高纯度α_1-抗胰蛋白酶的提取、抗血清的制备及其火箭免疫电泳测定

α_1-抗胰蛋白酶(α_1-AT)是肝细胞分泌的一种糖蛋白,是血浆蛋白电泳α_1球蛋白的主要成份。它能抑制多种蛋白酶,如胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶、纤维蛋白溶酶等的活性。α_1-AT在血浆中含量较高,在组织中广泛存在,对维持机体正常生理功能,防止组织过度破坏起重要作用。本文报道经我们改良的高纯度α_1-AT提取方法、抗血清的制备及其火箭免疫电泳定量测量方法。一、材料与方法 1、α_1-AT、蛋白质测定方法α_1-AT按Eriksson法测定胰蛋白酶抑制容量(TIC)。结晶胰蛋白酶为Sigma产品,胰蛋白酶的特异性     

刀豆球蛋白A亲和双向免疫电泳对人体α_1-抗胰蛋白酶分子变异体的研究

α_1-抗胰蛋白酶(AAT)是一种低分子量的血清糖蛋白,属于丝氨酸蛋白酶类的蛋白酶抑制剂。由于某些AAT遗传的分子变异体与肺退行性疾病、肝硬化、肝癌及其它炎症性疾病有关,因而受到人们的重视。现已发现AAT含有40多个等位基因,因而所表达的基因产物往往是抗原性一致而分子构型不同的各种蛋白质分子。Fagerhol等曾用酸性淀粉凝胶电     

α_1-抗胰蛋白酶的分离纯化及应用研究进展

α_1-抗胰蛋白酶为人血浆中微量蛋白,其浓缩制剂在临床上具有治疗肺气肿等疾病的确切疗效．综述了近来α_1-抗胰蛋白酶分离纯化工艺和应用研究的进展,结合生化分离纯化技术的发展,讨论了该产品制备新工艺的开发方向．     

α1-抗胰蛋白酶的研究进展

自1963年首次报道α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)缺失与肺气肿的关系以来,α1-AT的结构和功能、作用原理等得到进一步的认识。伴随α1-AT产品的不断研制,对其临床应用及其临床研究更加广泛深入,对此进行综述。     

α1-抗胰蛋白酶的分离纯化

为建立从Cohn's组分IV沉淀中分离纯化α1-抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin,α1-AT)的技术路线,以Cohn's组分IV为原料,利用还原剂1,4-二硫苏糖醇(DTT)、气相二氧化硅等处理,再经压滤、离子交换层析和疏水层析提取α1-AT.用SDS-PAGE及合成基质法检测α1-AT的纯度以及生物活性.结果可见,Cohn组分IV沉淀中α1-AT占蛋白总量的11%～13%,经该工艺提取的α1-抗胰蛋白酶纯度为97.6%,疏水层析后α1-AT的收获率为21%,比活为每毫克总蛋白中含 0.54 mg功能活性α1-AT.可见用此方法从Cohn组分IV沉淀中可制备高纯度的α1-AT.     

α1-抗胰蛋白酶的缺乏与治疗

α1-抗胰蛋白酶缺乏症(α1-antitrypsin deficiency,AATD)是遗传性疾病,可引起肝脏疾病,也与早发型肺气肿等肺部疾病有关。编码α1-抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin,AAT)的基因具有复杂的单核苷酸多态性,并以常染色体共显性方式遗传。临床上,以混合人血浆为来源的静注AAT可提高AATD患者的血清AAT水平。除这种增补疗法外,新的治疗方法也在不断发展,包括基因治疗及干细胞治疗等。     

上海地区胃癌病人运铁蛋白(Tf)、组特异性成分(Gc)、α_1-抗胰蛋白酶(α_1-AT)亚型分布的研究

用薄层聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳分析了上海地区202例汉族胃癌病人及202例正常对照组的运铁聋白(Tf)和α_1-抗胰蛋白酶(α_1-AT)亚型的分布,发现胃癌组Tfc_1c_1纯合子频率(0.3713)和Tfc_1基因频率(0.5718)显著低于对照组(分别为0.5149和0.6782),均为p<0.01,胃癌组Tfc_2c_2纯合子频率(0.2228)和Tfc_2基因频率(0.4019)显著高于对照组(分别为0.1436,p<0.05和0.2970,p<0.01),胃癌组和对照组的α_1-抗胰蛋白酶亚型分布无显著差异。用薄层聚丙烯酰胺等电聚焦结合免疫固定分析了上海地区200例汉族胃癌病人和200例正常对照组的组特异性成分(Gc)亚型分布,发现胃癌组Go1F表型频率(0.22)和Gc1F基因频率(0.4375)均显著高于正常对照组(分别为0.14和0.3600,均为p<0.05)。     

