烷烃发酵产生1，13-十三碳二元酸及其诱导作用的研究

从能利用正十二烷产生1,12-十二碳二元酸的热带假丝酵母突变株D28出发,经两次紫外线照射诱变,选育到一株从正十三烷产生1,13-十三碳二元酸较高的突变株2—23号菌。该突变株较出发菌株提高产酸率20％,达40．4g／L。突变株2—23也能将一定链长的长链烷烃以较高的产率转变成相应的单一二元酸。此外,在产酸摇瓶条件试验中观察到烷烃的诱导作用,使突变株产酸能力得以提高。用烷烃预培养的种子发酵正十三烷,其产生1,13一十三碳二元酸的量较糖质碳源培养的种子发酵时要提高30％。     

高产十四碳二元酸的新菌株

中国科学院微生物研究所陈远童教授在石油微生物领域 ,微生物正烷烃代谢产物和代谢途径的基础理论研究以及微生物发酵正烷烃生产长链二元酸系列产品的应用开发研究中 ,取得优异成绩 ,尤其通过国家“八五”和“九五”科技攻关 ,先后培育出高产十五碳二元酸 (DC15)、十二碳二元酸 (DC12 )和十三碳二元酸 (DC13) 3株高产突变株 ,通过代谢调控和过程优化 ,在 2 5吨罐中试和 2 0吨罐规模工业生产试验研究中 ,把DC15、DC12 和DC13的发酵产酸水平稳定在 1 80～ 2 0 0g/L的国际领先水平。并率先在国内建成国际上首家千吨级规模的二元酸生产工…     

十二碳二元酸的发酵研究

热带假丝酵母(Candidatropicalis)UH248菌株在单因子实验的基础上经过正交实验后,以正十二烷发酵生成十二碳二元酸的产酸量从817g/L提高到1082g/L。而其二元酸产品的纯度(>97%)满足工业生产的需要。吐温60010%、尿素012%、维生素B2150μg/L、青霉素150μ/mL、丙氨酸050%的浓度时也对十二碳二元酸产量有促进作用。用一株以UH248为母株诱变筛选的新的优良突变株HP12菌株,在最佳条件下,20m³罐中发酵151h,十二碳二元酸的平均产量达2021g/L。     

十三碳二元羧酸发酵技术的研究

以一株热带假丝酵母菌(Candida tropicalis) SP1为出发菌株,经紫外线反复诱变获取一株难以同化烷烃的突变株SPUV56,摇瓶培养5d平均产酸量达72g/L,较出发菌株提高了1.25倍,并利用突变株SPUV56在137L自控罐上扩试,补加醋酸盐发酵,144h产酸量达153g/L,比不加醋酸盐发酵提高了29.7%。采用提 高搅拌混合效果和低溶解氧发酵过程控制方法,可有效地提高菌体的产酸能力,在20m3发酵罐中发酵生产十三碳二元羧酸,总培养时间144h,产酸量可达172g/L,放罐体积15.0m3,产量为2.25t。     

十五碳二元酸的发酵研究

以热带假丝酵母(candida tropicalis)T_(25-14)为出发菌株,经过紫外线和亚硝酸的诱变和筛选,得到一株从正十五烷(nC_(15)发酵生产十五碳二元酸(DC_(15)的优良突变株NP-6-126。摇瓶发酵4d,T_(25-14)产DC_(15)为35.8g/L,而NP-6-126则达到73.5g/L,产酸水平提高一倍以上。气相色谱分析表明,DC_(15)的纯度也从69％提高到94％。加入适量青霉素,对DC_(15)的产生有明显的促进作用。     

N^＋离子注入热带假丝酵母对长链二元酸产量的影响

用热带假丝酵母(Candidatropicalis)SCB412作为出发菌株,经能量50KeV、剂量l×1011～5×1015ions/cm2的N+离子注入诱变处理,以产生可遗传的诱变.N+离子注入后,存活率与剂量呈指数衰减关系log(存活率%)=8.23-0.604×log(剂量),在培养过程中可观察到酵母菌菌落和细胞形态均发生了变化.经筛选,获得了一株能够利用正十二烷烃发酵产生长链二元酸的高产菌热带假丝酵母SCB609.在初始正十二烷烃浓度为15%(v/v)下产酸量由43.5g/L上升到73.2g/L.比较两株菌发酵生长特性的差异,产酸过程有一定的变化.     

