用原位分子杂交和免疫组化研究肾综合征出血热肾组织中的病毒感染

应用原位分子杂交和免疫组化技术研究了陕西、沈阳、上海、江西、广州等地收集的３６例肾综合征出血热（ＨＦＲＳ）尸检肾组织中的病毒ＲＮＡ和抗原的定位和分布。病毒ＲＮＡ检测３４例,２８例阳性;抗原检测３４例,３０例阳性,病毒ＲＮＡ及其抗原主要定位于细胞胞浆中。西安及沈阳地区的病例,病毒ＲＮＡ和抗原阳性部位主要是肾小管上皮细胞,较少出现血管阳性。上海、江西和广州地区病例病毒ＲＮＡ主要出现于肾间质血管和少数病例的个别肾小球毛细血管和肾小管上皮细胞;病毒抗原分布于肾间质血管和肾小管上皮中。１例（广州病例）肾血管平滑肌细胞检测到空泡状病毒ＮＰ抗原。另外在３例西安病例和９例上海病例肾远曲小管和集合管上皮中检测到ＮＰ和ＨＡ阳性的病毒包涵体。结果说明ＨＦＲＳ病毒可感染肾脏中肾小管上皮和血管内皮,并在肾小管上皮细胞产生包涵体。不同地区病例肾脏中病毒感染的部位不同,可能与不同地区病例所感染的病毒毒株或血清型不同有关。肾小管上皮细胞和血管内皮的损伤除病毒直接作用外,还可能有免疫因素参与。     

肾综合征出血热人体组织中病毒包涵体的性质及意义的进一步研究

应用免疫组化、原位分子杂交、电镜及免疫电镜等方法进一步对肾综合征出血热人体尸检组织中病毒包涵体（ＩＢ）的抗原、核酸性质和超微结构特点作了进一步观察。结果,在３９例中的２０例尸检病例组织中显示出病毒核蛋白抗原和血凝素抗抗原阳性的ＩＢ,其中包括１６例陕西尸检病例组织中的６例休克期和１例多尿期病例,１７例上海病例中的３例休克期和９例少尿期病例及３例江西病例中的１例休克期病例。ＩＢ主要分布在呼吸道和肺泡、肾远曲小管和集合管、胃肠道、腺垂体、扁桃体、胰腺、前列腺等组织的粘膜上皮和腺上皮细胞及肝细胞和睾丸生精上皮细胞胞浆中,阳性细胞形态基本正常。应用原位分子杂交,可在该组细胞小同时检测到病毒ＲＮＡ,多为胞浆内弥漫阳性,仅少数组织中显示出病毒ＲＮＡ阳性ＩＢ结构。电镜观察阳性组织细胞中出现由大量微丝微管及颗粒样结构组成的ＩＢ结构,其小的病毒颗粒状结构、内质网及纤维丝状结构呈病毒抗原阳性,上述结构位于高尔基体区。结果说明该病毒有感染上皮细胞的特性,对其宿主细胞的致细胞病变作用是极其温和的,且多表现在亚细胞水平。ＩＢ可能是病毒过量表达抗原的堆积或病毒复制部位,而微丝微管结构可能参与病毒的感染过程。     

原位分子杂交法检测恙螨体内肾综合征出血热病毒核酸的研究

为探讨肾综合征出血热病毒（ＨＦＲＳＶ）在恙螨体内的分布和定位,采用原位分子杂交技术检测恙螨体内ＨＦＲＳＶＲＮＡ。结果发现：原位分子杂交技术的检出阳性率较ＩＦＡＴ高;ＨＦＲＳＶ阳性信号颗粒呈弥散分布,多见于恙螨幼虫和若虫的腹部组织细胞内,该部位是恙螨的卵巢细胞、中肠及支囊上皮细胞。前体组织细胞内少见;个别幼虫和若虫的前足和中足细胞内亦可见到ＨＦＲＳＶＲＮＡ阳性信号。在原位分子杂交中,若虫组织细胞内的ＨＦＲＳＶＲＮＡ阳性信号较幼虫密集而且量多,表明ＨＦＲＳＶ在恙螨体内可传递并有增殖现象     

