小反刍兽疫病毒研究进展

小反刍兽疫（PPR）是由小反刍兽疫病毒（PPRV）引起的一种主要感染小反刍动物的急性、烈性、接触性A类传染病,患病率、死亡率高。本文就世界PPR流行状况、PPRV基因组及病毒结构蛋白、PPRV检测方法、最新的药物及疫苗、存在的问题等方面做了简要综述。     

小反刍兽疫病毒研究进展

小反刍兽疫(PPR)是由小反刍兽疫病毒(PPRV)引起的一种主要感染小反刍动物的急性、烈性、接触性A类传染病,患病率、死亡率高.本文就世界PPR流行状况、PPRV基因组及病毒结构蛋白、PPRV检测方法、最新的药物及疫苗、存在的问题等方面做了简要综述.     

青海岩羊源小反刍兽疫病毒N、F基因的遗传进化分析

2021年1月19日,青海省海西州都兰县巴隆乡伊克高里村发生岩羊不明原因的死亡,表现为离群独处、卧地不起、体质虚弱、觅食困难、肛门周围黑色附着物等现象。通过临床症状、病理学解剖及实时荧光RT-PCR诊断,为小反刍兽疫病毒(PPRV)感染。采用RT-PCR技术从病死岩羊病料组织中扩增出了PPRV N、F基因的部分片段。采用MegAlig、NT1和MEGA6.0软件对岩羊PPRV株N、F基因序列进行了比对和分析,绘制系统进化树,结果显示：此次岩羊感染的PPRV株N、F基因片段与新疆株(China/Xinjiang/2015/16)序列片段的同源性分别为99.43%和99.73%。遗传进化分析,该病原属于基因Ⅳ系。在N、F基因核酸序列水平上,与国内新疆地区分离毒株亲缘关系最近,同在一个小的分支;与国外毒株相比,N基因与塞内加尔和尼日利亚分离毒株亲缘关系较远,F基因与国外分离毒株亲缘关系较远。综上所述,青海岩羊源PPRV株属于基因Ⅳ系,与当前我国流行的野毒株属于同一个谱系。     

小反刍兽疫病毒M基因的截短表达及多抗血清的制备

目的截短表达小反刍兽疫病毒M蛋白基因并将其用于多抗血清的制备。方法之前有研究未能表达完整的M蛋白,而若在抗原性较弱的区域将其一分为二,以截短的形式进行表达,却能达到较理想的水平。因此根据GenBank上公布的PPRV M基因的序列,设计1对特异性引物,扩增出480bp的目的基因,将其克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,得到重组表达质粒pET-32a-PPRV-M1,后转化至Rosetta感受态细胞中,IPTG诱导表达后,通过SDS-PAGE和Western blot试验对重组蛋白进行鉴定,将纯化后的重组蛋白免疫6周龄BALB/c雌鼠,制备多克隆抗体血清。结果经SDS-PAGE及Western blot鉴定,证明截短的M基因的蛋白主要以包涵体形式高效表达并具有良好的反应原性。结论成功克隆表达了截短的小反刍兽疫病毒M基因的蛋白并制备了多抗血清,为建立血清学相关的检测方法及临床治疗奠定了基础。     

小反刍兽疫病毒Ｍ基因的截短表达及多抗血清的制备

目的 截短表达小反刍兽疫病毒M蛋白基因并将其用于多抗血清的制备。方法 之前有研究未能表达完整的M蛋白,而若在抗原性较弱的区域将其一分为二,以截短的形式进行表达,却能达到较理想的水平。因此根据GenBank上公布的PPRV M基因的序列,设计1对特异性引物,扩增出480 bp的目的基因,将其克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,得到重组表达质粒pET-32a-PPRV-M1,后转化至Rosetta感受态细胞中,IPTG诱导表达后,通过SDS-PAGE和Western blot试验对重组蛋白进行鉴定,将纯化后的重组蛋白免疫6周龄BALB/c雌鼠,制备多克隆抗体血清。结果 经SDS-PAGE及Western blot鉴定,证明截短的M基因的蛋白主要以包涵体形式高效表达并具有良好的反应原性。结论 成功克隆表达了截短的小反刍兽疫病毒M基因的蛋白并制备了多抗血清,为建立血清学相关的检测方法及临床治疗奠定了基础。     