十三烷1,13—二羧酸的发酵研究

热带假丝酵母(C.tropicalis)NP-6-126是经过紫外线和亚硝酸反复诱变筛选培育出来的,它是生产十三烷1,13一二羧酸(DC_(15)的优良生产突变株,尿素和硝酸钾浓度对其产酸有明显影响。尿素浓度在0.15％～0.21％范围内对产酸有利,尤其是0.18％最佳,浓度增大,明显抑制DC_(15)的产生和积累;硝酸钾的加入,也明显促进DC_(15)产量的提高,0.6％～0.9％硝酸钾浓度较合适。于16L自动控制罐发酵7d,DC_(15)达到130g/L,放大到2500L罐,在最佳条件下,连续5批,发酵6d,DC_(15)产量平均达到176g/L,正十五烷(nC_(15)转化率平均为52.5％,后处理总收率平均为80.6％,DC_(15)的纯度平均为95.83％。     

N~ 离子注入热带假丝酵母对长链二元酸产量的影响

用热带假丝酵母（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）ＳＣＢ４１２作为出发菌株,经能量５０ＫｅＶ、剂量１× １０~１１～５ ×１０~１５ ｉｏｎｓ／ｃｍ~２的Ｎ~＋离子注入诱变处理,以产生可遗传的诱变。 Ｎ~＋离子注入后,存活率与剂量呈指数衰减关系：ｌｏｇ（存活率％）＝ ８．２３－ ０．６０４ × ｌｏｇ（剂量）,在培养过程中可观察到酵母菌菌落和细胞形态均发生了变化。经筛选,获得了一株能够利用正十二烷烃发酵产生长链二元酸的高产菌热带假丝酵母ＳＣＢ６０９。在初始正十二烷烃浓度为１５％（ｖ／ｖ）下产酸量由４３．５ｇ／Ｌ上升到７３．２ｇ／Ｌ。比较两株菌发酵生长特性的差异,产酸过程有一定的变化。     

石油发酵长链二元酸的研究——(Ⅰ)二元酸产生菌的筛选方法、菌种鉴定及产物分析

微生物能将正烷烃分子两末端氧化成二元脂肪酸。我们设计了应用指示菌筛选产二元酸菌株的方法,并对产短链二元酸之解脂假丝酵母192(Candida lipolytica 192),和热带假丝酵母79(Candida tropicalis 79),用MNNG诱变育种,挑选在十五烷及十三烷 1:13二羧酸培养基上不生长或生长极差,可能是因β氧化受阻而积聚长链二元酸的突变种进行发酵。发酵产物经熔点测定、质谱分析、元素分析、气相色谱和红外光谱分析,证明为α,ω-十三烷1:13二羧酸。发酵产量解脂假丝酵母94为8.1克/升,热带假丝酵母N-15和N-26分别为14克/升和10克/升。 三株指示菌、不动杆菌(Acinetobacter sp)I_7、C_5和C_(11),对一元酸及二元酸的利用有差异,I_7能利用六碳以上二元酸及一元酸,C_5能利用八碳以上二元酸及一元酸,而C_(11)则只能利用一元酸生长。因此可以根据发酵液在这一组指示菌上的反应,筛选短链二元酸的产生菌。对应用指示菌作二元酸定量测定的方法也进行了讨论。     

十三烷1,13-二羧酸的发酵研究

热带假丝酵母(C.tropicalis)NP-6-126是经过紫外线和亚硝酸反复诱变筛选培育出来的,它是生产十三烷1,13一二羧酸(DC_(15)的优良生产突变株,尿素和硝酸钾浓度对其产酸有明显影响。尿素浓度在0.15％～0.21％范围内对产酸有利,尤其是0.18％最佳,浓度增大,明显抑制DC_(15)的产生和积累;硝酸钾的加入,也明显促进DC_(15)产量的提高,0.6％～0.9％硝酸钾浓度较合适。于16L自动控制罐发酵7d,DC_(15)达到130g/L,放大到2500L罐,在最佳条件下,连续5批,发酵6d,DC_(15)产量平均达到176g/L,正十五烷(nC_(15)转化率平均为52.5％,后处理总收率平均为80.6％,DC_(15)的纯度平均为95.83％。     