流行性出血热尸检组织中热休克蛋白70mRNA的定位及分布

应用核酸原位分子杂交技术研究了国内不同地区３０例流行性出血热患者尸检组织中病毒ＲＮＡ及ＨＳＰ７０ｍＲＮＡ细胞内定位,同时观察了汉坦病毒感染的ＶｅｒｏＥ６细胞中ＨＳＰ７０的表达情况。结果表明,热休克蛋白７０ｍＲＮＡ在多数组织中均可检测到,分布与病毒ＲＮＡ一致,并且与组织的病理损害有关;体外实验的结果也表明在出血热病毒感染的细胞中有ＨＳＰ７０的高表达。提示热休克蛋白与汉坦病毒的致病以及流行性出血热的发病机理有关。     

原位杂交检测石蜡包埋组织中丙型肝炎病毒RNA

为了提高ＨＣＶＲＮＡ的原位杂交检出率,我们应用地高辛标记ＨＣＶ５＇非编码区ｃＤＮＡ作探针,采用原位分子杂交法对９６Ｎ肝硬变,１０２例肝细胞肝癌进行了ＨＣＶＲＮＡ检测,并结合不同年份标本中ＨＣＶＲＮＡ的检出率,探讨ＨＣＶＲＮＡ在肝脏的分布及其丢失问题．结果显示ＨＣＶＲＮＡ定位于肝细胞和肝癌细胞胞浆内,肝脏其它细胞未见明确阳性杂交信号。ＨＣＶＲＮＡ杂交阳性细胞呈灶状和弥漫分布,正常对照、替代、空白对照为阴性,在不同年份肝硬变及肝细胞肝癌中两两比较表明新近包埋蜡块组织较陈旧蜡块组织ＨＣＶ　ＲＮＡ检出率明显高。本文结果证实ＨＣＶＲＮＡ存在于肝细胞和癌细胞的胞浆内,未见肝内其它细胞阳性,还发现ＨＣＶＲＮＡ在肝硬变、肝细胞癌中的检出率随保存时间的延长,其阳性检出率明显降低,表明ＨＣＶＲＮＡ在蜡块中存在明显的降解,应尽可能选用近期标本、为临床分析ＨＣＶ感染,ＨＣＶ与肝硬变、肝细胞肝癌的关系提供更客观的数据。     

人原发性肝内胆管细胞癌中HCV RNA及其NS3区抗原的分布及意义

应用原位分子杂交及免疫组分方法,使用地高辛标记ＨＣＶ５’非编码区探针及抗ＨＣＶ ＮＳ３区Ｃ３３ｃ单克隆抗体,对３５例人原发性肝内胆管细胞癌（ＰＩＣ）和癌旁肝组织的ＨＣＶ ＲＮＡ及其ＮＳ３抗原进行检测结果发现ＨＣＶ ＲＮＡ在ＰＩＣ中的阳性率为８３％,ＨＣＶ ＲＮＡ定位于癌细胞浆中,个别病例并在淋巴细胞、肝窦内皮细胞和枯否氏细胞中发现阳性信号。ＨＣＶ ＮＳ３区Ｃ３３ｃ抗原在ＰＩＣ的阳性率为８９％,阳性     

EHFV感染家兔后组织脏器的病毒抗原定位及其病理变化

采用流行性出血热病毒（ＥＨＦＶ）１１４株实验感染家兔,用免疫荧光法（ＩＦＡ）及ＰＡＰ双桥法对家兔各脏器组织进行病毒抗原定位,同时将各脏器石蜡切片作常规Ｈ－Ｅ染色,观察受检组织的病理变化。结果表明：家兔在感染后７－１５天中,用ＩＦＡ法在胸腺、心、肺、肝、脾、胰腺、淋巴结、脑、睾丸、卵巢、肾、大肠及小肠中均检出ＥＨＦＶ抗原。用ＰＡＰ双桥法在细胞水平进行病毒抗原定位,发现所有受检组织小血管及毛细血管内皮细胞均为ＥＨＦＶ的原始靶细胞。生殖腺实质细胞病毒抗原阳性,为ＥＨＦＶ的垂直传播提供了实验依据。从肺支气管粘膜内皮细胞、尤其是腔面的纤毛柱状上皮内检出病毒抗原。推测ＥＨＦＶ通过气溶胶造成传播可能是水平传搐的方式之一。病理学初步观察,各脏器组织细胞未发现不可逆的病理损害。     

