一株桑树内生拮抗菌的分离、鉴定及发酵条件优化

【目的】利用植物内生拮抗菌防治植物病害是一种有效的生物防治手段。本研究从健康桑树中分离筛选桑椹菌核病拮抗性内生细菌,为桑椹菌核病生物防治提供优良菌种。【方法】釆用组织分离培养法及抑菌圈法分离、筛选桑椹菌核病拮抗性内生细菌;根据菌体形态、培养特征、生理生化特性及基于16S rDNA序列的系统发育分析,对抑菌活性显著且稳定的菌株进行菌种鉴定;进而利用菌丝生长速率法检测活性发酵液的抑菌谱与热稳定性,并通过单因素及正交试验优化该菌株产生抑菌活性物质的发酵条件。【结果】从健康桑树中共分离获得55株内生细菌,其中XP-27菌株对核盘菌PZ-2的抑菌活性稳定且拮抗效果明显;XP-27菌株形态、培养特征、生理生化特性与芽孢杆菌属相符,基于16S rDNA序列的系统发育分析结果显示该菌株与多株甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)的亲缘关系最近,且处于系统发育树的同一分枝,故将XP-27菌株鉴定为甲基营养型芽孢杆菌,命名为B.methylotrophicusXP-27;抑菌谱与热稳定性实验结果表明XP-27菌株对灰霉菌SWU5、腐霉菌SWU3等10种常见植物病原菌具不同程度的抑制作用,且其发酵滤液热稳定性强;发酵条件优化结果表明该菌株最佳培养基配方与培养条件为:牛肉膏1.00%,淀粉1.50%,K_2HPO_4 0.05%,MgSO_4·7H_2O 0.10%,初始pH值为8.0,培养温度为30°C,接种量为7%,发酵时间为120 h。【结论】筛选获得的桑树内生细菌B. methylotrophicus XP-27对桑椹菌核病病原菌核盘菌PZ-2具有显著拮抗作用,可作为开发桑椹菌核病生防制剂的候选菌株。     

一株番茄青枯病菌拮抗细菌的筛选、发酵条件优化及田间小区防效

[背景]番茄青枯病是由青枯劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的一种土传细菌性病害,该病原菌严重影响番茄的生产。[目的]筛选番茄青枯病的生防细菌,并将其用于病害防治。[方法]采用抑菌圈法、琼脂扩散法从湖南衡阳青枯病发病田的健康番茄根际土壤筛选对青枯劳尔氏菌具有较强拮抗能力的菌株,通过形态学观察、生理生化试验、16S rRNA基因和gyrA基因测序分析确定其分类地位;以单因素试验和正交试验对发酵条件进行优化;通过田间小区试验初探其防效。[结果]筛选的菌株TR-1被初步鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensislezensis);菌株TR-1最佳培养基配方(g/L):可溶性淀粉20.0,大豆蛋白胨10.0,磷酸氢二钾5.0;最佳发酵条件:pH6.0-7.0,温度30-33℃,摇床转速160 r/min,发酵时长48 h,优化后TR-1无菌发酵上清液对青枯菌抑菌圈直径达2.95 cm,约为优化前的2倍;其田间小区防效为60.30%。[结论]通过对菌株TR-1发酵条件进行优化可大大提升其发酵液抑菌效果,而且菌株TR-1在田间小区试验中对番茄青枯病防效优...     

辣椒镰孢根腐病防病促生细菌的筛选及其效应

【目的】筛选辣椒(Capsicum annuum L.)根腐病防病促生细菌并明确其防病促生效应。【方法】采集健康辣椒根围土壤样品,以辣椒根腐病病原真菌茄镰孢(Fusarium solani)和尖镰孢(Fusarium oxysporum)为指示菌,采用平板对峙法筛选生防细菌,采用选择性培养基筛选溶无机磷、溶有机磷、固氮菌和解钾菌等促生菌,钼锑抗比色法测定溶磷量,凯氏定氮法测定固氮量,火焰原子吸收光谱法测定解钾量。对特性良好组合的菌株进行16S rDNA序列分析鉴定并制作菌剂,最后采用盆栽法测定菌剂防病促生效果。【结果】共筛选得到323株特性良好的功能菌株,拮抗菌78株,溶有机磷菌87株,溶无机磷菌107株,固氮菌128株,解钾菌123株,部分菌株同时具有多个功能特性。互作组合得到6个特性良好的菌株组合,包括8株功能菌株,鉴定发现XP271和XP181为枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis),XP125为特基拉芽胞杆菌(Bacillus tequilensis),XP236为耐盐芽胞杆菌(Bacillus halotolerans),XP79为巨大芽胞杆菌(Bacillus ...     

