柚皮苷对高糖作用下MC3T3-E1细胞活力和Akt通路相关因子表达的影响

目的探讨柚皮苷（NG）对高糖环境下MC3T3-E1细胞活力的影响及可能的分子机制。 方法体外培养小鼠MC3T3-E1细胞，实验分5组：对照组（正常无血清培养基）、高糖组（含25 mmol/L葡萄糖）、0.1 μmol/L +高糖组（0.1 μmol/L NG + 25 mmol/L葡萄糖）、1 μmol/L +高糖组（1 μmol/L NG+25 mmol/L葡萄糖）、10 μmol/L +高糖组（10 μmol/L NG+25 mmol/L葡萄糖）。药物干预后，采用CCK-8法检测细胞活力；实时荧光定量PCR（qPCR）法检测细胞成骨特异性转录因子（Runx2）、胰岛素样生长因子-1（IGF-1）、蛋白激酶（Akt1）mRNA的表达；蛋白质印迹法（Western blot）检测细胞碱性磷酸酶（ALP）、Akt1、IGF-1蛋白的表达。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。 结果CCK8检测结果显示，与对照组比较，高糖组细胞OD值（12 h：0.90±0.01比0.80±0.01，24 h：1.00±0.05比0.84±0.01，48 h：1.09±0.03比0.90±0.01）均降低，差异有统计学意义（P < 0.01）；与高糖组比较，0.1 μmol/L+高糖组细胞OD值（24 h：0.84±0.01比0.93±0.05，48 h：0.90±0.01比0.99±0.01）、1 μmol/L +高糖组和10 μmol/L+高糖组OD值（12 h：0.80±0.01比0.92±0.01、1.01±0.32，24 h：0.84±0.01比1.01±0.04、1.16±0.03，48 h：0.90±0.01比1.12±0.02、1.20±0.02）均升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。与对照组比较，高糖组细胞Runx2、IGF-1、Akt1的mRNA的表达水平（24 h：1.00比0.34±0.02、1.00比0.34±0.01、1.00比0.15±0.02）、（48 h：1.00比0.72±0.03、1.00比1.09±0.07、1.00比0.38±0.04）降低，差异有统计学意义（P < 0.01）。与高糖组比较，1 μmol/L +高糖组和10 μmol/L+高糖组细胞Runx2、IGF-1、Akt1的mRNA表达水平（24 h：0.34±0.02比0.62±0.09、0.64±0.05，0.34±0.01比0.77±0.03、1.02±0.07，0.15±0.02比0.24±0.08、0.4±0.09）、（48 h：0.72±0.03比1.27±0.02、1.37±0.02，1.09±0.07比2.44±0.19、2.73±0.04，0.38±0.04比0.86±0.06、1.43±0.03）均升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。与对照组比较，高糖组细胞ALP、Akt1、IGF-1蛋白表达水平（48 h：1.00比0.72±0.02、1.00比0.89±0.03、1.00比0.09±0.01）均降低，差异有统计学意义（P < 0.05）；与高糖组比较，0.1 μmol/L+高糖组、1 μmol/L+高糖组和10 μmol/L+高糖组ALP、Akt1、IGF-1蛋白表达水平（48 h：0.72±0.02比1.92±0.02、2.30±0.30、3.09±0.10，0.89±0.03比1.50 ± 0.03、1.43±0.04、1.40±0.13，0.09±0.01比1.75±0.01、2.30±0.31、2.07±0.07）均升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论NG逆转高糖诱导的MC3T3-E1细胞活力减退；同时改善高糖的抑制作用，促进MC3T3-E1细胞IGF-1、AKt-1、Runx2 mRNA和IGF-1、AKt-1、ALP蛋白的表达。     

柴胡皂苷D对甲状腺乳头状癌细胞TPC-1生物学行为的影响

目的探讨柴胡皂苷D对体外甲状腺乳头状癌（PTC）细胞TPC-1增殖、侵袭、迁移、活性氧和凋亡的影响。 方法不同浓度（0、5、10、20 μmol/L）柴胡皂苷D干预TPC-1细胞,CCK-8法检测细胞增殖率;Annexin-V-FITC/PI双染试剂盒检测细胞凋亡率;活性氧试剂盒检测细胞活性氧;Transwell小室法检测细胞侵袭、迁移能力;Western blot法检测凋亡蛋白剪切的半胱天冬酶3 （cleaved caspase 3）、B淋巴细胞瘤-2基因（Bcl-2）、Bcl2相关X蛋白（Bax）和侵袭迁移相关蛋白E钙黏蛋白（E-cadherin)和N钙黏蛋白（N-cadherin）及Wnt/β连环蛋白（β-catenin）信号通路相关蛋白Wnt3a和β-catenin的表达量。多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验。 结果与0 μmol/L柴胡皂苷D干预相比,（5、10、20 μmol/L）柴胡皂苷D干预TPC-1细胞存活率[24 h：（88.07±0.75）%、（76.06±0.56）%、（65.80± 1.66）%比（100.00±1.00）%;48 h：（72.40±0.35）%、（52.26± 0.22）%、（41.30±0.17）%比（100.00± 1.53）%;72 h：（56.50±0.22）%、（40.26±0.21）%、（31.10± 0.14）%比（100.00±0.14）%]、细胞侵袭率[（65.43±1.32）%、（49.46±0.31）%、（22.48±0.85）%比（100.00±1.25）%]、迁移率[（67.45±0.96）%、（52.42±0.39）%、（42.12±1.10）%比（100.00±2.00）%]、Bcl-2蛋白表达量（0.51±0.02、0.31±0.02、0.22±0.02比0.62±0.01）、Wnt3a表达量（0.56±0.06、0.37±0.01、0.26±0.02比0.72±0.03）、β-catenin表达量（0.59±0.02、0.40±0.03、0.14±0.03比0.82±0.03）和N-cadherin表达量（0.49±0.05、0.34 ±0.03、0.14± 0.03比0.62±0.05）均降低,细胞活性氧含量增加,凋亡率[（12.36±1.32）%、（23.15±2.27）%、（36.65±3.22）%比（7.32±1.25）%]、Bax蛋白表达量（0.45±0.02、0.51±0.01、0.79±0.02比0.32±0.01）、cleaved caspase-3蛋白表达量（0.26±0.02、0.37±0.02、0.40±0.02比0.13±0.01）和E-cadherin表达量（0.20±0.02、0.37±0.02、0.46±0.05比0.12±0.01）均增加（P均< 0.05）。 结论柴胡皂苷D能够抑制PTC细胞的生物学行为。     

