亮氨酸脱氢酶C端Loop区域的理性设计及多酶级联高效合成l-2-氨基丁酸

亮氨酸脱氢酶(Leucine dehydrogenase,LDH)是制备L-2-氨基丁酸的关键限速酶,针对该酶的Loop区域进行改造以提高关键酶的酶活及稳定性从而高效合成L-2-氨基丁酸.通过亮氨酸脱氢酶的分子动力学模拟分析均方根涨落(Root mean square fluctuation,RMSF)值,对其波动非常...     

大肠杆菌全细胞转化联产L-2-氨基丁酸和D-葡萄糖酸

以大肠杆菌BL21(DE3)为表达宿主,构建两株分别表达L-苏氨酸脱氨酶(LTD,基因来源大肠杆菌)和共表达亮氨酸脱氢酶(LDH,来源蜡样芽孢杆菌)/葡萄糖脱氢酶(GDH,来源枯草芽孢杆菌)的重组大肠杆菌,在此基础上,构建了一种以L-苏氨酸和D-葡萄糖为底物联产L-2-氨基丁酸(L-ABA)和D-葡萄糖酸的全细胞转化系统。通过转化条件(温度、p H、细胞通透性和菌体量)优化,并采用分批补料策略,164 g/L L-苏氨酸和248 g/L D-葡萄糖最终转化得到141.6 g/L的L-ABA和269.4 g/L的D-葡萄糖酸,时空得率分别达到7.1 g/(L?h)和13.5 g/(L?h),得率超过99%。本研究使用价格低廉的大宗化学品高效率生产出有较高附加值的产物,全细胞转化系统无需额外添加昂贵的辅酶,更适用于工业化生产。     

亮氨酸脱氢酶偶联NADH再生体系合成L-2-氨基丁酸

文中以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主,构建两株分别共表达亮氨酸脱氢酶(LDH,来源蜡样芽孢杆菌)/甲酸脱氢酶(FDH,来源水生弯杆菌)和亮氨酸脱氢酶(LDH,来源蜡样芽孢杆菌)/醇脱氢酶(ADH,来源红球菌)的重组大肠杆菌。通过偶联两种不同NADH再生体系,以L-苏氨酸为起始原料,利用苏氨酸脱氨酶(L-TD)与LDH-FDH或LDH-ADH一锅法合成L-2-氨基丁酸,并对LDH-FDH工艺和LDH-ADH工艺进行对比优化。LDH-FDH工艺的最适反应pH为7.5,最适反应温度为35℃,通过加入50 g/L甲酸铵、0.3 g/L NAD+、10%LDH-FDH粗酶液(V/V)和7 500 U/L的L-TD酶液,对L-苏氨酸进行分批补加,以便控制2-丁酮酸浓度小于15 g/L,反应28 h,实现了L-2-氨基丁酸的产量为161.8 g/L,产率97%。LDH-ADH工艺的最适pH为8.0,最适反应温度为35℃,通过加入0.3 g/L NAD+、10%LDH-ADH粗酶液(V/V)及7 500 U/L的L-TD酶液,分批补加L-苏氨酸及1.2倍摩尔量异丙醇,以便控制2-丁酮酸浓度小于15g...     

重组大肠杆菌全细胞催化L-苏氨酸合成2,5-二甲基吡嗪

2,5-二甲基吡嗪(2,5-dimethylpyrazine,2,5-DMP)在食品香料与医药方面具有重要的经济价值,工业上普遍采用环境不友好且反应条件苛刻的化学合成法来生产.文中结合代谢工程和辅因子工程策略设计高效催化L-苏氨酸合成2,5-DMP的全细胞催化剂,实现微生物转化法合成2,5-DMP.本研究首先分析了不同...     

偶联基于酮还原酶的NADH再生系统一锅法酶催化合成L-2-氨基丁酸

以廉价易得的L-苏氨酸为原料,利用在大肠杆菌中重组表达的苏氨酸脱氨酶和亮氨酸脱氢酶,并偶联基于酮还原酶的NADH再生系统一锅法制备L-2-氨基丁酸。以L-2-氨基丁酸的产率为指标,考察了一锅法酶催化制备L-2-氨基丁酸的最适p H、L-苏氨酸浓度及异丙醇浓度。在最适p H 7.5~8.0,L-苏氨酸浓度50g/L,添加5%的异丙醇及0.5g/L NAD+,分别加入0.6g/L苏氨酸脱氨酶、2g/L亮氨酸脱氢酶及2g/L酮还原酶,反应20h,可实现L-2-氨基丁酸的摩尔产率为99%,产量为43g/L。该结果为L-2-氨基丁酸的制备提供了一种新的思路。     