核桃黑斑病拮抗放线菌WMF106发酵条件优化和抑菌物质稳定性

[背景]暗蓝色链霉菌WMF106对核桃黑斑病病原菌野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris pv.campestris)有较好的抑制作用,优化其发酵培养基与发酵条件将为核桃黑斑病生防菌剂的制备与应用提供参考.[目的]优化核桃黑斑病生防菌株WMF106的发酵条件,测定其抑菌物质稳定性,并通过田间防效测...     

疮痂链霉菌拮抗菌的筛选及发酵条件优化

近年来,由致病性链霉菌引起的马铃薯疮痂病呈逐年加重趋势,已成为亟待破解的产业难题。筛选抑菌效果好、适应性广的拮抗菌,是实现该病有效防控的主要措施。本研究采用平板对峙试验筛选到3株对疮痂链霉菌(Streptomyces scabies)有较好抑菌效果的拮抗菌DXT2-4、T2-1和21-14,依据形态特征、生理生化特性以及16S rRNA基因序列,鉴定3株菌分别为高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)、沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)和短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus),对马铃薯疮痂病盆栽防效依次为68.83%、48.57%和57.14%;3株菌在内蒙古自治区呼伦贝尔市田间小区试验防效分别为59.48%、34.58%和51.75%;广东省惠州市田间防效分别为55.14%、36.05%和49.05%。3株菌均可在pH 1.0–13.0、NaCl含量为1%–11%的培养基中正常生长,对立枯丝核菌、大丽轮枝菌、茄链格孢菌和尖刀镰孢菌有抑制效果;DXT2-4、T2-1和21-14的吲哚乙酸(indole-3-acetic acid, IAA)产量分别为2.23、1.11和1.67 mg/L,其中DXT2-4和21-14具有较强的溶磷能力。菌株DXT2-4发酵的最佳碳、氮源和无机盐分别为2.00%糖蜜+2.00%玉米淀粉、2.00%豆饼粉和0.3% MgSO₄·7H₂O。综上所述,3株菌均可高效抑制疮痂链霉菌生长,环境适应性强,其中DXT2-4抗病促生效果最佳,具有较好的开发价值和应用前景,对促进马铃薯生产及环境安全可持续利用具有重要意义。     

番茄青枯病拮抗菌筛选鉴定及其发酵条件初探

从健康番茄根系采样,筛选出4株对番茄青枯病有较强拮抗作用的菌株,在NA培养基上抑菌圈直径>9 mm。其中拮抗菌株YB6抑菌活性最强且拮抗效果稳定,通过形态学观察及部分生理生化特征测定,初步确定为节杆菌属。通过单因素试验进行了发酵条件初步研究,得到适宜的发酵条件为:发酵时间3 d,培养温度30°C,初始pH值9.0,接种量3%,转速100 r/min,碳源蔗糖,氮源酵母浸膏。通过初步优化后拮抗菌株抑菌活性明显增强,最终对青枯病菌SST-Y和G2M1.70抑菌圈直径与NB培养基相比增加了76.72%和81.14%,差异显著。     

黄瓜枯萎病病原菌拮抗菌的筛选及其生物防治效应

分离筛选到一株对黄瓜枯萎病病原菌——尖孢镰刀菌具有显著拮抗作用的菌株YHJ15,并根据其生理生化特征和16SrRNA基因序列将其初步鉴定为短小芽孢杆菌;研究了其最适的生长条件。为黄瓜枯萎病的生物防治提供了种质资源。     

稻瘟病拮抗菌的筛选及抑菌活性的研究

利用对峙法和牛津杯法从大连近海海域分离得到1株对稻瘟病菌有拮抗作用的菌株BCHN-15,经生理生化实验和16S r DNA方法鉴定,该菌株为解淀粉芽胞杆菌。实验结果显示,BCHN-15能显著抑制稻瘟病菌的生长,与稻瘟病菌作用48 h后,稻瘟病菌的菌丝干重与对照组相比减少了74.36%。该菌产生的抑菌成分可破坏稻瘟病菌的细胞膜,且对热稳定,其活性成分能被盐酸沉淀。结果表明,BCHN-15可通过破坏稻瘟病菌的细胞膜,引起菌丝畸形和断裂来发挥其抑菌作用。     