FBXO6介导的ERO1L泛素化降解对膀胱癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用研究

目的探究F盒蛋白6 （FBXO6）对膀胱癌细胞的作用及其作用机制。 方法体外培养人正常膀胱上皮细胞株（SV-HUC-1）和人膀胱癌细胞株（T24）。用过表达载体阴性对照（oe-NC）、过表达FBXO6 （oe-FBXO6）、过表达内质网氧化还原蛋白-1样蛋白（oe-ERO1L）及oe-FBXO6和oe-ERO1L慢病毒液（MOI = 20）感染T24细胞。RT-qPCR检测细胞FBXO6和ERO1L mRNA表达;放线菌酮（CHX）蛋白合成抑制实验检测T24细胞ERO1L蛋白稳定性;免疫共沉淀（Co-IP）实验检测FBXO6对ERO1L泛素化调控;Western blot检测细胞FBXO6和ERO1L蛋白表达;CCK-8检测细胞活力;克隆形成实验检测细胞增殖;Transwell实验检测细胞迁移和侵袭。两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验。 结果与SV-HUC-1相比,T24细胞中FBXO6 mRNA （1.00±0.05比0.33±0.02）和蛋白表达（1.00±0.11比0.31±0.03）均降低（P均< 0.05）,而ERO1L mRNA （1.00±0.05比2.70±0.12）和蛋白表达（1.00±0.16比3.27±0.09）均升高（P均< 0.05）。FBXO6可降低ERO1L蛋白稳定性并促进ERO1L泛素化。与空白对照和oe-NC相比,oe-FBXO6细胞中FBXO6 mRNA （1.00±0.06比3.74±0.18）和蛋白表达（1.00±0.10比2.25±0.06）均升高,ERO1L蛋白表达（0.99±0.08比0.21±0.03）,细胞活力、克隆形成数[（78.00±3.00）比（41.67±2.52）个]、迁移[（150.67±5.03）比（91.67±5.51）个]和侵袭细胞数[（122.00±7.00）比（74.67±5.51）个]均降低（P均< 0.05）;与oe-NC相比,oe-ERO1L细胞中ERO1L蛋白表达（1.01±0.06比2.58±0.02）、细胞活力、克隆形成数[ （78.00±3.00）比（121.67±7.64）个]、迁移[（150.67±5.03）比（230.33±12.01）个]和侵袭细胞数[（122.00±7.00）比（203.00± 11.53）个]均升高（P均< 0.05）;与oe-FBXO6相比,oe-FBXO6+oe-ERO1L细胞中ERO1L蛋白表达（0.54±0.02比1.02±0.06）,细胞活力、克隆形成数[（41.67±2.52）比（62.00±3.61）个]、迁移[（91.67±5.51）比（131.67±6.03）个]和侵袭细胞数[（74.67±5.51）比（102.67±7.51）个]均升高（P均< 0.05）。 结论FBXO6通过介导ERO1L泛素化降解抑制膀胱癌细胞增殖、迁移和侵袭。     