肾综合征出血热（HFRS）患者尸检肝组织中的病毒抗原－免疫组织化学研究

应用敏感的免疫组织化学多重ＰＡＰ法,观察了ＨＦＲＳ（肾综合征出血热）病毒抗原在ＨＦＲＳ患者尸检肝组织的定位,结果发现１８例尸检肝组织中．１５例肝细胞病毒抗原阳性,２例肝组织血管中白细胞也存在病毒抗原、４例肝内胆管为ＨＦＲＳ病毒抗原阳性,主要分布于肝内大胆管,小叶间胆管和小胆管的上皮细胞中,ＨＦＲＳ病毒抗原阳性物质呈地颗粒状,定位于胆管上皮细胞核上区的胞质中。     

应用原位逆转录PCR技术检测石蜡切片中HCVRNA

利用原位逆转录聚合酶链式反应（ＩＳＲｔＰＣＲ）技术检测了１５例肝细胞癌及其癌旁肝组织中丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）ＲＮＡ的定位及分布,并探讨影响实验结果的重要因素。结果表明ＨＣＶＲＮＡ阳性信号主要位于肝细胞和癌细胞胞浆,胞核几乎阴性。影响结果的主要因素包括所用蛋白酶Ｋ浓度,消化切片的时间,组织固定所用固定剂的选择及ＰＣＲ扩增的循环次数等     

前列腺组织中神经生长因子(NGF)表达的研究

研究前列腺组织中神经生长因子（ＮＧＦ） 的生理学意义。采用原位杂交和免疫组化法, 检测４３ 例前列腺增生组织, ８ 例腺癌组织和８ 例正常组织中β－ＮＧＦｍ ＲＮＡ及其蛋白的表达及分布。结果显示β－ＮＧＦｍ ＲＮＡ 在正常组织及增生组织中定位于间质细胞, 偶见于上皮细胞中; 而在癌组织中, 上皮细胞和间质细胞有同样强度的β－ＮＧＦｍ ＲＮＡ染色。其蛋白在良性组织中表达主要着色在间质细胞中,上皮细胞呈弱表达,而癌组织中上皮细胞见着色明显增强（Ｐ＜ ０．０５）。ＮＧＦ的自分泌异常可见是前列腺组织由良性向恶性转变的原因之一。     

磷酸化酶mRNA在水稻雌蕊中表达的时空动态

利用ＲＮＡ原位杂交技术,对水稻受精前后雌蕊组织切片进行磷酸化酶基因表达的定位。结果显示,磷酸化酶ｍＲＮＡ在柱头、花柱、子房壁以及维管束中大量表达,而胚珠中除合点部位外表达很弱。受精前后的胚囊中各细胞磷酸化酶ｍＲＮＡ表达也很弱,并且没有明显的时空变化。在积累淀粉的胚乳细胞中磷酸化酶ｍＲＮＡ大量分布。原胚中的磷酸化酶ｍＲＮＡ表达较弱,到分化胚积累过渡性淀粉时才显著增加。本文首次对磷酸化酶ｍＲＮＡ在植物雌性器官发育过程中的时空分布动态作了初步研究。     