植物病原真菌广谱拮抗菌的筛选鉴定及发酵条件初步研究

通过对峙培养法筛选到对8种植物病原真菌具有拮抗作用的芽孢杆菌菌株,通过测量10-30℃下的抑菌圈直径发现AFB037菌株在不同温度下抑菌效果最好。通过表型和16S rDNA序列分析将AFB037菌株鉴定为多粘类芽孢杆菌。AFB037菌株抗菌成分的产生需要真菌菌体成分的诱导,提示其有效成分可能为细胞壁降解酶类。     

一株玉米小斑病拮抗菌的分离、筛选及鉴定

目的：分离对玉米小斑病菌（Bipolaris maydis）有拮抗作用的内生菌株并进行菌种鉴定。方法：经表面消毒用碾碎法从水浮莲（Pistia strotiotes）中分离内生菌,用平板扩散法筛选出对玉米小斑病菌（Bipolaris maydis）有明显拮抗作用的内生菌株XJ-PL-YB-50,利用16SrDNA通用引物对其基因组DNA进行扩增,并测序得到XJPL-YB-50的部分16SrDNA序列,GenBank接收号为EU262981。经Blastn调出与菌株16SrDNA同源的序列,用软件MEGA3．1按照Neighbor-Joining方法构建16SrDNA系统发育树。结果：XJPL-YB-50的主要生理生化指标与Bacillus subtilis相符,与Bacillus subtilis AB271744处于同一分支,相似性为100％,G＋Cm01％为47．7％。结论：水浮莲内生菌XJPL-YB-50对玉米小斑病菌有明显拮抗作用,并最终鉴定为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。     

茶树根腐病菌拮抗真菌的筛选及发酵条件优化

【背景】茶树根腐病是由尖孢镰孢物种复合物（Fusarium oxysporum species complex, FOSC）中一个特异性菌种茶树根腐病原菌镰孢菌（Fusarium cugenangense）引起的一种毁灭性土传病害。【目的】对茶树根腐病原菌镰孢菌F. cugenangense的拮抗真菌进行分离鉴定,通过优化其培养基和发酵条件以提高其抑菌活性,为后期规模化发酵以及菌剂的开发奠定基础。【方法】基于形态学及多基因联合建树分析方法对供试菌株进行种属鉴定,测定其抑菌谱,并对其进行发酵条件优化、测定其生长特性及发酵滤液稳定性。【结果】采用稀释涂布法及平板对峙法筛选出1株茶树根腐病原菌镰孢菌拮抗真菌GF3,其抑菌率达75%;将其初步鉴定为奶灰青霉（Penicillium cremeogriseum）;该菌株对其他10种作物病原菌抑制率达70%以上,具有良好的广谱抑菌性;其难挥发性代谢物和挥发性代谢物对茶树根腐病原菌镰孢菌菌丝的抑制率分别为64%和27%;最适培养基为可溶性淀粉40 g/L、酵母提取物15 g/L、氯化铵6 g/L;最佳发酵条件为pH 6.0、180 r/min、接种量5%,温度28℃,时间6 d;于优化后的培养基及培养条件下,其发酵滤液对茶树根腐病原菌镰孢菌的抑菌率达59%,较初始培养基及培养条件的抑菌率增加了33.09%;耐受性试验表明,菌株GF3生长具有良好的耐高温能力、耐盐性、耐碱性能力和紫外耐受性;其发酵滤液在pH 4.0–10.0、温度40–100℃条件下均能保持较强的抑菌活性,并且对紫外光照射不敏感,但对K⁺和Ca²⁺较敏感。【结论】确定了菌株GF3的最佳发酵培养基和发酵条件,该菌株及其发酵滤液有较好的拮抗稳定性。     

腐皮镰刀菌对不同品种核桃抗性生理指标的影响

为分析腐皮镰刀菌(Fusarium solani)引起的核桃根腐病对寄主抗性生理指标的影响,该研究以铁核桃、绵阳早熟、新疆2号3个核桃品种为材料,研究各品种受腐皮镰刀菌侵染后,不同时期的发病情况以及丙二醛(MDA)、可溶性糖含量以及过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)的动态变化。结果表明：接种病原菌50 d 后,铁核桃100％发病,属高感品种,绵阳早熟和新疆2号发病率分别为23.33％和16.67％,属抗病品种;在50 d 监测范围内,各品种对照组各项叶部生理指标仅出现上下波动且差异不显著;然而,各品种核桃接入腐皮镰刀菌后,可溶性糖含量随时间迅速下降,MDA 含量和 POD 活性总体表现为先上升趋势,SOD、PPO 活性总体则表现为先上升后下降的变化趋势,并且5个指标品种间差异显著,而 CAT 活性变化无规律。相关性分析表明,可溶性糖、MDA 含量、SOD、POD、PPO 活性可以作为核桃品种抗性评价指标。该研究结果为深入研究由腐皮镰刀菌引起的核桃根腐病发病机制以及通过诱导等措施提高其抗性的研究提供了理论基础。     