双酶级联催化L-色氨酸合成靛蓝

靛蓝(indigo)作为一种水溶性非偶氮类着色剂,广泛应用于纺织、食品、制药等工业领域。目前靛蓝主要采用化学法合成,存在环境污染、安全隐患等问题,亟须寻找更安全、更绿色的合成方法。本研究利用大肠杆菌(Escherichia coli)来源的色氨酸酶(tryptophanase, EcTnaA)和噬甲基菌(Methylophaga aminisulfidivorans)来源的黄素依赖性单加氧酶(flavin-dependent monooxygenase, MaFMO)构建双酶级联路径,以L-色氨酸为底物合成靛蓝,导入E. coli中获得重组菌株EM-IND01。通过对限速酶MaFMO进行蛋白质工程改造,获得了有益突变体MaFMO^D197E,比酶活和k_cat/K_m比野生型分别提高了2.36倍和1.34倍;将其引入菌株EM-IND01中获得重组菌株EM-IND02,并进行发酵条件优化,在5 L发酵罐中靛蓝产量为(1 288.59±7.50) mg/L,转化率为0.86 mg/mg L-色氨酸,生产强度为26.85 mg/(L·h)。本研究通过蛋白质工程改造,获得MaFMO活性提高的突变体,为靛蓝的工业化生产奠定了基础。     

多酶级联全细胞转化合成酪氨酸

酪氨酸是组成蛋白质的20种氨基酸之一,是哺乳动物的必需氨基酸,常作为营养增补剂。目前合成L-酪氨酸的传统方法存在副产物多、生产条件要求高、环境污染等问题,为了解决这些问题,本研究设计并构建了一个以丙氨酸、谷氨酸、氯化铵和苯酚为底物合成L-酪氨酸的多酶级联催化反应。首先对其中的谷氨酸氧化酶、丙氨酸氨基转移酶和酪氨酸酚裂解酶进行来源筛选和分析,随后通过转化率分析确定了反应体系的限速酶为DbAlaA。为了对限速酶DbAlaA进行改造,建立了一种显色筛选方法,将其活性提高了40.0%。接着优化了反应温度、pH、细胞浓度、表面活性剂和辅酶的添加量,优化后L-酪氨酸的产量达到9.93 g/L,丙氨酸转化率约为54.90%。最后采取分批补料的方式,24 h时L-酪氨酸的产量达到56.07 g/L,丙氨酸转化率约为65.22%。本研究为全细胞催化合成L-酪氨酸及其工业化提供了参考。     

多酶组合催化制备L-高苯丙氨酸

【目的】L-高苯丙氨酸(L-HPA)是许多医药化学品的重要中间体,化学合成法生产L-HPA反应复杂、环境污染严重,本研究旨在开发高效环保的L-HPA酶法合成路线。【方法】采用模块化组装的方法,构建了一条以甘氨酸和苯乙醛为底物高产L-HPA的新途径。【结果】首先,根据文献挖掘设计了一条由苏氨酸醛缩酶(TA)、苏氨酸脱氨酶(TD)、苯丙氨酸脱氢酶(PheDH)和甲酸脱氢酶(FDH)组成的多酶组合催化途径,用于L-HPA的合成。其次,根据氨基基团的引入和重构,将L-HPA多酶组合催化途径分为基础单元和扩增单元,基础单元包括TA和TD,扩增单元包括PheDH和FDH。然后,利用不同表达水平的质粒,对基础单元和扩增单元进行蛋白表达的组合调节,获得最优工程菌BL21-C-M1-R-M2,使L-HPA产量达到208.6mg/L。最后,我们对全细胞转化体系进行优化,使L-HPA产量进一步提高到1226.6 mg/L,苯乙醛摩尔转化率为34.2%。【结论】该工艺路线绿色高效,为未来大规模生产L-HPA奠定基础。     

