光特性、孢粉研究等方面中的应用,并指出了LSCM的不足之处,最后提出了LSCM技术在花粉研究中的应用展望.未来LSCM技术应该与多光子技术、活细胞工作站技术相结合使用,才能更准确地进行花粉动态研究的实时监测.     

激光共焦显微成像的最新进展及其在生命科学研究中的应用

激光扫描共聚焦显微镜近年来得到了迅速发展,是近代最先进的细胞生物医学分析仪器之一。通过它可以对观察样品进行无创断层扫描和成像,在生物学和医学研究诊断的各个方面都得到了广泛的应用。本文主要介绍了激光扫描共焦显微镜的基本原理和发展状况,并着重介绍了在共焦荧光显微镜中采用薄荧光层和切片成像特性图来表征成像状态的功能。这种方法一般用于表征共聚焦和多光子显微镜的成像特性,是比较显微镜切片成像条件、成像质量等相关性能的重要依据。     

四种显微技术观测大鼠颌下腺细胞与丝素-壳聚糖体外共培养的形态学特点

目的采用倒置显微镜、扫描电镜（scanning electron microscopy,SEM）、荧光显微镜和激光共聚焦显微镜（（laser scanning confocal microscopy,LSCM））技术对大鼠颌下腺细胞（rat submandibular gland cells,RSMGs）与丝素-壳聚糖（silk fibroin-chitosan,SFCs）的体外复合培养进行形态学观察。为观测、评估种子细胞在三维支架的内部生长情况提供技术支持。方法取0～8 d龄SD大鼠的颌下腺,对大鼠颌下腺细胞进行原代培养、分离纯化并传代;用抗细胞角蛋白单克隆抗体（CK8）及淀粉酶抗体的免疫细胞化学染色鉴定细胞来源。选取传至第二代的对数生长期的RSMGs作为种子细胞,选取SFCs共混膜（5×5×2）mm作为支架材料构建组织工程化涎腺样结构。将种子细胞与支架材料复合培养并分别于倒置显微镜、SEM、荧光显微镜和LSCM下观察二者复合生长情况。结果倒置显微镜可以直接观察活细胞与支架复合生长情况,方法简单易行。SEM可以较精确的展示细胞支架复合生长的表面超微结构。经过荧光染料的着色,荧光显微镜和LSCM都可以观察到支架上锚定的种子细胞。荧光显微镜可见细胞核的荧光信号均匀的分布在支架孔隙内。LSCM通过层扫描及三维重建技术对较厚的标本获取图像;并可以通过旋转图像,从不同角度观察细胞支架复合物的三维剖面或整体结构,得到更为准确的定位信息。结论四种显微技术均可应用于RSMGs与SFCs体外共培养的形态学观测。LSCM的三维重建技术结合荧光染料标记可以较好地获得RSMGs与SFCs复合生长的情况,有着较广泛的应用价值。     

双光子激发荧光各向异性度的成像

荧光各向异性度 (fluorescence anisotropy) 测量可以获得荧光分子的转动速度信息,进而了解分子质量、结构、以及与周边环境的相互作用情况 . 围绕一台双光子激发扫描荧光成像系统,通过改变外光路和图像记录与处理程序,从而实现了双光子激发荧光各向异性度成像,并针对一些典型样品和体系,展示了该方法的应用 . 实验中观察了 FITC 荧光分子、 FITC 结合的 CD44 抗体分子及与肿瘤细胞表面受体结合的 FITC-CD44 抗体分子 . 测量结果表明,不同分子质量、不同微观环境状态下的荧光分子,其各向异性度大小不同,在各向异性度图中能够被明显区分 . 荧光各向异性度成像能够定量测量样品微区的各向异性度值,并以二维图像的形式直观表达,是各向异性度测量与成像技术的良好结合 .     