miR-363-3p靶向 TWIST1调控上皮间质转化抑制非小细胞肺癌A549细胞迁移和侵袭

目的探讨miR-363-3p靶向TWIST1调控非小细胞肺癌A549细胞迁移和侵袭的分子机制。 方法将体外培养的A549细胞分为空白对照组（细胞未做任何处理）;模拟物对照组（转染miR-363-3p模拟物阴性对照）;模拟物组（转染miR-363-3p模拟物）;后期实验另设：模拟物+ pcDNA组（转染miR-363-3p模拟物和pcDNA3.1空载体质粒）;模拟物+ TWIST1组（转染miR-363-3p模拟物和pcDNA3.1-TWIST1过表达质粒）。采用RT-PCR检测细胞中miR-363-3p的表达,Western blot检测细胞中TWIST1蛋白和上皮间质转化（EMT）相关蛋白Vimentin、E-cadherin的表达,Transwell小室实验检测细胞的迁移和侵袭。双荧光素酶报告基因实验检测miR-363-3p和TWIST1的靶向关系。两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验。 结果与空白对照组和模拟物对照组比较,模拟物组A549细胞中miR-363-3p表达水平（1.00±0.08、0.97±0.05比3.82±0.45）升高,TWIST1 mRNA （1.00±0.06、0.98±0.06比0.39±0.02）和蛋白的表达水平（0.81±0.05、0.78±0.06比0.42±0.02）降低,差异具有统计学意义（P均< 0.05）。与空白对照组和模拟物对照组比较,模拟物组A549细胞Vimentin蛋白表达水平（0.58±0.04、0.55±0.05比0.36±0.03）降低,E-cadherin蛋白的表达水平（0.22±0.02、0.25±0.03比0.47±0.03）增高,迁移细胞数（85.75±5.45、83.52±6.85比53.05±4.50）和侵袭细胞数（128.26±6.15、125.95±8.05比71.64±5.75）降低,差异有统计学意义（P均< 0.05）。与模拟物对照组比较,模拟物组细胞中Vimentin蛋白的表达水平（0.55±0.05比0.36±0.03）降低,而E-cadherin蛋白表达水平（0.25±0.03比0.47±0.03）升高,迁移细胞数（83.52±6.85比53.05±4.50）和侵袭细胞数（125.95±8.05比71.64±5.75）均减少（P均< 0.05）。TWIST1是miR-363-3p潜在的靶基因。与模拟物+ pcDNA3.1组比较,模拟物+ TWIST1组A549细胞中Vimentin蛋白的表达水平（0.32±0.02比0.42±0.03）升高,而E-cadherin蛋白表达水平（0.56±0.04比0.38±0.03）降低,A549细胞的迁移数（49.45±4.22比67.52±5.05）和侵袭数（72.45±5.73比108.35±6.56）增加（P均< 0.05）。 结论miR-363-3p可通过靶向TWIST1调控EMT抑制A549细胞迁移和侵袭。     

circ_0000267靶向miR-198对急性淋巴细胞白血病细胞KOCL44增殖和凋亡的影响

目的探讨circ_0000267对急性淋巴细胞白血病（ALL）KOCL44细胞增殖和凋亡的影响及其作用机制。 方法选择ALL细胞株KOCL44为研究对象,分别将小干扰RNA （siRNA）阴性对照（si-NC）、circ_0000267 siRNA （si-circ_0000267）、微小RNA （miRNA）阴性对照（miR-NC）、miR-198模拟物（miR-198）、circ_0000267 siRNA+miRNA抑制剂阴性对照（si-circ_0000267+anti-miR-NC）和circ_0000267 siRNA+miR-198抑制剂（si-circ_0000267+anti-miR-198）转染细胞,48 h后通过RT-qPCR检测细胞circ_0000267和miR-198相对表达水平,采用CCK-8法检测KOCL44细胞的增殖水平,流式细胞术实验检测KOCL44细胞的凋亡水平,Western blot检测KOCL44细胞Ki-67、Bcl-2和Bax蛋白表达水平,通过双荧光素酶报告实验验证circ_0000267和miR-198靶向关系。两组间比较采用独立样本t检验。 结果与健康志愿者比较,ALL患者circ_0000267表达水平（1.00±0.06比3.19±0.21）上调,miR-198表达水平（1.00±0.07比0.41±0.03）下调,差异有统计学意义（P < 0.05）。敲低circ_0000267或者过表达miR-198可抑制KOCL44细胞增殖（0.68±0.05比0.32±0.02、0.69±0.06比0.39±0.03）、Ki-67 （0.84±0.06比0.37±0.03、0.85±0.06比0.45±0.04）和Bcl-2蛋白表达（0.63±0.05比0.22±0.02、0.65±0.04比0.29±0.02）,促进细胞凋亡[（6.53±0.51）﹪比（24.29±2.06）﹪、（7.38±0.57）﹪比（20.03±1.66）﹪]和Bax蛋白表达（0.31±0.03比0.77±0.04、0.30±0.02比0.71±0.04）,差异有统计学意义（P < 0.05）。双荧光素酶报告实验验证circ_0000267可以靶向miR-198表达,干扰miR-198表达可以逆转抑制circ_0000267表达对KOCL44细胞的增殖和凋亡的作用,差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论circ_0000267通过调控miR-198抑制ALL细胞增殖,并促进凋亡,为临床治疗ALL提供新的依据。     