转氨酶新酶的挖掘、表征及在2-氨基丁酸生物转化中的应用

【目的】通过挖掘高性能转氨酶和引入丙酮酸代谢酶形成催化级联体系抑制逆反应活性,提升产物L-2-氨基丁酸转化水平。【方法】利用基因挖掘技术在数据库中对转氨酶进行大规模挖掘,以2-酮丁酸作为底物,筛选高效转氨酶,并对新酶进行生化分析,表征酶学性质,通过建立全细胞生物转化和催化级联体系调控反应平衡,减缓逆反应水平,提升产物转化率。【结果】从数据库中发现了源自大肠杆菌的Ec4a转氨酶,以2-酮丁酸为底物,Ec4a的最适温度为45℃,最适pH值为9.0,比酶活1.25 U/mg,酶蛋白的熔融温度（T_m值）为68.2℃。酶蛋白在55℃和70℃下的酶活半衰期分别为321 min和150 min。在pH 8.5的条件下孵育6 h相对酶活剩余59%。在全细胞催化体系中两种底物最佳的浓度比为1∶1。分别以30 mmol/L的2-酮丁酸和30 mmol/L的L-Ala为底物,在菌体为OD₆₀₀=10的条件下,2-氨基丁酸的转化率为37.5%。引入枯草芽胞杆菌乙酰乳酸合成酶（Bsalss）可以消耗副产物丙酮酸抑制逆反应,形成体外级联后相同全细胞催化体系下,转化率提高至61.4%。【结论】挖掘到稳定性好的转氨酶Ec4a,建立并优化2-氨基丁酸的全细胞生物转化体系,并通过引入Bsalss构建级联体系提高转化率至61.4%。     

一株重组大肠杆菌/pET-28a-lpgad的构建及其高效生产γ-氨基丁酸转化条件的优化

为实现微生物法高效率生产γ-氨基丁酸(GABA),从一株经多次诱变筛选的具有较高谷氨酸脱羧酶(GAD)活力植物乳杆菌GB 01-21全基因组DNA中PCR扩增获得GAD酶基因lpgad,构建重组质粒pET-28a-lpgad,在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中高效诱导表达。并采用Ni柱亲和层析纯化获得重组GAD,并对其酶学性质进行初步研究,为改良转化工艺提高GABA产量提供可靠理论依据。结果显示,重组大肠杆菌中GAD酶活显著提高,可达8.53 U/mg,是植物乳杆菌GB 01-21中GAD酶活的4.24倍。将该重组菌应用于转化L-谷氨酸生产GABA,5 L发酵罐水平转化24 h产量可达143.5 g/L,摩尔转化率为97.32%,是植物乳杆菌GB 01-21的2.19倍。纯化后酶学性质进行初步研究表明:其最适pH为4.8;最适温度为37℃;Ca2+、Mg2+对其有较强的激活作用,将上述实验结果用于转化条件的优化,最终5 L发酵罐上进行转化实验,批次添加底物L-谷氨酸共600 g,转化24 h,GABA累计浓度可达204.5 g/L,摩尔转化率为97.92%,与最初转化条件相比,GABA浓度提高了42.5%,为其工业化应用打下了良好的基础。     

转氨酶新酶的挖掘、表征及在2-氨基丁酸生物转化中的应用

目的 通过挖掘高性能转氨酶和引入丙酮酸代谢酶形成催化级联体系抑制逆反应活性;提升产物L-2-氨基丁酸转化水平。 方法 利用基因挖掘技术在数据库中对转氨酶进行大规模挖掘;以2-酮丁酸作为底物;筛选高效转氨酶;并对新酶进行生化分析;表征酶学性质;通过建立全细胞生物转化和催化级联体系调控反应平衡;减缓逆反应水平;提升产物转化率。 结果 从数据库中发现了源自大肠杆菌的Ec4a转氨酶;以2-酮丁酸为底物;Ec4a的最适温度为45 ℃;最适pH值为9.0;比酶活1.25 U/mg;酶蛋白的熔融温度（Tm值）为68.2 ℃。酶蛋白在55 ℃和70 ℃下的酶活半衰期分别为321 min和150 min。在pH 8.5的条件下孵育6 h相对酶活剩余59%。在全细胞催化体系中两种底物最佳的浓度比为1∶1。分别以30 mmol/L的2-酮丁酸和30 mmol/L的L-Ala为底物;在菌体为OD₆₀₀=10的条件下;2-氨基丁酸的转化率为37.5%。引入枯草芽孢杆菌乙酰乳酸合成酶（Bsalss）可以消耗副产物丙酮酸抑制逆反应;形成体外级联后相同全细胞催化体系下;转化率提高至61.4%。 结论 挖掘到稳定性好的转氨酶Ec4a;建立并优化2-氨基丁酸的全细胞生物转化体系;并通过引入Bsalss构建级联体系提高转化率至61.4%。     

