高产吩嗪-1-羧酸（PCA）假单胞菌株M18G发酵优化模型的构建

吩嗪-1-羧酸（phenazine-1-carboxylic acid, PCA）是促进根际生长假单胞菌分泌的重要抗菌物质。采用Plackett-Burman（PB）设计和响应面法（response surface method, RSM）对假单胞菌株M18（Pseudomonas sp. M18）的gacA基因突变株M18G的次级代谢产物PCA发酵的营养条件进行建模。运用Plackett-Burman（PB）设计试验,从12个营养成分中筛选出4个关键的组分,进而采用RSM 法对这4个因素进行中心组合设计试验,建立回归方程并进行统计学分析,绘制各营养因子之间的关系图。实验结果表明：建立的模型能合理地模拟并优化发酵中各参数及其浓度,确定发酵培养基的成分和浓度为：黄豆粉33.4g/L,葡萄糖12.7g/L,大豆蛋白胨10.9g/L和乙醇13.8 g/L, M18G菌株经60 h发酵培养,最高PCA产率能达到1.89 g/L,比优化前提高了6倍左右。各营养因子的等值线图表明黄豆粉和乙醇在PCA高产发酵中起到更为关键的作用,因此提供了提高PCA发酵产量的有效方法,并为其未来商业化应用奠定了基础。     

假单胞菌M18 relA 突变株的构建及其对吩嗪-1-羧酸合成的调控

假单胞菌M18是一株能同时合成吩嗪-1-羧酸(PCA)和藤黄绿菌素两种抗生素的植物根际分离细菌。RelA催化合成的效应分子ppGpp能介导细菌因营养饥饿引起的应激反应。以M18菌株染色体DNA为模板,PCR扩增获得relA基因,通过庆大霉素抗性片段插入失活与同源重组技术,构建假单胞菌M18的relA突变菌株M18RAG。在PPM培养基中进行PCA发酵分析,发现突变菌株M18RAG的PCA产量显著升高,约为野生型菌株的1.5-2倍。relA基因反式互补实验以及phzA′-′lacZ翻译融合测定结果,均进一步证明了RelA对PCA生物合成及其基因表达具有抑制作用。     

假单胞菌株M18 psrA突变株的构建及其对吩嗪-1-羧酸和藤黄绿菌素合成的调控

【目的】假单胞菌M18是一株能同时合成吩嗪-1-羧酸(PCA)和藤黄绿菌素(Plt)两种抗生素的植物根际促生细菌。PsrA为细菌TetR家族转录调控因子。为了研究PsrA对PCA与Plt生物合成的影响,从M18菌株基因组中扩增psrA基因。【方法】通过同源重组技术,构建庆大霉素抗性片段置换psrA的突变菌株M18psrA。利用基因互补、lacZ报告基因融合分析实验,验证PsrA对抗生素合成基因的调控作用。【结果】在PPM和KMB培养基中,分别比较野生型菌株M18和突变菌株M18psrA的PCA与Plt产量,突变菌株M18psrA的PCA产量显著下降;Plt产量显著升高,为野生型菌株的10-15倍。基因互补、lacZ报告基因融合分析,进一步证明了psrA正调控PCA的phz2合成基因簇,负调控Plt的合成基因簇。【结论】PsrA区别性调控抗生素PCA与Plt的生物合成。     

假单胞菌M18株las系统负调控藤黄绿脓菌素和吩嗪-1-羧酸的合成

从假单胞菌M18株（Pseudomonassp．M18）中,克隆了las系统的双元组分lasI和lasR基因,它们的编码产物属于LuxI—LuxR调控因子．运用同源重组技术,分别构建lasI和lasR基因的染色体失活突变株,与野生型菌株相比,抗生素藤黄绿脓菌素（Pit）和吩嗪-1-羧酸（PcA）的产量均分别提高了4～5倍和2～3倍．在lasI和lasR突变株的反式互补实验中,两种抗生素的产量回复到野生型水平．pltA’-lacZ和phzA-＇lacZ翻译融合的测定结果进-步证明lasI和lasR的编码产物对Plt和PCA生物合成基因簇具有负调控作用．las系统正调控细菌的群集运动,在lasI和lasR的失活突变株中,细菌的群集运动能力消失．对lasI和lasR突变株和野生型的生长曲线的研究发现,lasI和lasR基因的编码产物对细菌的生长具有抑制作用．结果表明,las系统作为整体调控因子的编码基因,参了与细胞内多种生物活动的调控作用．     