小反刍兽疫病毒H蛋白的原核表达及免疫原性测定

小反刍兽疫是由小反刍兽疫病毒（peste des petits ruminants virus,PPRV）引起的急性、接触性传染病,对我国的畜牧业发展造成了严重的影响,目前主要通过疫苗进行防控。为检测PPRV主要抗原蛋白血凝素（hemagglutinin,H）蛋白的免疫原性,从GenBank数据库中查找了近年来公布的H蛋白氨基酸序列,选择1条符合我国流行趋势的序列,对其基因序列进行优化合成后克隆至pET28a载体上。筛选出表达量高的Rosetta（DE3）菌株进行表达,表达产物经SDS?PAGE、Western Blot及质谱分析鉴定。经镍柱亲和层析纯化出单一H蛋白,取20 μg与佐剂混合后免疫小鼠,收集血清进行抗体效价检测,结果显示,血清中H蛋白抗体滴度在二免2周时达到1∶6 400,表明H蛋白具有较好的免疫原性。进一步对二免2周时血清进行中和抗体检测显示,小鼠血清对PPRV疫苗株具有中和效应,中和效价不超过1∶40。研究结果对H蛋白用于PPRV疫苗的研发提供了理论依据。     

小反刍兽疫病毒H和F蛋白在细胞融合中的作用

【目的】研究小反刍兽疫病毒囊膜糖蛋白(血凝素蛋白和融合蛋白)在病毒囊膜和宿主细胞膜融合过程中所发挥的作用。【方法】制备构建成功的小反刍兽疫病毒囊膜糖蛋白和病毒受体SLAM、Nectin4的真核表达质粒pCMV-HA-H、pCAGGS-Flag-F、pCMV-Myc-SLAM和pCMV-Myc-Nectin 4,将其组合转染至CHO-K1细胞,通过显微观察和间接免疫荧光技术分析小反刍兽疫病毒H和F蛋白在病毒融合过程中的功能。【结果】除空白对照组和重组质粒单独转染组细胞中没有发现合胞体外,其余组细胞中均出现了合胞体,而且F和H蛋白共转染组合胞体的数目明显较多;并在共表达H、F蛋白的细胞中观察到了蛋白分布极化的帽子现象。【结论】PPRV F蛋白是病毒囊膜和细胞膜融合的必需蛋白,但需要与PPRV H共同作用才能使病毒成功入侵靶细胞。     

西藏株小反刍兽疫病毒H蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

【背景】小反刍兽疫是由小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)引起的一种急性、烈性、接触性传染病,严重威胁我国养羊业的发展。【目的】原核表达PPRVH蛋白,并制备其多克隆抗体。【方法】根据GenBank中PPRV西藏株h基因序列,对其进行密码子大肠杆菌偏爱性优化,采用两步PCR法全化学合成全长h基因。将测序验证正确的h基因克隆至原核表达载体pET-28a、pET-30a、pET-32a,转化E. coli BL21(DE3)并利用IPTG诱导H蛋白表达。以经SDS-PAGE割胶纯化的重组H蛋白免疫新西兰大白兔制备抗PPRV H蛋白多克隆抗体。【结果】重组E. coli [pET-28a(-30a,-32a)-H]表达的重组H蛋白相对分子质量分别约为70、68和86 kD;诱导7 h时PRRV H蛋白表达量最高,而且主要以包涵体形式表达;重组E.coli(pET-30a-H)表达的H蛋白经SDS-PAGE割胶纯化后免疫新西兰大白兔制备的多抗血清能与表达的重组H蛋白发生特异性反应;ELISA法检测抗体效价在1:6400-1:25600之间。【结论】原核表达了PPRVH蛋白,并制备了高效价的抗H蛋白多克隆抗体,为进一步研究PPRV H蛋白的功能及H蛋白的线性B细胞表位作图奠定了基础。     

表达小反刍兽疫H蛋白的重组山羊痘病毒疫苗

本研究旨在构建表达小反刍兽疫H蛋白的重组山羊痘病毒,并评价其免疫效力。利用筛选基因gpt和eGFP并结合空斑技术,纯化筛选了重组小反刍兽疫H基因的重组山羊痘病毒(rGPV-PPRV-H),经过PCR鉴定重组病毒已纯化。免疫荧光和蛋白印迹都表明重组病毒能够感染绵羊羔羊睾丸细胞表达小反刍兽疫H蛋白。以2×106PFU的rGPV-PPRV-H皮内注射免疫山羊6只,并于首次免疫后28d以相同剂量进行二次免疫。免疫后采血分离血清进行病毒中和试验,结果表明,一次免疫后21d,山羊痘病毒中和抗体效价依次为40、80、≥80、≥80、40、≥80,和小反刍兽疫病毒中和抗体效价全部转阳依次为80、80、80、80、40、40、10;二次免疫后14d,山羊痘病毒中和抗体效价抗体全部大于或等于80,小反刍兽疫病毒中和抗体效价依次为≥80、80、≥80、80、80、40,应该具有对山羊痘病毒和小反刍兽疫病毒强毒攻击的完全免疫保护作用。本研究为小反刍兽疫重组山羊痘疫苗的产业化提供了参考。     