石油发酵长链二元酸的研究——Ⅲ.热带假丝酵母(Candida tropicalis)多倍体变种生产十三烷1∶3二羧酸的发酵条件研究

对热带假丝酵母(Candida tropicalis)多倍体变种NP_(CO)N22的十三烷1:13二羧酸高产发酵进行了研究。乙醇、可溶性淀粉、尿素、磷酸氢二铵等为较好的碳、氮源,但尿素等氮源的量增加时则完全抑制了二元酸的合成。烷烃发酵的适宜起始pH值在6～7之间,而发酵过程中则以维持pH值在8～8.5为佳。通气量Ks=0.8毫克分子O_2/升/分时,二元酸的产量最高。苯巴比妥和巴比妥酸钠能明显促进二元酸的合成。以乙醇和蔗糖为碳源,结合补料及调节pH,发酵190小时,十三烷1:13二羧酸产量分别达77.2克/升和72.5克/升。热带假丝酵母多倍体变种能氧化从癸烷至十八烷的正烷烃为相应碳链的长链二元酸,但以十三烷1:13二羧酸的产量为最高。     

正烷烃发酵生产长链混合二羧酸I．菌种的筛选、诱变及鉴定

从702株酵母菌中筛选到21株能利用混合正烷烃产生较多二羧酸的菌株,其中1230号菌株产二羧酸最较高,而产一羧酸极少,经鉴定为热带假丝酵母(Candida tropicalis)。1230号菌株以癸二酸及十二碳二羧酸作指示培养基的唯一碳源,经亚硝基胍及紫外线诱变,挑选出在指示培养基上不生长,而在完全培养基上生长的菌落,最后得到产酸量为2．43％的突变株Us-21。其发酵产物分离提纯后,经气液相色谱鉴定为与基质链长相应的长链混合二羧酸。     

DCA_(13)发酵产酸期代谢动力学模型的建立

根据产酸期烷烃代谢分析和底物质量平衡,针对使用Candidatropicalis生产十三碳二元酸反应体系,建立了热带假丝酵母在产酸期的代谢动力学模型,并对模型进行了数据拟合和实验验证。采用该代谢动力学模型,首先估算出在以烷烃为单一碳源的培养条件下,烷烃对二元酸的最高理论摩尔转化率为64%,最高理论质量转化率为85%,在此基础上,进一步提出补加其它碳源是提高烷烃转化率最为有效的措施。     

石油发酵长链二元酸的研究——(Ⅱ)热带假丝酵母(Candida tropicalis)多倍体的诱变育种

热带假丝酵母(Candida tropicalis)79经 MNNG诱变后获得产长链二元酸突变株N—26,十三烷1:13二羧酸产量为10克/升。N-26％用秋水仙碱和樟脑分别诱发产生多倍体细胞 NP_(CO)2和NP_(Oa)18,十三烷1:13二羧酸产量分别提高到17.3克/升和18.3克/升。多倍体NP_(CO)2和NP_(Oa)18的个体大,生长速率快,DNA含量分别为3.2×10~(-6)微克/细胞和4.O×10~(-6)微克/细胞,而 N-26则为1.6×10~(-6)微克/细胞。 多倍体NP_(OO)2和NP_(Ca)18对MNNG均较敏感,致死率较N—26高一倍,诱变之总突变频率则较原种高8—10％,以0.25毫克/毫升MNNG处理时正突变频率可提高一倍左右,因此获得高产突变株的机率显著提高。从多倍体NP_(OO)2和NP_(Ca)18经0.25毫克/毫升MNNG处理所得高产菌株、NP_(CO)N22和 NP_(Oa)N39,十三烷 1:13二羧酸的产量分别提高到33.5克/升和34.5克/升。 对多倍体高产变种生理特性的初步观察指出多倍体细胞较易为蜗牛细胞壁溶解酶作用生成原生质体,电子显微镜初步观察指出多倍体细胞的细胞壁可能较薄。 离体酶活力的测定指出多倍体变种的三羧酸循环酶系、呼吸链酶系和过氧化氢酶活力增加,因而推测多倍体变种之所以提高长链二元酸的产量可能是由于ATP的供应增加,促进了烷烃的氧化,而过氧化氢酶的增加可能是对于烷烃氧化过     