HOXA-AS2靶向miR-17对人脐静脉内皮细胞生物学功能以及炎症因子的影响

目的探讨HOXA-AS2对动脉粥样硬化（AS）模型细胞生物学功能以及炎症因子的影响及分子机制。 方法本实验共分为4个实验;实验1：用100 μg/mL的ox-LDL处理EA.hy926细胞作为ox-LDL组,正常培养的细胞作为对照组;实验2：将pcDNA3.1、pcDNA3.1-HOXA-AS2转染至EA.hy926细胞中再用100 μg/mL的ox-LDL处理,记为ox-LDL+pcDNA3.1组、ox-LDL+pcDNA3.1-HOXA-AS2组;实验3：将pcDNA3.1、pcDNA3.1-HOXA-AS2、si-NC、si-HOXA-AS2分别转染至EA.hy926细胞中,记为pcDNA3.1组、pcDNA3.1-HOXA-AS2组、si-NC组、si-HOXA-AS2组;实验4：将pcDNA3.1-HOXA-AS2与miR-NC、miR-17分别共转染至EA.hy926细胞中再用100 μg/mL的ox-LDL处理,记为ox-LDL+pcDNA3.1-HOXA-AS2+miR-NC组、ox-LDL+pcDNA3.1-HOXA-AS2+miR-17组。实时荧光定量PCR （RT-qPCR）检测HOXA-AS2和miR-17的表达水平;蛋白质印迹（Western blot）法检测细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A （P21）、cleaved caspase 3蛋白表达;MTT检测细胞增殖情况;流式细胞术检测细胞凋亡;ELISA法检测白细胞介素-1 （IL-1）、白细胞介素-6 （IL-6）水平;荧光素酶报告实验检测HOXA-AS2和miR-17的靶向关系。两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验。 结果与对照组比较,ox-LDL组EA.hy926细胞中HOXA-AS2表达水平（0.23±0.02比1.02±0.10）,细胞增殖率[（47.83±5.01）﹪比（100.06±10.20）﹪]均降低,细胞凋亡率[（26.81±2.47）﹪比（8.23±0.80）﹪]、P21 （0.82±0.08比0.20±0.02）、cleaved caspase 3 （0.67±0.06比0.14±0.01）、IL-1[（792.34±59.37）ng/L比（326.14±34.59） ng/ L]和IL-6表达水平[（53.67±4.65）ng/L比（19.25±2.11）ng/L]均升高,差异具有统计学意义（P均< 0.05）。与ox-LDL+pcDNA3.1组比较,ox-LDL+pcDNA3.1-HOXA-AS2组EA.hy926细胞中HOXA-AS2表达水平（0.87±0.09比0.22±0.02）、细胞增殖率[（89.94±8.34）﹪比（48.21±4.86）﹪]均升高,细胞凋亡率[（12.33±1.18）﹪比（26.83±2.48）﹪]、P21 （0.33±0.03比0.81±0.08）、cleaved caspase 3 （0.24±0.02比0.69±0.06）、IL-1[ （446.25±46.84）ng/L比（802.21±60.18）ng/L]和IL-6表达水平[（25.64±2.65）ng/L比（55.21±5.10）ng/L]均降低,差异具有统计学意义（P均< 0.001）。与ox-LDL+pcDNA3.1-HOXA-AS2+miR-NC组比较,ox-LDL+pcDNA3.1-HOXA-AS2+miR-17组EA.hy926细胞中miR-17表达水平（2.14±0.21比1.05±0.10）、细胞凋亡率[（23.31±2.33）﹪比（13.75±1.44）﹪]、IL-1水平[（684.26±62.38）ng/L比（451.21±43.58）ng/L]、IL-6水平[（41.29±4.37）ng/L比（26.11±2.39）ng/L]均升高,细胞增殖率[（53.67±5.46）﹪比（90.21±9.16）﹪]降低,差异具有统计学意义（P均< 0.001）。HOXA-AS2与miR-17存在结合位点,荧光素酶报告实验显示,与miR-NC组比较,miR-17组中转染WT-HOXA-AS2的EA.hy926细胞荧光素酶活性降低（0.33±0.03比1.01±0.10,P < 0.05）,而转染MUT-HOXA-AS2的EA.hy926细胞荧光素酶活性差异无统计学意义（P > 0.05）;与anti-miR-NC组比较,anti-miR-17组中转染WT-HOXA-AS2的EA.hy926细胞荧光素酶活性升高（2.29±0.21比1.00±0.10,P < 0.05）,而转染MUT-HOXA-AS2的EA.hy926细胞荧光素酶活性差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论过表达HOXA-AS2促进细胞增殖,抑制ox-LDL引起的细胞凋亡和炎症因子的释放,其机制可能与miR-17有关。     

lncRNA RPL34-AS1通过靶向调控miR-575表达对卵巢癌SKOV3细胞增殖和凋亡的影响

目的探究RPL34-AS1对卵巢癌细胞增殖、迁移的影响及其作用机制。 方法取对数生长期SKOV3细胞用无血清培养基同步化12 h,将pcDNA、pcDNA-RPL34-AS1、si-NC、si-RPL34-AS1、anti-miR-NC、anti-miR-575转染至SKOV3细胞中,分别记为pcDNA组、pcDNA-RPL34-AS1组、si-NC组、si-RPL34-AS1组、anti-miR-NC组、anti-miR-575组;将pcDNA-RPL34-AS1与miR-NC、miR-575分别共转染至SKOV3细胞中,记为pcDNA-RPL34-AS1+miR-NC组、pcDNA-RPL34-AS1+miR-575组。实时荧光定量PCR （RT-qPCR）检测临床组织标本及转染后各组细胞中RPL34-AS1和miR-575的表达水平;双荧光素酶报告实验检测RPL34-AS1和miR-575的靶向关系;四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）检测细胞存活率;流式细胞术检测细胞凋亡;蛋白质印迹（Western blot）法检测细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A （p21）、B细胞淋巴瘤/白血病-2 （Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）蛋白表达水平。两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验。 结果与癌旁组织相比,卵巢癌组织中RPL34-AS1表达水平降低（1.00±0.08比0.47±0.05）,miR-575表达水平升高（1.01±0.07比3.12±0.28）（P < 0.05）。转染si-RPL34-AS1后,细胞活性升高（48 h：0.68±0.06比0.55±0.05;72 h：0.99±0.08比0.71±0.06）,G1期细胞所占比例降低（13.42±1.38比32.15±2.11）,S期细胞所占比例升高（53.75±5.22比34.69±3.41）,细胞凋亡率降低（4.31±0.42比9.25±0.91）,CyclinD1、Bcl-2表达水平升高（0.92±0.08比0.71±0.07;0.86±0.07比0.61±0.06）,p21、Bax表达水平降低（0.13±0.02比0.29±0.03;0.19±0.02比0.31±0.03） （P均< 0.05）。RPL34-AS1靶向调控miR-575,过表达RPL34-AS1或抑制miR-575后可抑制细胞活性,阻滞细胞周期和促进细胞凋亡。miR-575过表达逆转了RPL34-AS1过表达对卵巢癌SKOV3细胞增殖抑制和凋亡促进的作用。 结论过表达RPL34-AS1可抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖,促进细胞凋亡,其机制可能与下调miR-575有关。     