小反刍兽疫病毒N蛋白原核表达条件的优化及反应活性

目的 探讨小反刍兽疫病毒（Peste des Petits Ruminants Virus,PPRV）N蛋白原核表达、条件优化及反应活性。方法 参照GenBank中PPRV(Nigeria/75/1)N基因序列,人工合成该基因,构建重组表达质粒pET-30a(+)-N,转化至BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE电泳、Western-blot分析。在不同温度、时间、IPTG浓度条件下诱导表达N蛋白,确定最佳表达条件。结果 PPRV N蛋白（64.4 kD）成功表达,能被羊PPRV免疫血清所识别。N蛋白主要以包涵体存在,其最佳诱导条件：诱导温度28℃、IPTG终浓度2.0 mmol/L、诱导时间16 h。结论 原核表达的PPRV N蛋白具有良好的特异性和反应活性,为单克隆抗体的制备及快速诊断方法的建立提供了技术资料。     

小反刍兽疫病毒结构与功能的研究进展

小反刍兽疫病毒属于副黏病毒科麻疹病毒属,主要感染山羊、绵羊和野生小反刍兽,临床症状以发热、肺炎、腹泻及呼吸道和消化道黏膜炎症为主要特征。迄今为止对于小反刍兽疫无特效药物进行治疗,该病可对家畜养殖业造成一定的经济损失,因此对小反刍兽疫病毒病原学、结构和功能的研究已成为迫切需求。主要综述了小反刍兽疫病毒的六种结构蛋白N、P、M、F、HN、L和两种非结构蛋白C、V的基因组结构及功能,探讨了新型疫苗的研发方向,以期为小反刍兽疫病毒的深入研究、小反刍兽疫的临床防控提供参考。     

小反刍兽疫病毒全基因组遗传进化分析

为了确定中国小反刍兽疫各毒株间的进化关系,本研究从Gen Bank下载世界各国PPRV全基因组序列,以生物信息学方法建立遗传进化树。搜集到13株PPRV全基因组序列,其中中国10株,印度3株,巴基斯坦0株。中国2013~2014年毒株在同一个分支,2014年北京毒株和同年份的其它毒株相比枝条最长,2015年新疆巴州毒株独立成一个小分支。2014~2015年每一个毒株和2013年新疆伊犁毒株相比,遗传距离都最近,最小值为0.001 1。2007~2008年毒株位于另一分支,2007年西藏两毒株间遗传距离为0.000 6。毒株间的遗传关系跟地理位置呈正相关。本研究揭示国内疫情传播路线可以为中国小反刍兽疫的防控提供线索和技术支持。     

小反刍兽疫病毒诱导巨噬细胞产生炎症反应

[目的]探究小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus, PPRV)感染引起的炎症反应并解析其致病机制。[方法]分离山羊肺泡巨噬细胞(PAM),利用qRT-PCR、ELISA及组织病理切片HE染色等方法分别检测PPRV感染后引起的炎性细胞因子表达、一氧化氮(NO)含量和炎性细胞侵润等现象。进一步利用转录组学测序分析PPRV感染PAM引起的差异基因、信号通路以及差异基因的表达情况。[结果]与正常山羊相比,感染PPRV的山羊其肝脏、肾脏及肺脏的部分细胞坏死并且呈现炎性细胞侵润的现象;与对照组相比,感染后的PAM细胞显著增加了NO含量(P<0.001);与未感染组相比,PPRV感染的PAM其炎性细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-10等mRNA表达水平显著升高(P<0.05);此外,PPRV感染诱导的差异基因主要集中在炎症通路及NF-κB信号通路等。[结论]PPRV通过诱导大量炎性细胞侵润、增加炎性细胞因子表达,激活炎症信号通路从而产生炎症反应。     

羊α干扰素在家蚕中的表达及抗小反刍兽疫病毒活性测定

干扰素具有广谱抗病毒、抗肿瘤活性,可增强机体抗病毒能力,已经广泛应用于病毒性疾病的防控。小反刍兽疫病毒是危害山羊、绵羊等小反刍动物常见的病毒之一,该病毒的传播对全球养殖业造成了严重的影响。为了表达具有高效抗病毒活性的羊α干扰素(OviIFN-α),将OviIFN-α基因序列根据家蚕密码子偏好性进行优化合成,构建pVL1393-OviIFN-α转移载体,将转移载体与ORF1629缺失型杆状病毒基因组DNA利用脂质体介导的转染法在BmN细胞中进行重组,重组病毒感染家蚕,在蚕血淋巴液中获取重组蛋白OviIFN-α。利用微量细胞病变抑制法在BHK-VSV*GFP系统中检测到该蛋白表达量可达6.5×10⁵ U/mL左右。小反刍兽疫病毒增殖抑制实验显示,羊α干扰素对小反刍兽疫病毒在BHK细胞中的复制产生了明显的抑制作用,IC₅₀为136.93 U左右。该结果为羊α干扰素用于小反刍兽疫疫情防控提供了重要的理论依据。     