α_1抗胰蛋白酶遗传类型在七个民族中的分布

调查了α_1-AT遗传类型在东北及内蒙古地区汉、蒙、朝鲜、满、达斡尔、鄂温克、鄂伦春等七个民族中的分布。计算了每个群体中的α_1-AT基因频率,经X~2检测证明七个群体α_1-AT表型分布均符合Hardy-weinberg法则。同时,将各少数民族人群α_1-ATM类型及变异型的基因频率与汉族人群进行了比较。     

蒙古族、朝鲜族和壮族中腺苷酸激酶、腺苷脱氨酶、血清触珠蛋白、α_1-抗胰蛋白酶的多态性

调查了中国内蒙古的蒙古族、吉林的朝鲜族和广西壮族的红细胞腺苷酸激酶(AK)、腺苷脱氨酶(ADA)及血清触珠蛋白(Hp)、a_1-抗胰蛋白酶(a_1-AT)的遗传多态性。蒙古族、朝鲜族、壮族的基因频率:AK_1~1分别为0.9843、1.0000、1.0000;ADA~1分别为0.9529、0.9468、0.9573;Hp~1分别为0.2597、0.3152、0.3571;在a_1-AT中Pi~M分别为0.9953、0.9953、0.9928,Pi~s分别为0.0000、0.0000、0.0072,Pi~F分别为0.0047、0.0047、0.0000。x~2检验表明,三个民族各项指标的表型观察值都符合Hardy-Weinberg法则。     

人骨骼肌α辅肌动蛋白（α—actinin）的提取及其抗血清的制备和鉴定

本文提取人骨骼肌α辅肌动蛋白（α－ａｃｔｉｎｉｎ）是综合了文献报导有关提取兔肌α－ａｃｔｉｎｉｎ的和提取鸡胗α－ａｃｔｉｎｉｎ的方法,稍加修改而确定的。用Ｈａｓｓｅｌｂａｃｈ－Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ缓解液提取骨骼肌中的肌球蛋白后,将残余物经硼酸－缓冲液提取、匀浆及高速离心去掉肌动蛋白和肌原纤维的其它成份,上清加硫酸铵至３０％,３５％饱合度所得的沉淀用２２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－乙酸溶解、透析、离心后     

人骨骼肌α辅肌动蛋白（α－actinin）的提取及其抗血清的制备和鉴定

本文提取人骨骼肌α辅肌动蛋白（α－ａｃｔｉｎｉｎ）是综合了文献报导有关提取兔肌α－ａｃｔｉｎｉｎ的和提取鸡胗α－ａｃｔｉｎｉｎ的方法,稍加修改而确定的。用Ｈａｓｓｅｌｂａｃｈ－Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ缓冲液提取骨骼肌中的肌球蛋白后,将残余物经硼酸－缓冲液提取、匀浆及高速离心去掉肌动蛋白和肌原纤维的其它成份,上清加硫酸铵至３０％,３５％饱合度所得的沉淀用２２０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－乙酸溶解、透析、离心后经ＤＥ－５２柱层析可得电泳纯。α－ａｃｔｉｎｉｎ。将人骨骼肌α－ａｃｔｉｎｉｎ纯化制品免疫了三只大耳白纯种家兔,两个多月后,三只兔子都产生免抗人骨骼肌α－ａｃｔｉｎｉｎ的特异抗血清,用双向免疫扩散法和酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）测定,产生的抗体效价较高,用双扩散法测定效价为１：３２,用ＥＬＩＳＡ测定,用比率法判断结果,效价最高者为１：１００,０００左右,经免疫电镜观察结果证实,上述抗血清可以满足进一步实验要求。     

蓝琼脂糖珠在纯化人血清α_1抗胰蛋白酶中的应用

<正> α_1抗胰蛋白酶(α_1-Antitrypsin,简称A_1AT)是人体血浆中含量最多的一种蛋白酶抑制物,对于维持体内蛋白酶的平衡具有重要作用。自Laurall等(1963)发现遗传性A_1AT缺乏的个体易罹患肺气肿与肝硬化等疾病后,A_1AT的研究遂引起广泛注意。近年来还认为A_1AT的检测有助于肝癌的诊断。A_1AT的制备方法据报道一般较为繁琐,而且得率和纯度也欠满意。为此,我们利用Cibacron蓝染料能特异性地与白蛋白结合的特性,借以除     

大鼠骨骼肌多催化功能蛋白酶的提取、鉴定及其抗血清的制备

为了研究多催化功能蛋白酶（ｍｕｌｔｉｃａｔａｌｙｔｉｃａｌｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ,ＭＣＰ）在负氮平衡形成中的作用,以大鼠骨骼肌为原料,提取此酶并制备其抗血清．将大鼠骨骼肌粗提物经４５％～６５％饱和度硫酸铵分级盐析、阴离子交换层析和凝胶过滤,最后从Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ层析柱上获得单一活性洗脱峰．酶活性用Ｃａｒｂｏｂｅｎｚｏｘｙ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－４－ｎｉｔｒｉｎｉｌｉｄｅａｃｅｔａｔｅ作底物检测．非变性ＰＡＧＥ银盐染色显示单一区带的骨骼肌多催化功能蛋白酶,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ银盐染色显示１０条亚基电泳区带,分子量在２５～３２ｋＤ之间．纯化的酶免疫兔８周后,抗血清效价达１３２,用分级盐析和离子交换层析纯化抗血清,显示单一电泳区带的ＩｇＧ．Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ分析显示只在２５～３２ｋＤ之间出现多条亚基区带．这些结果提示已获得电泳纯ＭＣＰ及其较高特异性的多克隆抗体．     