下调血管生成素样蛋白7表达对血管紧张素Ⅱ介导的血管平滑肌细胞炎症反应的影响

目的探讨RNA干扰血管生成素样蛋白7 （Angptl7）基因对血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导的血管平滑肌细胞（VSMC）炎症因子的影响及其作用机制。 方法体外培养人VSMC,分为常规F12K培养基培养（对照）和1 μg/mL AngII培养24 h。VSMC用AngⅡ（1 μg/mL）处理24 h后,采用siRNA-Angptl7和阴性对照siRNA-NC在Lipofectamine 2000介导下转染VSMC。RT-qPCR检测mRNA表达水平;Griess反应测定一氧化氮（NO）含量;蛋白免疫印记法检测相关蛋白的改变;酶联免疫吸附法检测VSMC中炎症因子肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素-1β （IL-1β）和IL-6水平。多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验,两组间比较采用独立样本t检验。 结果与对照比较,1 μg/mL AngⅡ处理可促进VSMC中Angptl7 mRNA （0.97±0.06比3.05±0.21）和蛋白表达（1.01±0.12比1.61±0.14）,亦可促进VSMC中IL-1β[（45.21±8.10）比（126.17±11.77） pg/mL]、IL-6[（50.50±7.51）比（108.50±9.51）pg/mL]和TNF-α的表达[（60.77±9.58）比（185.67±17.35）pg/mL],差异有统计学意义（P均< 0.01）。与对照和转染siRNA-NC相比,转染siRNA-Angptl7下调Angptl7蛋白表达（0.99±0.12,0.98±0.12比0.44±0.14,P < 0.01）。与AngⅡ干预组相比,siRNA-Angptl7降低AngⅡ介导的VSMC炎症反应相关蛋白TNF-α、IL-6和IL-1β的表达,核因子κB （NF-κB）/诱导型一氧化氮合酶（iNOS）/环氧化酶2 （COX-2）信号通路相关蛋白NF-κB、iNOS和COX-2表达及NO含量亦降低,差异有统计学意义（P均< 0.01）。与siRNA-NC相比,siRNA-Angptl7组AngⅡ诱导的VSMC炎症反应相关蛋白TNF-α （0.99±0.13比0.51±0.12）、IL-6 （1.00±0.12比0.38±0.05）和IL-1β的表达（0.99±0.14比0.48±0.11）,NF-κB （1.00±0.10比0.42±0.08）、iNOS （1.02±0.12比0.42±0.10）和COX-2表达（1.00±0.11比0.52±0.12）均降低,NO含量[（54.78±2.76）比（18.08±3.61）μmol/L]亦降低,差异有统计学意义（P均< 0.01）。 结论AngⅡ可通过Angptl7促进VSMC炎症反应,下调Angptl7蛋白表达可以抑制VSMC的炎症反应,其作用机制可能与抑制NF-κB/iNOS-COX-2信号通路有关。     

miR-106a-5p调控 PTEN对鼻咽癌细胞SUNE2增殖和迁移的抑制作用研究

目的研究miR-106a-5p对鼻咽癌细胞SUNE2增殖和迁移的影响。 方法将体外培养的鼻咽癌细胞SUNE2分成对照组（细胞未做任何处理）、Anti-NC组（转染阴性对照抑制剂）、Anti-miR-106a-5p组（转染miR-106a-5p抑制剂）、后期实验另设Anti-miR-106a-5p-inhibitor+si-NC组（转染miR-106a-5p抑制剂、siRNA阴性对照）、Anti-miR-106a-5p-inhibitor+si-PTEN组（转染miR-106a-5p抑制剂、PTEN siRNA）,采用Realtime PCR测定miR-106a-5p表达,MTT法检测增殖,Transwell小室检测细胞侵袭和迁移能力变化,用Western blot方法测定vimentin、E-cadherin蛋白表达。在线靶基因预测软件预测miR-106a-5p的靶基因可能为PTEN,双荧光素酶报告系统鉴定miR-106a-5p和PTEN的靶向关系。两组间比较用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验。 结果与正常鼻咽上皮细胞NP69比较,鼻咽癌细胞CNE-2、HK1、SUNE2中miR-106a-5p水平（1.00±0.11比1.84±0.13、2.19±0.14、2.87±0.25）升高,差异具有统计学意义（P < 0.05）。与对照组、Anti-NC组比较,Anti-miR-106a-5p组鼻咽癌细胞miR-106a-5p水平（1.00±0.10、0.99±0.12比0.76±0.08）降低,OD值（0.56±0.05、0.57±0.04比0.32±0.02）,细胞侵袭数[（128.47±11.65）个、（129.84±10.93）个比（85.12±6.75）个],迁移数[（182.51±14.81）个、（180.68±17.64）个比（122.01±11.62）个],vimentin蛋白表达水平（0.84±0.09、0.82±0.07比0.30±0.05）降低,E-cadherin蛋白表达水平（0.29±0.04、0.28±0.05比0.76±0.08）升高,差异具有统计学意义（P均< 0.05）。与Anti-miR-106a-inhibitor+si-NC组比较,Anti-miR-106a-inhibitor+si-PTEN组细胞OD值（0.33±0.03比0.52±0.05）、侵袭数[（84.16±5.91）个比（105.79±8.63）个]、迁移数[（118.42±10.25）个比（164.28±12.05）个]、vimentin蛋白表达水平（0.34±0.06比0.68±0.05）均升高,E-cadherin蛋白表达水平（0.72±0.06比0.29±0.05）降低,差异具有统计学意义（P均< 0.05）。 结论miR-106a-5p可通过靶向调控PTEN抑制鼻咽癌细胞SUNE2增殖和迁移潜能。     