吩嗪-1-羧酸发酵培养基配方的初步确定

对本公司自主分离、优化得到的新型农用抗生素吩嗪-1-羧酸的产生菌STH16#生产吩嗪-1-羧酸的发酵培养基配方的初步确定。经实验确定吩嗪-1-羧酸的发酵培养基配方为:甘油15.0g/L、蛋白胨20.0g/L、磷酸氢二钾1.5g/L、硫酸镁2g/L。前体饲喂:在接种后8小时加入质量分数为2.0g/L的MCS。发酵产量可达2500mg/L。     

荧光假单胞菌M18的rpoS基因克隆及其功能分析

从荧光假单胞菌 (Pseudomonasfluorescentsp .)M1 8基因组中克隆了RNA聚合酶的稳定期σs 因子编码基因rpoS ,推测其氨基酸序列与铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌和恶臭假单胞菌的同源性分别为 99 1 %、87 35 %和87 8%。利用体外定点插入突变和同源重组技术 ,构建了M1 8的rpoS突变株M1 8R- 。对突变株M1 8R- 合成抗生素吩嗪 1 羧酸 (PCA)和藤黄绿菌素 (Plt)的动力学分析结果表明 ,在KB或PPM培养基中 ,突变株合成PCA的能力比野生型分别提高了 2 5或 5 78倍 ,但Plt的积累量不受影响。与野生型相比 ,突变株对碳源饥饿的耐性下降。同时 ,在碳源饥饿条件下对过氧化氢、乙醇和和氯化钠等环境胁迫的交叉保护性减小 ,存活率显著降低     

荧光假单胞菌M18rpoD克隆及其对抗生素合成的影响

荧光假单胞菌M18对多种植物病原真菌具有显著的抑制作用。荧光假单胞菌(Pseuclomones fluorescens)M18能同时合成吩嗪1羧酸（PCA）和藤黄绿菌素(Plt) 两种抗生素。从M18的基因组中克隆了rpoD基因,其相应的氨基酸序列与荧光假单胞菌CHAO中RpoD蛋白的氨基酸序列完全相同。利用基因重组技术和大肠杆菌荧光假单胞菌穿梭质粒pME6032,将rpoD置于强启动子Ptac的控制下,导入M18菌株。发现经重组质粒转化的M18,与对照相比,培养基中PCA和Plt开始累积的时间分别提前4h和8h,积累量提高1倍和6倍。     

假单胞菌M18rsmA-突变株的构建及其对Plt和PCA合成的区别性调控作用

假单胞菌(Pseudomonas sp．)M18是促进植物生长的根际细菌,能产生吩嗪-1-羧酸(PCA)和藤黄绿菌素(Plt)两种不同的抗生素抑制植物病原菌,保护植物免受病害。运用PCR方法,从M18基因组中,扩增出rsmA基因部分片段,并以该片段为探针,从M18的基因组柯斯文库中筛出阳性克隆,切取带有rsmA基因及两侧序列的1．5kb片段,中间插入编码Km‘的DNA片段,获得rsmA^-体外突变体。运用同源重组剔除技术,构建了M18菌株的rsmA突变株M18R^-。突变株M18R^-生物合成Plt的能力比野生型M18提高4倍,但是,PCA产量仅为野生型的20％。研究结果表明,全局性调控基因rsmA可能通过不同的机制区别性地影响Plt和PCA的生物合成。     