高产γ-氨基丁酸的谷氨酸棒杆菌工程菌的构建和发酵条件优化

为了实现γ-氨基丁酸(GABA)在微生物中"一步法"高效生产,本研究构建出一株高产GABA的谷氨酸棒杆茵工程菌ATCC 13032/pDXW10-gadB1-gadB2,可以直接将自身合成的L-谷氨酸转变成GABA,并对该工程茵的发酵培养基和发酵条件进行了初步优化。结果表明:培养7 h~8 h的种子液按发酵起始OD_(562)=1.6转接至发酵培养基(葡萄糖、玉米浆分别100 g/L、4 g/L),10 h添加PLP至O.1 mmol/L,发酵结束后胞外GABA可达(26.39±1.68)g/L。为工业化"一步法"生产GABA提供理论和实验基础。     

酶法生产1,4-环己烷二甲胺

1,4-环己烷二甲胺(1,4-cyclohexanedimethylamine, 1,4-BAC)作为重要的生物基材料单体,被广泛应用于有机合成、医药、化工和材料等多个领域。目前主要采用化学法合成,存在金属催化剂价格昂贵、反应条件苛刻和安全隐患等问题,亟须寻找更环保的合成替代方法。本研究利用大肠杆菌(Escherichia coli)来源的转氨酶(transaminase, EcTA)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)来源的谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase, ScGlu-DH)和博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)来源的甲酸脱氢酶(formate dehydrogenase, CbFDH)成功构建了双菌三酶级联转化1,4-环己烷二甲醛生成1,4-环己烷二甲胺的路径。基于结构指导下的蛋白质工程改造,获得了有益突变体EcTA^F91Y,其比酶活和k_cat/K_m较野生型分别提升了2.2倍和1.9倍。通过重组菌株的构建和反应条件的优化,在最优条件下40 g/L底物可生成(27.4±0.9) g/L产物,摩尔转化率为67.5%±2.1%。     

宏基因组来源重组谷氨酸脱羧酶的酶学特性及全细胞合成γ-氨基丁酸

【背景】 谷氨酸脱羧酶广泛存在于生物体内,其催化产物γ-氨基丁酸是哺乳动物重要的抑制性神经递质。目前,微生物来源的谷氨酸脱羧酶在热和酸碱条件下仍不够稳定。【目的】 挖掘肠道微生物的谷氨酸脱羧酶基因,异源表达并研究其酶学性质,为γ-氨基丁酸的生物合成提供酶原。【方法】 从倭蜂猴粪便微生物宏基因组扩增谷氨酸脱羧酶基因,在大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3)中进行异源表达、酶学性质研究及全细胞合成γ-氨基丁酸的应用。【结果】 获得谷氨酸脱羧酶基因Xby1_8,重组酶Xby1_8分子量为54.46 kDa,最适作用条件为pH 5.0、55 ℃,K_m和V_max分别为(10.2±1.5) mmol/L和(3 574.0±198.3) μmol/(min·mg),较其他微生物来源的谷氨酸脱羧酶具有最高比活3 106.2 U/mg。Xby1_8具有较好的pH和温度稳定性,pH 4.0–8.0或30–50 ℃处理1 h,剩余酶活仍高于100%。在l-谷氨酸浓度260 mmol/L,反应温度55 ℃,细胞浓度OD₆₀₀为3.5条件下反应2.5 h,重组菌E. coli/Xby1_8全细胞催化制备γ-氨基丁酸的转化率为100%。【结论】 从粪便微生物宏基因组中获得谷氨酸脱羧酶基因Xby1_8,并成功在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。重组酶Xby1_8的pH和温度稳定性较好,重组菌E. coli/Xby1_8全细胞催化制备γ-氨基丁酸具有较高的转化率,在食品、工业等领域具有潜在的应用价值。     

酸菜中高产γ-氨基丁酸乳酸菌的筛选和鉴定

从酸菜中分离筛选出产γ-氨基丁酸(GABA)乳酸菌18株,采用改良纸层析结合高效液相色谱法测定,获得1株高产乳酸菌菌株Lb-2,该Lb-2菌株在含10g/L谷氨酸钠的TYG培养基中静置培养48h,发酵液中GABA含量可达13.4g/L。根据乳酸菌的形态特征、生理生化特征和16S rDNA基因序列分析鉴定Lb-2菌株为乳杆菌属(Lactobacillus)的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)。