小反刍兽疫病毒重组抗原间接ELISA检测及初步应用

为了建立一种快速、特异、敏感的小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)血清学检测方法,本研究将PPRV血凝蛋白(H)和核蛋白(N)克隆至pET28a(+)载体进行诱导表达,并将2种蛋白Ni柱纯化后包被ELISA反应板,建立起检测PPRV特异性抗体的间接ELISA法。结果表明在E.coli BL21(DE3)中表达出2种PPRV蛋白,将2种重组蛋白纯化后按照1:1比例混合,制备PPRV鸡尾酒抗原,成功建立了特异性强、敏感性高的PPRV间接ELISA法;最后用建立的方法对新疆伊犁、塔城、阿勒泰和喀什边境地区采集的325份山羊、789份绵羊和132份牛血清进行了抗体检测,检测结果显示均为阴性,提示在我国新疆边境地区反刍动物尚未发生PPRV感染,但需要及时进行免疫接种以建立预防PPRV从国外传入的免疫带。本研究建立的PPRV间接ELISA法为该病毒的检测提供基础,也为该病的科学防控提供参考。     

仙台病毒F基因的克隆及原核表达

目的利用原核表达系统表达仙台病毒(Sendai Virus)F蛋白主要抗原片段FP(S),并对表达产物进行免疫学初步研究。方法根据GenBank公布的仙台病毒F蛋白(gi:9627219)的基因序列设计特异性引物,通过RT-PCR扩增出F基因的主要抗原片段FP(S),插入pMD-18-T载体中,鉴定正确后克隆入pQE31原核表达载体中,将鉴定正确的pQE31-FP(S)转化大肠埃希菌M15,IPTG诱导表达,对大肠埃希菌裂解物进行SDS-PAGE和Western-blot验证。结果大肠埃希菌表达的FP(S)相对分子质量约26×103,与预期相符;能与SeV阳性血清发生特异性反应,出现单一条带。结论原核表达的FP(S)蛋白有良好的抗原性,为检测仙台病毒抗体的ELISA检测方法的研究奠定了基础。     

IL-Ira-Fcε融合基因的克隆、表达及鉴定

白细胞介素-1与免疫球蛋白E在过敏性哮喘发病中发挥着重要作用.本试验克隆了白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)及IgE分子恒定区cDNA片段,构建了融合基因原核表达载体IL-1ra-Fcg/pV220.将其转化大肠杆菌BL21(DE3),实现了融合蛋白的高效表达,Western blotting结果表明表达蛋白为目的融合蛋白,主要以包涵体形式存在;利用分子筛和阳离子交换层析对表达产物经进行了纯化,纯化的包涵体复性后经体外功能试验表明,融合蛋白的活性与IL-1ra没有显著性差异;初步药代动力学分析显示IL-1ra-FeE半衰期比IL-1ra延长了4.78倍.     

F3-PE40基因的克隆、表达及纯化

通过质粒提取、PCR扩增构建F3-PE40表达载体转化大肠杆菌,然后进行表达纯化。以pEKH-F3质粒为模板,PCR扩增F3片段,将F3插入克隆质粒PQE80L,转化大肠杆菌,筛选获得含有F3的PQE80L重组载体。提取绿脓杆菌菌株染色体DNA为模板,PCR扩增绿脓杆菌外毒素A催化区（PE40）。然后将PQE80-F3和PE40重组,得到表达PQE80L-F3-PE40载体。转化至大肠杆菌DH5a,BL21,表达融合蛋白F3-PE40。大肠杆菌表达了融合蛋白F3-PE40,表达的融合蛋白量占菌体总体蛋白量的20%。成功地表达了融合蛋白F3-PE40,为进一步大规模表达、纯化F3-PE40功能奠定了基础。     

小反刍兽疫病毒基因组全长cDNA的构建及其序列的测定

根据小反刍兽疫Nigeria75/1株全基因组序列设计并合成PPRV特异引物,进而应用RT-PCR技术分5段扩增了PPRV全基因组cDNA。将扩增的各个cDNA重叠片段JF1、JF2、JF3、JF4和JF5分别克隆到载体上,建立了PPRV的初级cDNA克隆。在扩增5′末端时,引入AscI酶切位点和T7启动子序列;在基因组3′末段引入PacI酶切位点,后者供cDNA模板的线性化之用。将扩增片段再依次连接,最后亚克隆到质粒pok12中,获得了PPRV全长基因组cDNA克隆pok12-PPRV。通过序列同源性和进化树分析,结果表明,Nigeria75/1与MV和RPV的遗传关系最近。Nigeria75/1株全长cDNA的序列测定及构建,为拯救PPRV和在分子水平进一步深入研究PPRV打下坚实的基础。