长叶轮钟草根腐病病原菌的分离鉴定及4种芳香中药植物挥发油对其病原菌的抑制作用

长叶轮钟草[Campanumoea lancifolia (Roxb.) Merr.]是一种具有药食两用价值的新资源,开发利用前景广阔。田间调研发现,随着其种植面积的扩大,根腐病问题日益严重,在根腐病严重的田间,损失可高达40%,占长叶轮钟草所有病害造成损失的75%-90%,直接导致了果实产量及品质的下降,影响了商品价值及农户的收入,开展长叶轮钟草根腐病的防治工作迫在眉睫。【目的】分离和鉴定长叶轮钟草根腐病病原菌,同时提取4种芳香中药植物的挥发油,研究其对长叶轮钟草病原菌生长的抑制作用。【方法】采用常规组织分离法对典型根腐病症状的长叶轮钟草病害植株进行病原菌的分离纯化,结合形态学和分子生物学手段鉴定病原菌种类,并进行科赫氏法则验证。采用水蒸气蒸馏法从芳香中药植物中提取挥发油,通过牛津杯法评估挥发油的抑菌效果,并通过96孔板法研究了其最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentrations, MICs)。【结果】从患病的长叶轮钟草植株根系中分离并鉴定到4株病原菌,将分离得到的4株病原菌回接后,植物出现了与大田一致的根腐病症状。经形态学和分子生物学鉴定,4株菌分别为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、茄腐镰刀菌(Fusarium solani)、麦冬炭疽菌(Colletotrichum liriopes)和蔓枯病菌(Stagonosporopsis pogostemonis)。挥发油抑菌实验发现,4种挥发油对尖孢镰刀菌、茄腐镰刀菌、蔓枯病原菌和麦冬炭疽菌均有很强的抑制效果,抑制率在32.94%-95.29%之间。此外,4种挥发油对4株病原菌MICs在0.031-4.000mg/mL之间。【结论】本研究表明,尖孢镰刀菌、茄腐镰刀菌、蔓枯病原菌和麦冬炭疽菌均为长叶轮钟草的致病菌,且茄腐镰刀菌、蔓枯病原菌和麦冬炭疽菌为首次报道的长叶轮钟草根腐病病原菌。此外,基于中医“芳香避秽”的思想理论,本研究选取的4种芳香植物的挥发油对长叶轮钟草的根腐病病原菌均有较强的抑制作用。本研究为长叶轮钟草根腐病植物源农药的开发和未来该资源的绿色种植奠定了科学基础。     

哈茨木霉T9131鉴定及其拮抗病原菌和诱导黄芪抗病的作用分析

木霉是土壤和植物根系中常见的真菌,在农业生物防治中起到重要作用。为探究木霉在黄芪抗根腐病中的作用,该研究从黄芪根腐病病根中分离鉴定木霉并研究其对病原菌的拮抗作用和对黄芪抗病生理指标的影响。通过形态学观察、ITS序列和tef1序列分析确定木霉类型; 利用平板对峙试验分析分离木霉对腐皮镰刀菌HYFS-1的拮抗作用; 测定黄芪生理指标过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)和脯氨酸(Pro)来明确分离木霉在诱导黄芪抗病中的作用。结果表明:(1)从黄芪病根中分离鉴定的木霉为哈茨木霉,命名为T9131。(2)哈茨木霉T9131与腐皮镰刀菌HYFS-1平板对峙6 d时T9131对HYFS-1的抑制率为72%±1% 。(3)与只接种腐皮镰刀菌HYFS-1相比,当HYFS-1侵染0 h时,T9131显著提高SOD活性; 当HYFS-1侵染24 h时,T9131显著提高SOD和POD的活性及Pro含量; 当HYFS-1侵染48 h时,T9131显著提高POD和PAL的活性及Pro含量。综上认为,哈茨木霉T9131可以通过直接抑制病原菌HYFS-1的生长和诱导黄芪抗病生理指标SOD、POD和PAL的活性及Pro含量来防治黄芪根腐病,为进一步探究哈茨木霉的生防作用和在黄芪抗根腐病中的作用机理奠定基础。     