凡纳滨对虾不同组织内SOD、POD酶的细胞化学定位

运用电镜酶细胞化学技术对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)体内肝脏、肌肉、心脏、复眼和鳃等5种组织的SOD和POD酶的细胞化学定位进行了研究,并与感染病毒的凡纳滨对虾体内5种组织中SOD和POD的细胞化学定位进行比较。结果显示,在健康对虾体内,SOD酶阳性反应颗粒主要定位于肌肉、心脏、肝脏和鳃等组织细胞的线粒体膜、细胞质中,以及肝细胞的脂滴周围;POD酶主要定位于心脏、鳃和肝脏组织细胞的过氧化物酶体内,肝细胞中脂滴周围也有POD的阳性反应颗粒。感染病毒后,各组织细胞表现出明显的病理性结构变化,大量的髓样小体出现,脂滴数量明显减少。同时各组织中SOD和POD酶的细胞化学定位也发生了明显的变化,表现为心脏、鳃、肌肉组织细胞胞质中的SOD阳性颗粒消失,肝细胞中的SOD阳性颗粒明显减少,在心脏和鳃的线粒体基质内也出现SOD阳性颗粒;POD仍主要定位在过氧化物酶体中,但心脏中的过氧化物酶体解体而有许多呈阳性反应的小颗粒分布在细胞质中。结果表明SOD和POD在凡纳滨对虾防御氧的毒性损伤以及整个机体的免疫功能等方面起着重要的作用。       

RT—nested PCR检测肾综合征出血热患者血清病毒核酸

采用异硫氰酸胍－酚－氯仿（ＡＧＰＣ）一步法提取病毒ＲＮＡ,并依据肾综合征出血热病毒（ＨＦＲＳＶ）核蛋白（ＮＰ）编码基因保守区核苷酸序列合成两对巢式引物,建立了逆转录巢式聚合酶链反应（ＲＴ－ｎｅｓｔｅｄＰＣＲ）检测ＨＦＲＳＶＲＮＡ方法,应用此法对ＨＦＲＳＶ感染的ＶｅｒｏＥ６细胞培养液及ＨＦＲＳ患者血清中的病毒ＲＮＡ进行检测。结果显示,感染细胞培养液及３５例ＨＦＲＳ患者血清均为阳性,正常的ＶｅｒｏＥ６     

尖锐湿疣患者皮损中白介素2基因表达的研究

为探讨Ｔｈ１ 反应如白介素２ （ＩＬ－２） 产生在尖锐湿疣（ＣＡ） 发病及消退中的作用。本实验采用逆转录——聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ） 技术检测了ＣＡ患者皮损组织ＩＬ－２ 的基因表达, 实验分为三组： 正常对照组（ｎ＝ １０）, 单纯病例组（ｎ＝ １８） 及γ－ 干扰素（ＩＦＮ－γ） 诱导组（ｎ＝ ６）。结果发现正常皮肤组织未检测到ＩＬ－２ ｍ ＲＮＡ, 在１８ 例单纯病例的ＣＡ患者有２ 例皮损ＩＬ－２ ｍ ＲＮＡ阳性, ６ 例ＣＡ患者注射ＩＦＮ－γ前局部皮损未检测到ＩＬ－２ ｍ ＲＮＡ, 而在皮损内注射ＩＦＮ－γ７２ 小时后有４ 例阳性。研究结果提示了ＩＦＮ－γ可诱导Ｔｈ１ 应答, Ｔｈ１ 应答在抵抗人类乳头瘤病毒（ＨＰＶ） 感染及清除ＨＰＶ中可能起着重要作用, 为临床应用ＩＬ－２ 及ＩＦＮ－γ治疗ＣＡ提供了理论依据。     

应用单克隆抗体免疫细胞化学法分析尸检组织中肾综合征出血热病毒G2，NP及HA结构蛋白抗原

本文应用15株分别抗肾综合征出血热(HFRS)病毒糖蛋白(Glycoprotein Ⅱ G2),核蛋白(Nuclcocapsid,NP)及血凝素(Hemagglutinin,HA)抗原的单克隆抗体免疫细胞化学方法对19例HFRS尸检病例的16种组织中的病毒抗原进行了定位和分布的研究及抗原分析。结果表明,死于早期HFRS人体组织内病毒抗原量大,分布广泛,主要以可溶性和颗粒性两种形式存在,前者存在于细胞内和细胞外,呈G2,NP及HA抗原阳性,是参与形成免疫复合物的主要抗原形式;后者是以单纯病毒NP或HA抗原阳性的病毒包涵体(IB)形式存在于细胞内,是病毒直接作用所致细胞病变的标志,IB的广泛分布但只有极个别阳性细胞发生坏死,说明该病毒具有泛嗜性感染和弱致细胞病变能力的特性。抗原分析结果显示,组织细胞中病毒抗原的表达及其抗原量受宿主细胞的种属,组织结构特点及病期的影响,也存在个体差异以及因感染病毒株或血清型不同产生差异的可能性。病毒抗原染色形态学证实,NP上具有HA抗原位点,其抗原决定簇有三类,其中的某些抗原决定簇可因病毒宿主动物或细胞的种属不同,表达也不同。HA抗原在人体组织细胞中的高表达和广泛分布也说明HFRSV对人体有很强的侵袭力。     