吴茱萸碱抑制破骨细胞分化延缓骨丢失的研究

目的探讨吴茱萸碱对破骨细胞分化与骨吸收功能的调控及对骨质疏松症的治疗作用。 方法取小鼠原代骨髓来源巨噬细胞分别给予0、10、20、50、100、200 μmol/L吴茱萸碱处理,CCK8检测细胞活力;然后利用原代骨髓来源巨噬细胞给予小鼠重组可溶性核因子κB受体活化因子配体与集落刺激因子行破骨细胞分化诱导,分别给予20与50 μmol/L吴茱萸碱干预。抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色检测破骨细胞形成能力,荧光定量PCR分析破骨细胞分化相关基因表达,免疫荧光检测F肌动蛋白（F-actin）形成,扫描电镜观察破骨细胞骨吸收能力。7月龄C57BL/6小鼠灌胃给予100与200 mg/kg吴茱萸碱,给药3个月后Micro-CT检测小鼠骨密度与骨质量。采用单因素方差分析和t检验进行统计学分析。 结果CCK8结果显示,与对照组相比,给予10、20、50、100 μmol/L吴茱萸碱处理后细胞活力无明显变化,差异无统计学意义（P > 0.05）;而给予200 μmol/L吴茱萸碱的细胞活力下降（100.64±0.18比47.54±5.58）,差异具有统计学意义（P < 0.01）。与对照组相比,20 μmol/L吴茱萸碱的TRAP染色阳性细胞数[（200.57±28.35）比（142.29±19.21）个]、Trap （1.00±0.13比0.55±0.16）、组织蛋白酶K（Ctsk） （1.01±0.17比0.59±0.11）mRNA水平、骨吸收面积比（1.00±0.15比0.79±0.19）均减少,差异有统计学意义（P < 0.05）。与对照组相比,50 μmol/L吴茱萸碱的TRAP阳性细胞数[（200.57±28.35）比（112.71±12.18）个]、Trap （1.00±0.13比0.46±0.17）、Ctsk（1.01±0.17比0.49±0.12）、树突状细胞-特异性跨膜蛋白（DC- Stamp） （1.00±0.10比0.55±0.14）、c-Fos （1.01±0.10比0.58±0.14）、活化T细胞核因子c1 （Nfatc1） （1.00±0.10比0.59±0.14）、H+转运ATP酶v0亚基d2 （Atp6v0d2）的mRNA表达（1.00±0.10比0.59±0.18）、F-actin数量[（165.00± 18.50）比（98.33±21.15）个]和骨吸收面积比（1.00±0.15比0.62±0.10）均降低,差异有统计学意义（P < 0.05）。Micro-CT结果显示,与生理盐水组相比,100 mg/kg吴茱萸碱组小鼠骨密度有一定升高[（0.19±0.03）比（0.21±0.01）g/cm³],但差异无统计学意义（P > 0.05）;与生理盐水组相比,200 mg/kg吴茱萸碱组小鼠胫骨的骨密度[（0.19±0.03）比（0.23±0.01）g/cm³]、骨体积比[（9.79±1.39）﹪比（11.62±1.18）﹪]、骨小梁数量[（2.43±0.29）比（3.08±0.43）/mm]上升,骨小梁分离度[（0.44±0.06）比（0.27±0.05）mm]下降,差异具有统计学意义（P < 0.05）。 结论吴茱萸碱通过抑制破骨细胞分化与骨吸收功能延缓小鼠骨量丢失。     

Dipeptidyl-peptidase-IV by cleaving neuropeptide Y induces lipid accumulation and PPAR-γ expression

We evaluated the effects of dipeptidyl peptidase-IV (DPPIV), and its inhibitor, vildagliptin, on adipogenesis and lipolysis in a pre-adipocyte murine cell line (3T3-L1). The exogenous rDPPIV increased lipid accumulation and PPAR-γ expression, whereas an inhibitor of DPPIV, the anti-diabetic drug vildagliptin, suppresses the stimulatory role of DPPIV on adipogenesis and lipid accumulation, but had no effect on lipolysis. NPY immunoneutralization or NPY Y(2) receptor blockage inhibited DPPIV stimulatory effects on lipid accumulation, collectively, indicating that DPPIV has an adipogenic effect through NPY cleavage and subsequent NPY Y(2) activation. Vildagliptin inhibits PPAR-γ expression and lipid accumulation without changing lipolysis, suggesting that this does not impair the ability of adipose tissue to store triglycerides inside lipid droplets. These data indicate that DPPIV and NPY interact on lipid metabolism to promote adipose tissue depot.     