烷烃溶剂对耐有机溶剂极端微生物地衣芽孢杆菌YP1产胞外蛋白酶的影响

考察了添加5％(V/V)浓度的正庚烷、正辛烷、正癸烷、十二烷、十四烷、十六烷等烷烃溶剂对耐有机溶剂极端微生物地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)YP1的生长及产胞外蛋白酶的影响。结果表明5％(V/V)浓度的各种烷烃溶剂对YP1蛋白酶的稳定性及菌体生物量均无显著影响, 正庚烷、正辛烷、正癸烷等溶剂显著抑制YP1产蛋白酶, 而十二烷、十四烷、十六烷能提高YP1产蛋白酶1倍以上。发酵液中十四烷的浓度(1％－8％, V/V)与蛋白酶的活力呈正相关性, 添加十四烷后发酵过程中蛋白酶活力的显著增加出现在菌体生长的对数后期。培养过程中添加十四烷能导致YP1菌体形态显著变小。首次报道了烷烃溶剂对极端微生物产蛋白酶的影响。     

十五碳二元酸发酵过程中β氧化的控制

目的：提高烃酸转化率,降低发酵法生产十五碳二元酸成本。方法：考察几种碳源和β氧化抑制剂丙烯酸对菌体生长、烃酸转化率及产酸的影响,并对乙酸钠的作用机制进行讨论。结果：发酵培养基加入的几种碳源中,乙酸钠对十五碳二元酸发酵影响最大。加入0．4（W／V）乙酸钠,转化率比对照组提高21％,产酸量比对照组提高22．5％;转入产酸期后加入0．1（WV）丙烯酸,产酸进一步提高16％。结论：乙酸钠和丙烯酸能够部分控制β氧化,可以有效降低发酵法生产十五碳二元酸成本。     

烷烃溶剂对耐有机溶剂极端微生物地衣芽孢杆菌YPl产胞外蛋白酶的影响

考察了添加5％（V／V）浓度的正庚烷、正辛烷、正癸烷、十二烷、十四烷、十六烷等烷烃溶剂对耐有机溶剂极端微生物地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）YPl的生长及产胞外蛋白酶的影响。结果表明5％（v／v）浓度的各种烷烃瘩剂对YPl蛋白酶的稳定性及菌体生物量均无显著影响,正庚烷、正辛烷、正癸烷等溶剂显著抑制YPl产蛋白酶,而十二烷、十四烷、十六烷能提高YPI产蛋白酶1倍以上。发酵液中十四烷的浓度（1％-8％,V/V与蛋白酶的活力呈正相关性,添加十四烷后发酵过程中蛋白酶活力的显著增加出现在菌体生长的对数后期。培养过程中添加十四烷能导致YPl菌体形态显著变小。首次报道了烷烃溶剂对极端微生物产蛋白酶的影响。     

酸的发酵条件初探

就假丝酵母对石油烷烃进行发酵生成十三碳二元酸进行了研究.当湿菌体含量升至6.0%以上时,在pH7.0、温度30℃和发酵时间120h的条件下,流加轻油发酵,十三碳二元酸的生成量可达70g/L以上.     

十二碳二元酸发酵研究

长链二元酸(long-chain dicarboxylic acid,DCA)是指C10以上的脂肪族二元羧酸。它们是一类重要的精细化工原料,广泛用于大环麝香、工程塑料、耐寒增塑剂、尼龙纤维、热熔胶以及液晶的合成,也是医药和农药合成的原料。其中十二碳二元酸(DCA12)市场需求量较大,主要用于合成高级工程塑料尼龙1212、服装用尼龙热熔胶和高级涂料等,目前由化学法和发酵法生产。由于发酵法其原料来源容易、生产条件温和、产品纯度高等待点,深受重视。国内外对发酵法制取DCA12的研究较为深入^[1-6],1998年我国已实现了工业化生产^[7]。热带假丝酵母(Candida tropicalis)突变株SP—UV—56是一株高产十三碳二元酸(DCA13)生产菌^[8],已用于工业发酵生产DCA13。现报道该突变株在10L罐发酵生产DCA12的结果。     

十三碳二元酸的发酵条件初探

就假丝酵母对石油烷烃进行发酵生成十三碳二元酸进行了研究。当湿菌体含量升至 6 .0 %以上时 ,在pH7.0、温度 30℃和发酵时间 12 0h的条件下 ,流加轻油发酵 ,十三碳二元酸的生成量可达 70 g/L以上。