假单胞菌gacA插入突变对藤黄绿脓菌素和吩嗪-1-羧酸合成代谢的差异性调控

假单胞菌株M18分泌藤黄绿脓菌素 (Pyoluteorin ,Plt )和吩嗪 1 羧酸 (Phenazine 1 carboxylicacid ,PCA)并抑制多种植物病菌的生长。从M18中克隆双基因调控系统gacS gacA的组成基因gacA ,并构建了该基因抗性插入突变株M18G。在KMB培养基中 ,M18G合成Plt的能力受到完全抑制 ,而PCA的积累约比野生型提高 31倍左右。Plt合成基因簇突变株M18T和在M18G基础上构建的PCA合成基因簇突变株M18GA的Plt和PCA合成的动力学变化表明 ,在M18G菌株中 ,Plt合成的抑制并不引起PCA的过量积累 ,PCA的过量积累也不引起Plt合成的抑制。由此推测 ,gacA在基因表达的水平上全局性地执行着调控功能     

Las-like quorum-sensing system negatively regulates both pyoluteorin and phenazine-1-carboxylic acid production in Pseudomonas sp. M18

A las-like quorum-sensing system in Pseudomonas sp. M18 was identified, which consisted of lasI and lasR genes encoding LuxI-LuxR type regulator. Several functions of the las system from strain M18 were investigated in this study. The chromosomal inactivation of either lasI or lasR by recombination increased the production of both pyoluteorin (Plt) and phenazine-1-carboxylic acid (PCA) by 4-5 fold and 2-3 fold over that of the wild type strain of M18, respectively. Production of both antibiotics was restored to wild-type levels after in trans complementation with the wild-type lasI or lasR gene. Expression of the translational fusions pltA'-'lacZ and phzA'-'lacZ further confirmed the negative effect of lasI or lasR on both biosynthetic operons, and it was also demonstrated that the las system was related to the ability of swarming motility and the inhibition of cell growth.     

假单胞菌M18转录调节因子σs基因与无启动子lacZ基因融合突变株的构建和鉴定

通过菌落原位杂交和Southern杂交,从假单胞菌M18基因组文库中克隆了rpoS基因及相邻序列。为了深入研究影响rpoS基因表达的调控因素,运用同源重组技术,将无启动子β-半乳糖苷酶基因(-′lacZ)插入并融合于rpoS基因中,构建了假单胞菌M18rpoS基因突变株M18SZ。Miller法测定显示,突变株M18SZ的β-半乳糖苷酶可高达480U,而野生株检测不到β-半乳糖苷酶活性。表明,突变株中的rpoS基因与无启动子β-半乳糖苷酶基因已融合并且表达。在KMB培养基中生长量测定(OD600)的结果表明,突变株与野生株生长存在显著差异。     

Phenazine-1-carboxylic acid is negatively regulated and pyoluteorin positively regulated by gacA in Pseudomonas sp. M18

The biosynthesis of antimicrobial metabolites is controlled by the GacS/GacA two-component regulatory system in Pseudomonas species. The production of phenazine-1-carboxylic acid and pyoluteorin is differentially regulated by GacA in Pseudomonas sp. M18. Pyoluteorin was reduced to nondetectable level in culture of the gacA insertional mutant strain M18G grown in King's medium B broth, whereas phenazine-1-carboxylic acid production was increased 30-fold over that of the wild-type strain. Production of both antibiotics was restored to wild-type levels after complementation in trans with the wild-type gacA gene. Expression of the translational fusions phzA'-'lacZ and pltA'-'lacZ confirmed the effect of GacA on both biosynthetic operons.     

RpoS as an intermediate in RsmA-dependent regulation of secondary antifungal metabolites biosynthesis in Pseudomonas sp. M18

To investigate the regulatory mechanism governing antifungal metabolite biosynthesis, two kinds of global regulator genes in Pseudomonas sp. M18, an rpoS and an rsmA gene, were cloned and mutated by inserting with an aacC1 cassette, respectively. Two mutants showed the same regulatory mode with repression of phenazine-1-carboxylic acid and remarkable enhancement of pyoluteorin. In the rpoS-mutant, a translational rsmA'-'lacZ fusion was expressed at the same level corresponding to that in the wild-type strain. In the rsmA-mutant, however, expression of the translational rpoS'-'lacZ fusion was only about 30% of that in the wild-type strain. The results indicated that the absence of RsmA leads to repression of the rpoS gene expression, which has further been confirmed with construction of chromosomal rpoS-lacZ fusion in the rsmA-mutant and the wild-type strain, respectively. The findings showed a new regulatory cascade controlling antifungal metabolite production in Pseudomonas sp. M18, suggesting that RpoS may serve as a mediator in RsmA-dependent regulation of secondary metabolite biosynthesis.     