Promotion of human mesenchymal stem cell differentiation on bioresorbable polycaprolactone/biphasic calcium phosphate composite scaffolds for bone tissue engineering

An artificial construct mimicking the intrinsic properties of the natural extracellular matrix in bones has been considered an ideal platform for bone tissue engineering, as it can present an appropriate microenvironment and regulate cell behaviours. In this report, we introduce biodegradable composite scaffolds consisting of polycaprolactone (PCL) and biphasic calcium phosphate (BCP). The scaffolds were fabricated by a salt-leaching process, and the ability of the scaffolds to facilitate osteogenic differentiation was investigated using human mesenchymal stem cells (hMSCs). The scaffolds had an inter-connected porous structure with quadrilateral pores of approximately 200 ～ 500 μm in width. The mechanical properties of the scaffolds changed as the BCP content was increased in the starting mixture. In the hMSC experiment, although we found that hMSCs adhered to the surface, as well as the inside, of the scaffolds, the incorporated BCP did not increase the proliferation of the hMSCs over 7 days in culture. Interestingly, the alkaline phosphatase (ALP) activity was 4 times higher on the PCL/BCP composite scaffold (0.12 ± 0.03 nmol/min/μg protein) thanon the PCL scaffold (0.03 ± 0.01 nmol/min/μg protein), suggesting that BCP can aid in generating a local environment that promotes bone regeneration. Therefore, a strategy combining polymers and ceramics can be considered a useful platform for bone tissue engineering.     

CTRP4基因表达上调通过抑制炎症因子调控食欲调节相关蛋白表达

上调中枢补体C1q/肿瘤坏死因子相关蛋白4(complement-C1q/tumor necrosis factor-related protein 4, CTRP4) 可以改变下丘脑食欲调节相关蛋白的表达,抑制小鼠摄食且降低其体重。然而,CTRP4如何调控食欲调节相关蛋白的表达尚不清楚。本研究通过上调小鼠神经母细胞瘤细胞(N2a)中的CTRP4,探讨CTRP4调控食欲调节相关蛋白的潜在作用机制。通过对N2a细胞未做干预、转染绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)重组腺病毒和CTRP4过表达重组腺病毒,将其分为空白对照组(Control组)、阴性对照组(Ad-GFP组)及CTRP4过表达组(Ad-CTRP4组)。干预72 h时,用实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测细胞CTRP4 mRNA表达,采用Western 印迹检测细胞CTRP4、Pomc、Npy、p-STAT3/t-STAT3、TNF-α、IL-6、SOCS3在蛋白质水平的表达。结果显示,与对照组相比,Ad-CTRP4组的CTRP4 mRNA水平(26 258.44±10 403.47 vs. 1.81±0.79 vs. 1.00±0.00, P<0.01)及蛋白质水平显著增加(10.44±7.99 vs.0.64±0.62 vs. 1.00±0.75, P<0.01)。Ad-CTRP4组的p-STAT3/t-STAT3(3.38±1.70 vs. 0.86±0.57 vs. 1.00±0.63, P<0.01)和Pomc(1.81±0.19 vs. 1.15±0.18 vs. 1.00±0.22, P<0.01)表达均显著增高;SOCS3(0.69±0.15 vs. 1.00±0.12 vs. 1.00±0.07, P<0.01),IL-6(0.40±0.19 vs. 1.03±0.17 vs. 1.00±0.16, P<0.01),TNF.α(0.39±0.27 vs. 1.05±0.46 vs. 1.00±0.29, P<0.05)及Npy (0.55±0.14 vs. 1.21±0.38 vs. 1.00±0.24, P<0.05)表达均显著下降。上述结果提示,在N2a细胞中,上调CTRP4可能通过抑制炎症因子TNF-α和IL-6,降低负性调节因子SOCS3的表达,增加STAT3磷酸化表达水平,从而调控食欲调节相关蛋白的表达。     

Fabrication of porous polycaprolactone/hydroxyapatite (PCL/HA) blend scaffolds using a 3D plotting system for bone tissue engineering

For tissue engineering and regeneration, a porous scaffold with interconnected networks is needed to guide cell attachment and growth/ingrowth in three-dimensional (3D) structure. Using a rapid prototyping (RP) technique, we designed and fabricated 3D plotting system and three types of scaffolds: those from polycaprolactone (PCL), those from PCL and hydroxyapatite (HA), and those from PCL/HA and with a shifted pattern structure (PCL/HA/SP scaffold). Shifted pattern structure was fabricated to increase the cell attachment/adhesion. The PCL/HA/SP scaffold had a lower compressive modulus than PCL and PCL/HA scaffold. However, it has a better cell attachment than the scaffolds without a shifted pattern. MTT assay and alkaline phosphatase activity results for the PCL/HA/SP scaffolds were significantly enhanced compared to the results for the PCL and PCL/HA scaffolds. According to their degree of cell proliferation/differentiation, the scaffolds were in the following order: PCL/HA/SP > PCL/HA > PCL. These 3D scaffolds will be applicable for tissue engineering based on unique plotting system.     