RNA病毒的复制途径

ＲＮＡ病毒的复制途径聂剑初（北京师范大学生物学系１００８７５）ＤＮＡ病毒在其基因组复制和表达过程中利用许多的宿主蛋白质。ＲＮＡ病毒的复制则面临一个特殊的问题,即未受侵染的宿主细胞没有按照ＲＮＡ模板的指令合成ＲＮＡ的酶。因此,ＲＮＡ病毒必须含有合成这类...     

人原发性肝细胞肝癌中丙型肝炎病毒C_（33c）抗原及HBxAg的分布及意义

作者应用抗ＨＣＶＮＳ３区Ｃ３３ｃ抗原２Ｂ６株单克隆抗体和抗ＨＢｘＡｇ多克隆抗体,采用ＡＢＣ法对１０２例人原发性肝细胞肝癌（ＰＨＣ）组织进行了ＨＣＶ及ＨＢＶ抗原定位研究。ＨＣＶＣ３。抗原及ＨＢｘＡｇ在ＰＨＣ中的阳性检出率分别是８１．４％及７４．５％,Ｃ３３ｃ抗原或ＨＢｘＡｇ阳性占所检病例９４．１％,相同病例二者同时阳性为６１．８％。１０２例ＰＨＣ中５０例有癌旁肝组织,其Ｃ３３ｃ抗原和ＨＢｘＡｇ的阳性检出率分别是６２％和９２％。ＨＣＶＣ３３ｃ抗原定位于肝癌细胞的胞浆内,胞核未见阳性信号。Ｃ３３ｃ抗原阳性细胞在ＰＨＣ中呈散在、局灶分布为主,在癌旁肝组织呈弥漫分布为主。本文结果提示ＨＣＶ感染在ＰＨＣ的发生中可能起重要作用。     

双链RNA技术在植物病毒研究中的应用

含ＲＮＡ基因组的植物病毒在复制时会产生双链ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）。本文介绍了用ＣＦ－－１１纤维素粉提取ｄｓＲＮＡ的步骤,并列举了ｄｓＲＮＡ在植物病毒研究中的应用,其主要应用有（１）用于检测植物病毒;（２）用于病毒株系分化;（３）用于病毒卫星ＲＮＡ及亚基因组ＲＮＡ研究;（４）用于侵染性测定及病毒基因组功能研究等。     

原位杂交定位实验乳鼠各脏器中流行性出血热病毒RNA

用~8H-dTTP和生物素-11-dUTP标记流行性出血热病毒(EHFV)R22株M片段R3 cDNA制备探针,采用原位杂交法对EHFV感染的Ba1b/C乳鼠各脏器进行了病毒RNA定位。实验结果,病毒RNA主要定位于脑、肾、肾上腺、肝、心脏。在脑,病毒主要侵犯大脑皮质、海马回神经元,可见阳性颗粒或阳性     

乙脑病毒全长cDNA的扩增克隆及体外转录制备感染性RNA的研究

本研究根据已知的乙脑病毒（ＪＥＶ）ＳＡ１４株基因序列设计一套引物,利用长模板ＲＴ－ＰＣＲ技术,一次扩增出了ＪＥＶ的全长ｃＤＮＡ,并采用大片段克隆技术将其克隆于载体的ＲＮＡ聚合酶启动子下游。阳性克隆转录的ＲＮＡ转染ＨＢＫ细胞后细胞产生病变,经乳鼠脑内接种及特异性免疫荧光染色证明为ＪＥＶ,这一结果表明ＪＥＶ感染性克隆的构建获得了成功。其次,合成一条含有ＲＮＡ聚合酶启动子序列的５′引物,利用长模板ＲＴ－