BjαIT的表达、抗血清制备及scFv基因库的构建

根据成熟昆虫神经毒素BjαIT的氨基酸序列,人工合成毒素基因,并克隆至大肠杆菌表达载体pPET-30a（＋）。在IPTG的诱导下,神经毒素在大肠杆菌中融合表达,表达产物经镍亲和层析纯化,纯化蛋白免疫BALB／c小鼠,制备了特异性较高的抗血清,抗体滴度达1：512,000。提取免疫小鼠脾细胞总RNA,通过RT-PCR分别扩增重链可变区（VH）及轻链可变区（VL）基因片段,在连接肽linker的连接下成功构建了包含抗BjαIT的全长scFv基因库。本研究为新型蝎昆虫神经毒素BjαIT的检测奠定了基础。     

酶标抗原火箭免疫电泳法及其在蛇毒抗原成分含量测定中的应用

为解决目前蛇毒成份检测困难以及寻找一种可用于蛇伤快速鉴别诊断的方法,本研究建立了酶标抗原火箭免疫电泳法。本法结合了酶标法灵敏度高和火箭电泳操作简单的特点,对待测的同种抗原标记辣根过氧化物酶(酶标抗原),检测时把微量的酶标记抗原掺入被测样品中,在含多价抗血清的免疫电泳板进行电泳。最后用辣根过氧化物底物3.3′-二氨基联苯胺在板上直接显色,显色后观察到的免疫沉淀线高度与被测抗原含量呈正相关(r=+0.98)。采用本方法检测眼镜蛇毒细胞毒素和限镜王蛇毒 L-氨基酶氧化酶,细胞毒素的最低检测浓度为110ng/ml,氨基酸氧化酶为60ng/ml。比单向火箭免疫电泳法灵敏度高30倍。用同一原理的酶标记抗原融合电泳法监测L-氨基酸氧化酶的层析分离时,比酶活性法检测灵敏度高20倍。全部检测只需30分钟。初步观察商品眼镜蛇毒抗血清可对蛇毒15种成分产生免疫沉淀线,眼镜蛇的细胞毒与同科异科蛇毒的细胞毒素无交叉免疫反应。因此,采用本法可以确定不同蛇种蛇毒中所含的特异性抗原,获得蛇伤鉴别诊断的依据。     

抗hARD1抗血清制备及其初步肿瘤免疫组化分析

人ARD1(human arrest defective 1, hARD1)基因被确定具有N-乙酰基转移酶活性, 但其生理学功能并不清楚。为了探讨hARD1基因与肿瘤的关系, 检测hARD1蛋白在不同肿瘤中的表达, 克隆了hARD1基因并进行原核表达, 利用镍离子螯合(His-bind)柱层析纯化, 得到纯度达95%以上的hARD1蛋白。以纯化的重组蛋白免疫小鼠, 制备了抗hARD1蛋白的抗血清。利用抗hARD1多抗血清检测常见的临床肿瘤病理组织, 发现hARD1蛋白在乳腺肿瘤、前列腺癌, 以及肺癌中有较高频率的表达, 其中乳腺肿瘤中的表达频率最高, 达到70%, 远高于其他肿瘤组织。表明hARD1蛋白的高表达可能是乳腺肿瘤组织的一个标志, 为进一步揭示hARD1与乳腺肿瘤的关系奠定了基础。     

草鱼α1-抗胰蛋白酶基因cDNA全长克隆与表达分析

采用RACE技术获得α1-抗胰蛋白酶基因cDNA全长序列为1 469 bp,开放阅读框为1 329 bp,可编码442个氨基酸。5′非编码区长19 bp,3′非编码区长121 bp。核苷酸序列分析表明,在N端可能存在一个由1～21位氨基酸残基组成的信号肽;与斑马鱼的同源性最好,其次是虹鳟;在系统进化上,与在斑马鱼、虹鳟共聚为一个大支。用半定量RT-PCR分析正常及细菌诱导下草鱼α1-抗胰蛋白酶基因在不同组织中的表达分布。结果显示:正常情况下,草鱼α1-抗胰蛋白酶在肝脏表达最丰富,在脾脏、前肾、前肠、中肠、后肠和也有少量表达;细菌诱导下,肝脏中表达最强,前肾、脾脏、肠道中表达均明显提高,心脏和后肾中也出现较高表达。提示α1-抗胰蛋白酶可能参与了机体对嗜水气单胞菌感染的免疫应答。