假单胞菌株M18gacA基因对BHL和HHL合成正调控及对PCA合成负调控无相关性

经初步鉴定,假单胞菌株(Pseudomonassp.)M18至少能产生5种N-酰基高丝氨酸内酯类(N-acyl-homoserinelactones,AHLs)信号分子,它们是:N-丁酰高丝氨酸内酯(N-butyryl-L-homoserine lactone,C4-HSL,BHL)、N-己酰高丝氨酸内酯(N-hexanoyl-L-homoserine lactone,C6-HSL,HHL)、N-3-氧-己酰高丝氨酸内酯[N-(3-oxohexanoyl)-L-homoserinelactone,3-Oxo-C6-HSL,OHHL]、N-3-氧-辛酰高丝氨酸内酯[N-(3-oxooctanoyl)-L-homoserine lactone,3-Oxo-C8-HSL,OOHL]和N-3-氧-癸酰高丝氨酸内酯[N-(3-oxodecanoyl)-L-homoserine lactone,3-Oxo-C10-HSL,ODHL)。在gacA突变菌株M18G中,信号分子的积累量明显减少,且只能检测出其中的4种;同时,吩嗪-1-羧酸(Phenazine-1-carboxylic acid,PCA)的合成量比野生株M18提高了2倍左右。在M18菌株中,基因rhlⅠ的编码产物参与BHL和HHL的合成。构建rhlI’-’lacZ翻译融合表达质粒pMEIZ,分别导入野生株M18和突变株M18G,突变株M18G的半乳糖苷酶活性比野生株M18下降约40%,表明GacA对基因rhlI的表达具有正调控作用。但是,在野生株M18和突变株M18G的发酵液中,分别或同时添加过量的外源BHL和HHL,对PCA合成的影响不显著,表明在突变株M18G中,PCA合成量的增加与BHL和HHL合成量的减少没有明显的相关性。     

荧光假单胞菌M18 rpoD克隆及其对抗生素合成的影响

荧光假单胞菌M18对多种植物病原真菌具有显著的抑制作用。荧光假单胞菌(Pseuclomones fluo-rescens)M18能同时合成吩嗪-1-羧酸(PCA)和藤黄绿菌素(P1t)两种抗生素。从M18的基因组中克隆了rpoD基因,其相应的氨基酸序列与荧光假单胞菌CHAO中RpoD蛋白的氨基酸序列完全相同。利用基因重组技术和大肠杆菌-荧光假单胞菌穿梭质粒,pME6032,将rpoD置于强启动子Ptac的控制下,导入M18菌株。发现经重组质粒转化的M18,与对照相比,培养基中PCA和Plt开始累积的时间分别提前4h和8h,积累量提高1倍和6倍.     

乳杆菌Lactobacillus sp.lxp发酵高产L-乳酸研究

筛选得到一株乳杆菌Laetobaeillus sp．,进行发酵生产高浓度L-乳酸的研究。考察了种龄、接种量、温度和不同pH调节剂对乳酸发酵的影响。结果表明：最佳种子培养时间为15h;最佳接种量为15％;最适培养温度为42℃;与氨水和氢氧化钠相比,碳酸钙更适于作为发酵过程的pH调节刺;以葡萄糖为碳源,添加豆粕水解液和玉米浆作为辅料,2L罐培养120h,L-乳酸质量浓度可达202 g/L,糖转化率91．3％,L-乳酸占发酵液中总酸含量98％以上。