玉米茎腐病生防菌株的筛选鉴定及其田间防效

【背景】近年来,玉米茎腐病已成为我国玉米生产中的一大病害威胁,对我国玉米产业以及国家粮食安全构成了严峻挑战。【目的】筛选出能够有效防治玉米茎腐病的生防菌株,明确其最佳发酵条件及其对玉米茎腐病的防治效果,为玉米茎腐病绿色防控技术研发提供理论基础和实践支撑。【方法】采用稀释涂布法和平板对峙法,对禾谷镰孢(Fusarium graminearum)进行生防菌株的筛选;运用生理生化和分子生物学技术对所筛选的生防菌株进行鉴定;对生防菌株的发酵条件进行优化,并进一步将其加工成种衣剂;通过室内盆栽试验与室外田间试验检测生防菌株在促进玉米生长及防治茎腐病方面的效果。【结果】筛选出对禾谷镰孢具有显著拮抗活性的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis) SHB23,其抑菌率高达73.86%。该菌株对拟轮枝镰孢(Fusarium verticillioides)、大斑病凸脐蠕孢(Setosphaeria turcica)、尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)、炭色长蠕孢(Cochliobolus carbonum)和新月弯孢霉(Curvularia lunata)等多种玉米病害病原菌展现出明显的抑制效果,抑菌率为63.17%-79.76%。菌株SHB23的最适碳源为5%乳糖,最适氮源为0.5%黄豆饼粉,最适宜的无机盐为0.1%硫酸镁。最佳发酵条件为接种量6.0%、装液量75 mL/250 mL、pH 7.0、温度37℃、转速200 r/min以及发酵时间24 h。室内盆栽试验和室外田间试验均证实,菌株SHB23制成的种衣剂能显著促进玉米生长,并有效提高玉米茎腐病的防治效果。【结论】筛选出高效拮抗禾谷镰孢的贝莱斯芽孢杆菌SHB23,其制成的种衣剂在促进玉米生长和防治茎腐病方面的效果显著,在玉米茎腐病生防菌剂研发及绿色防控技术中具有潜在的应用前景。     

层出镰刀菌乌头酸酶家族的功能研究

【目的】层出镰刀菌是引起苜蓿根腐病的主要病原菌之一,探究层出镰刀菌中乌头酸酶家族蛋白的功能特性,为深入认识层出镰刀菌基础生理代谢的分子机制提供依据。【方法】利用hmmsearch工具,对真菌中含有乌头酸酶结构域的蛋白进行检索,并进行系统进化分析;通过实时荧光定量PCR及SWISS MODEL建模技术分别分析FpACO基因的表达模式与蛋白结构;利用同源重组双交换方法构建层出镰刀菌乌头酸酶基因敲除突变体;分析ΔFpACO3、ΔFpACO4-1、ΔFpACO4-2敲除突变体的生长、产孢、孢子形态、环境胁迫响应及致病力等表型变化;进一步测定敲除突变体中线粒体代谢相关生理生化指标的变化情况。【结果】FpACO4-1与FpACO4-2在产孢及孢子形态发生中发挥作用;FpACO3、FpACO4-1、FpACO4-2参与调控层出镰刀菌对细胞壁胁迫及金属离子胁迫的敏感性;FpACO3、FpACO4-1、FpACO4-2影响线粒体代谢,包括总乌头酸酶活性、ATP含量、过氧化氢含量及三羧酸循环关键基因表达等。【结论】乌头酸酶家族参与调控层出镰刀菌产孢、孢子形态分化、细胞壁胁迫及金属离子胁迫响应和线粒体代谢等过程。     

Computerized equipment to control soil water matric potential and soil temperature in inoculum potential assays of soil-borne pathogens

Computerized equipment to control soil temperature and soil water matric potential, at high soil hydric conditions was developed and evaluated. A series of experiments demonstrated the accuracy and reproducibility of the equipment's performance and its adequacy for the assessment of the inoculum potential of soil-borne pathogens in soils with different characteristics. Control of soil water potential is achieved by variation in the height of the water table in a medium with high water conductivity supporting the soil. The equipment consists of double-walled tanks, permitting the adjustment of soil temperature. It is provided with sensors, control software and valves for automatic operation. in a growth chamber at 24°C. with RH 70% and irradiation of 90 W.m^–2, was maintained in dynamic equilibrium for pF values ranging from 1 (–1 kPa) to 2 (–10 kPa) in various arable soil samples during the four to five weeks period of the bioassays. During the fourth week of pea or iris growth at pF=2, the system controlled within an amplitude of 0.4 pF-units. Between replications, variance was approximately 0.1 at F=2, decreasing with increasing. Soil temperature in the system could be maintained at a constant level with a variance below 0.1, within an amplitude of 0.3°C.