用于动物分类学研究领域的显微成像新技术

UV—C光学共聚焦显微图像系统集成了光学和数字图像分析技术，特别适用于采集非平面样品（高度变化范围超过了显微镜景深范围）的图像，它彻底解决了传统光学显微镜成像时高倍数与大景深不能共存的问题，使样品的不同高低部位都能清晰成像，可以获得像电镜图像一样的巨大景深和精致的细节，更能得到电镜图像所没有的真实色彩。UV—C以清晰直观的样品图片带给读者手绘图所不能达到的视觉效果，是动物分类学家研究和描述物种的好助手。     

用于动物分类学研究领域的显微成像新技术

UV—C光学共聚焦显微图像系统集成了光学和数字图像分析技术，特别适用于采集非平面样品（高度变化范围超过了显微镜景深范围）的图像，它彻底解决了传统光学显微镜成像时高倍数与大景深不能共存的问题，使样品的不同高低部位都能清晰成像，可以获得像电镜图像一样的巨大景深和精致的细节，更能得到电镜图像所没有的真实色彩。UV—C以清晰直观的样品图片带给读者手绘图所不能达到的视觉效果，是动物分类学家研究和描述物种的好助手。     

分子生物光子学的进展

随着分子生物学和标记技术的进步,光学成像和分析有了很快的发展,无论是从理论上还是应用上都有所突破,展现了良好的前景。本文综述了近年来在分子生物探测中光子学的情况,简介了几种突破光学衍射极限的探测方法,着重阐明了与生化技术密切相关的荧光共振能量转移和荧光相关光谱显微术及其在分子生物学中的应用。     

基于三通道的超分辨率显微镜成像

显微技术经过快速发展，已经突破了光学衍射极限，目前主要包含受激发射损耗显微术（STED）、结构光照明显微镜（SIM）、光激活定位显微成像（PALM）、随机光学重构显微术（STORM）、基于最少光子数的纳米尺度定位（MINFLUX）、结合结构光照明技术的MINFLUX技术变体（SIMFLUX）等技术。STORM技术具有优越性，在其基础上叠加多色成像技术（目前有6种），本文介绍了目前最新的多色成像技术以及分光成像实现的三通道成像技术。分光成像实现的三通道成像存在光谱串色、通道对齐误差等影响，基于此介绍了相关的优化算法原理。展示了在三通道STORM显微成像平台上实现的COS-7细胞成像。说明三通道STORM显微成像的优越性。     

DNA单分子近场光学成像与荧光探测

介绍了扫描近场光学(SNOM-Scanning Near-Field Optical Microscope)／原子力显微镜（AFM－Atomic Force Microscope)系统（SNO／AM）的工作原理。在AFM模式和SNOM模式下对DNA分子进行成像和荧光探测,得到了清晰的DNA单分子的形貌像和荧光像。由形貌圆像得到的DNA分子尺寸横向为20nm,高度为2nm,其中包含了探针形貌的影响。实验中采Tapping模式的AFM成像,样品经多次搜索扫描无明显损坏。AFM模式的分辨率优于1nm。SNOM模式下DNA分子形貌像和荧光像清晰,由近场荧光分布可以确定分子取向和浓度。用YOYO－1染料对λDNA分子进行染色和荧光探测。通过对DNA分子多个截面进行测量,分析染料 与DNA结合状态。     

荧光成像技术及其在生命科学中的应用

近年来,荧光成像技术发展迅速,其成像系统通常为目前最先进的分析检测仪器之一的激光共聚焦显微镜,荧光探针是荧光成像技术的核心之一。作为新兴光学成像技术,荧光成像技术在生命科学领域中应用广泛,可用于蛋白质及金属离子检测,肿瘤疾病的诊断,并为药物新剂型的研究提供了新思路。     

PALM成像中激光强度和定位精度相关性的研究

近十年来,基于单分子定位的PALM成像技术快速发展,将显微镜的分辨率提高到了2-25nm。本文发现PALM成像过程中采用的激发光强度与成像的定位精度之间有密切的联系。我们分别选择了PALM成像使用的光激活荧光蛋白、光转换荧光蛋白和光开关荧光蛋白中最常用的荧光蛋白进行验证。实验发现伴随激光强度的增加,大部分荧光蛋白的光子数先升高然后趋于饱和,背景噪声几乎线性升高。进一步分析发现荧光蛋白的定位误差随着激光强度增强先降低后升高,因此选用合适的激光强度在PALM成像实验中至关重要。如何提高PALM成像的分辨率一直是科学家研究的热点,本研究内容可以指导研究人员在PALM成像中选用合适的激发光强度,从而得到高分辨率的图像。     