聚己内酯静电纺丝纳米纤维支架用于小鼠诱导多能干细胞培养

干细胞联合生物支架材料体外构建功能性组织与器官,成为当前组织再生研究的重要策略,而探求具有良好生物相容性的支架材料是其关键.本研究采用扫描电镜、噻唑蓝（MTT）法、荧光显微染色等方法检测小鼠诱导多能干细胞（murine induced pluripotent stem cells, miPSCs）在聚己内酯（poly ε-caprolactone, PCL）静电纺丝纳米纤维支架上的粘附、增殖等生物学特性,探究聚己内酯纳米纤维支架与miPSCs的生物相容性. 结果显示,miPSC在PCL纳米纤维支架上具有良好粘附性并呈集落样生长,其增殖能力及干性标记物（Oct4-GFP+）的表达均不亚于标准对照组;扫描电镜显示,miPSC在PCL纳米纤维支架材料上呈现出绒毛状突起的表面结构.上述结果表明,PCL纳米纤维支架可促进miPSCs的粘附、自我增殖以及干性维持,两者具有良好的生物相容性,为下一步联合生物支架材料与干细胞构建功能性组织奠定了基础.     

Engineering of vascularized adipose constructs

Adipose tissue engineering offers a promising alternative to the current surgical techniques for the treatment of soft tissue defects. It is a challenge to find the appropriate scaffold that not only represents a suitable environment for cells but also allows fabrication of customized tissue constructs, particularly in breast surgery. We investigated two different scaffolds for their potential use in adipose tissue regeneration. Sponge-like polyurethane scaffolds were prepared by mold casting with methylal as foaming agent, whereas polycaprolactone scaffolds with highly regular stacked-fiber architecture were fabricated with fused deposition modeling. Both scaffold types were seeded with human adipose tissue-derived precursor cells, cultured and implanted in nude mice using a femoral arteriovenous flow-through vessel loop for angiogenesis. In vitro, cells attached to both scaffolds and differentiated into adipocytes. In vivo, angiogenesis and adipose tissue formation were observed throughout both constructs after 2 and 4?weeks, with angiogenesis being comparable in seeded and unseeded constructs. Fibrous tissue formation and adipogenesis were more pronounced on polyurethane foam scaffolds than on polycaprolactone prototyped scaffolds. In conclusion, both scaffold designs can be effectively used for adipose tissue engineering.     

氧化低密度脂蛋白经AMPK/mTOR信号通路诱导HUVECs自噬

氧化低密度脂蛋白（oxygenized low density lipoprotein, ox-LDL）诱导人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVECs）损伤有助于动脉粥样硬化（atherosclerosis, AS）的发展。但ox-LDL对HUVECs自噬的影响及机制尚不清楚。为探究其机制,采用体外培养HUVECs,建立ox-LDL损伤模型。透射电子显微镜观察HUVECs中自噬体的变化;Western印迹法检测p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR及Beclin1、LC3-II、P62的表达。结果显示,与对照组比较,透射电子显微镜下观察到ox-LDL组的自噬体明显增多。Western印迹结果显示,与对照组比较,ox-LDL组Beclin1(0.81±0.04 vs. 1.83±0.11,P＜0.01)、LC3-II(0.80±0.06 vs. 1.61±0.06, P＜0.01)和P62(0.65±0.10 vs. 1.64±0.17, P＜0.01)表达显著增高。ox-LDL和BafilomycinA1共同干预组Beclin-1(3.15±0.15 vs. 3.17±0.13, P>0.05)、LC3-II(2.95±0.12 vs. 2.96±0.12, P >0.05)和P62(3.26±0.15 vs. 3.19±0.15, P>0.05)表达与BafilomycinA1组无显著差异,ox-LDL未使自噬起始增加,可能是降解受损导致自噬体的积累。与对照组比较,ox-LDL增加p-AMPK (0.47±0.03 vs. 0.96±0.03, P＜0.01)表达,并降低p-mTOR(0.86±0.04 vs. 0.25±0.05, P＜0.01)表达。单独阻断mTOR时, Beclin-1(0.81±0.05 vs. 2.19±0.17, P＜0.01)、LC3-II(0.76±0.13 vs 2.00±0.05, P＜0.01)和P62(0.74±0.12 vs. 1.94±0.11, P＜0.01)表达显著增加。亮氨酸（Leucine）可增加p-mTOR(0.87±0.11 vs. 1.67±0.07, P＜0.01)表达,并降低Beclin-1(0.81±0.05 vs. 0.37±0.03, P＜0.01)、LC3-II（0.76±0.13 vs. 0.41±0.02, P＜0.01）和P62（0.76±0.10 vs. 0.44±0.04, P＜0.01）表达,但ox-LDL可使Leucine预处理后的p-mTOR（1.67±0.11 vs. 0.82±0.02, P＜0.01）表达显著降低,并且Beclin-1（0.37±0.03 vs. 0.78±0.04, P＜0.01）、LC3-II（0.41±0.02 vs. 0.78±0.02, P＜0.01）和P62（0.44±0.04 vs. 0.74±0.04, P＜0.01）表达显著增加。说明mTOR参与ox-LDL诱导的自噬。与ox-LDL组相比,ox-LDL和Si-AMPK共同处理组p-mTOR(0.25±0.05 vs. 0.46±0.03, P＜0.01)表达增加以及Beclin-1(1.97±0.04 vs. 1.26±0.12, P＜0.01)、LC3-II(1.42±0.10 vs. 0.95±0.05, P＜0.01)和P62(1.58±0.09 vs. 0.98±0.11, P＜0.01)表达降低。以上结果表明,ox-LDL通过AMPK/mTOR途径诱导HUVECs发生自噬,并且导致自噬体的积累。