STORM和STED显微成像技术特点的比较

随机光学重建显微镜(stochastic optical reconstruction microscopy,STORM)技术和受激发射损耗(stimulated emission depletion,STED)显微镜技术是近年来发展迅速的两种超分辨率荧光显微镜技术。这两种技术均提供超越传统荧光显微镜分辨率成像的功能,具有多色显像,三维成像以及活细胞内成像的潜力。在这篇综述中,我们关注两种技术荧光控制、激光强度等技术参数设定,同时结合样品制备、图像采集与处理等流程优化对比两者在分辨率、图像采集时间及具体应用中的优劣。STORM可获得更高的三维分辨率,但可能需要更长的图像采集时间。STED需要较高损耗光强度,却能在图像采集后立即生成超分辨率图像,不需要额外图像数据处理。最终,选择STORM和STED不仅取决于技术的具体应用,还取决于操作者优化各环节技术参数的能力,从而决定图像质量。     

激光共聚焦扫描技术与荧光组织化学染色

激光扫描共聚焦显微镜Confocal Laser Scanning Microscope)是20世纪80年代中期发展起来并得到广泛应用的新技术[1].在传统光学显微镜基础上,激光扫描共聚焦显微镜用激光作为光源,采用共轭聚焦原理和装置,并利用计算机对所观察的对象进行数字图像处理观察、分析和输出.其特点是可以对样品进行断层扫描和成像,进行无损伤观察和分析细胞的三维空间结构.同时,利用免疫荧光标记和离子荧光标记探针,该技术也可对活细胞内的生命活动进行动态观察和分析,是细胞生物学研究的重要手段和工具,极大地丰富了人们对细胞生命现象的认识.     

化石研究的新技术──激光扫描共聚焦显微系统

激光扫描共聚焦显微技术的根本特性在于任何时候都将照明光与探测到物体表面的光限制在物体某一个相同点上。如果这个点非常小又在极小衍射范围内，那么激光扫描共聚焦成像系统的分辨率要比任何传统显微镜高许多。通过变换焦距，可做一系列虚拟断层切面。利用这个特点，对那些用常规手段无法进行切片磨面的微体化石采用激光扫描共聚焦新技术进行研究，获得了对小壳化石、昆虫、孢粉等化石研究的新成果。     

一体化的光声-荧光显微镜用于活体肿瘤成像

报道了一种利用单一波长激发的同时产生光声和荧光信号的显微成像系统,本成像系统具有超高的成像分辨率(<6μm)。借助外源的造影剂在近红外的吸收特性,利用光声-荧光显微成像系统对活体肿瘤进行光声/荧光成像。实验结果表明,光声-荧光显微镜在早期肿瘤的成像和检测等方面具有潜在的应用价值。因此,通过研究和选择适当的双模态造影剂,该系统在不同病理模型中可以提供更准确的组织信息及生理参数。     

活体染色显微技术和绿色荧光蛋白在本科实验教学中的应用

激光扫描共聚焦显微镜的原理和使用是本科生细胞生物学实验教学中的重要内容。目前,在细胞生物学实验教学中常使用绿色新鲜的植物叶片作为实验材料,在激光扫描共聚焦显微镜下对叶绿体的自发荧光进行观察。叶绿体的自发荧光信号强而且范围广,使学生难以清晰地理解特异性的荧光信号。该文通过对转p35S::Naa10-GFP基因拟南芥幼苗的根尖进行活体染色[碘化丙啶(propidium iodide,PI)和4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染色],在不同的激发光下,收集相应的荧光信号,通过计算机辅助成像,获得不同颜色叠加的特异荧光信号图像。该实验设计简单可行,获得的图像清晰且便于观察,能够使初学者直观并且深刻理解激光扫描共聚焦显微镜的原理和使用方法,适合在高校细胞生物学实验教学中推广,同时也为研究其他蛋白质亚细胞定位提供技术参考。     

用于动物分类学研究领域的显微成像新技术

UV—C光学共聚焦显微图像系统集成了光学和数字图象分析技术,特别适用于采集非平面样品（高度变化范围超过了显微镜景深范围）的图象,它彻底解决了传统光学显微镜成像时高倍数与大景深不能共存的问题,使样品的不同高低部位都能清晰成像,可以获得像电镜图像一样的巨大景深和精致的细节,更能得到电镜图像所没有的真实色彩。UV—C以清晰直观的样品图片带给读者手绘图所不能达到的视觉效果,是动物分类学家研究和描述物种的好助手。