一株产右旋糖酐酶青霉的分离及酶的纯化和性质

[目的]从土壤中筛选到一株新的产右旋糖酐酶的真菌F1001,为酶法制备药用级右旋糖酐提供新的右旋糖酐酶产生菌株.[方法]通过形态特征和ITS rDNA序列分析方法鉴定菌株.利用硫酸铵盐析、Sepharose 6B凝胶柱纯化,得到纯度较高的酶蛋白.以右旋糖酐70 kDa为底物,对右旋糖酐酶酶学性质及催化机理进行研究.[结...     

华丽曲霉Z58有机磷农药降解酶的纯化和性质

华丽曲霉(Aspergillus ornatus)Z58有机磷农药降解酶经硫酸铵分级沉淀、Sephadex G100凝胶过滤、DEAE52离子交换层析得到了分离纯化,用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)鉴定为单一组分。凝胶过滤法测得分子量为67 000,提纯倍数为34.2,收率为17.8%。该酶的最适反应温度45℃,最适反应pH72,对热较稳定,并且能在pH6～10范围保持活性。重金属Cu2+对该酶具有明显的促进作用,而SDS对酶具有抑制作用。此酶对所试的有机磷农药都有较好降解作用。     

土曲霉金色变种AT8951菊粉酶的纯化和性质的研究

土典霉金色变种AT8951菊粉酶粗酶液经硫酸铵分段沉淀、DEAE Cellulose DE32离子交换、超滤、Sephadex G-150凝胶过滤和FPLC,获得两个菊粉酶组分EⅠ和EⅡ,经分析型FPLG和PAGE鉴定为单一纯和分析纯。EⅠ分子量为66KD,最适作用温度和pH分别55℃和5.8;EⅡ分子量为56KD,最适作用温度为57℃,最适pH为6.0。EⅠ和EⅡ皆为糖蛋白,多糖含量分别为24.7％和22％,都属于内切酶。本文还对EⅠ和EⅡ的Km值和I/s值,温度、pH、离子对酶活作用的影响等进行了研究。     

米曲霉蛋白酶的分离纯化及酶学性质研究

【目的】获得米曲霉蛋白酶主要成分及其酶学性质。【方法】利用硫酸铵盐析,DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析、Phenyl-Sepharose HP疏水层析和Superdex-G75/200凝胶层析对米曲霉所产蛋白酶系进行分离纯化,SDS-PAGE检测蛋白酶纯度和分子量,采用高效液相凝胶色谱分析两种蛋白酶酶解产物。【结果】从米曲霉所产蛋白酶系中分离纯化获得两种蛋白酶组分P1和P2,分子质量分别约为37 kD和45 kD。以酪蛋白为底物时,P1的Km=8.36 g/L,Vm=12.95μg/(mL·min),最适反应条件为pH 8.0、45°C;P2的Km=4.11 g/L,Vm=4.86μg/(mL·min),最适反应条件为pH 7.0、45°C。两种蛋白酶均对酪蛋白水解活性最高,而对牛血清蛋白的水解活性很低。P1和P2分别酶解大豆分离蛋白后水解产物中肽分子质量分布呈现出一定的差异。【结论】两种蛋白酶的酶学性质存在差异;两者对疏水氨基酸构成的肽键具有选择性,但其作用基团存在特异性。这些研究结果将为米曲霉所产蛋白酶在食品上的应用提供指导。     

重组大肠杆菌右旋糖酐蔗糖酶的纯化及其性质

[目的]研究工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28-dexYG产右旋糖酐蔗糖酶的纯化和酶学性质.[方法]工程菌经过IPTG诱导后生产含His-tag融合蛋白的右旋糖酐蔗糖酶,通过硫酸铵沉淀、Ni-NTA亲和层析纯化,得到纯度较高的酶蛋白,并对纯酶进行了酶学性质及动力学研究.[结果]经过SDS-PAGE测得该酶的分子量约为170 kDa,与理论推测值基本相同.以蔗糖为底物,酶促反应的最适温度为25～30℃,最适pH值为5.4,动力学常数Km值为10.43 mmol/L;酶活在pH 5.0～8.0较为稳定,在室温(25 ℃)保藏4天仍有59%的酶活力,4℃保存7周酶活力仅下降一半,但在35℃以上失活很快;Ca2 对催化作用有较大的促进,Mg2 有微弱的促进作用,K 对催化反应无影响,Cu2 的抑制作用最强.其他试剂对重组酶的活性有不同程度的影响,其中SDS抑制作用很强.[结论]研究为重组右旋糖酐蔗糖酶纯酶的获取、得到稳定性好、活性高的酶反应体系及利用该酶进行催化反应和工业化应用提供了重要参数.     

棘孢曲霉SM-L22β-葡萄糖苷酶的纯化与性质

通过分子筛层析和离子交换层析等手段,分离纯化了棘孢曲霉SM-L22纤维素酶系中的β-葡萄糖苷酶组分。通过SDS-PAGE和IEF电泳测得其分子量为57.9 kDa,等电点为pH 4.5。该酶组分的最适温度60℃,最适pH 5.5,在40℃以下以及pH 3.0~10.0范围内稳定。Fe2+和Mn2+ 对酶有激活作用,而 EDTA对酶有较明显的抑制作用。底物专一性实验表明,该酶可作用于纤维二糖、水杨素和乳糖。作用于纤维二糖和水杨素的Km值分别为17.13 10-3 mol/L 和11.93 10-3 mol/L,Vmax分别为3.456 10-4 mol/L/min和7.139 10-4 mol/L/min,Kcat分别为3.75 S-1和7.73 S-1。     

脱墨用棘孢曲霉SM-L22纤维素酶系中内切酶的纯化及性质

通过Bio GelP 60分子筛和DEAE 与Q sepharose离子交换层析等手段 ,分离纯化了棘孢曲霉SM L2 2纤维素酶系中五种内切酶组分EGⅡ 1、EGⅡ 2、EGⅢ 1、EGⅢ 2和EGⅣ ,并且对这五种内切酶组分的基本性质进行了研究。通过SDS PAGE和IEF电泳测得其分子量分别为 38 7,34 4,31 4,36 9和 2 3 7kD ,等电点分别为pH <3 5,<3 5,4 9,4 5和 5 0。 5个酶组分均属酸性纤维素酶 ,最适pH在 3 5～ 4 0之间 ;最适温度分别为 55℃、60℃、( 60～ 70 )℃、( 60～70 )℃和 60℃。各酶组分有较宽的pH稳定性 ;温度稳定性表现为EGⅡ 1 >EGⅡ 2 >EGⅢ 1>EGⅢ 2 >EGⅣ。EGⅡ 1和EGⅡ 2有较高的底物专一性 ,而EGⅢ 1、EGⅢ 2和EGⅣ对木聚糖有交叉活性。Fe2 +对除EGⅣ以外的四种酶组分都有激活作用 ,尤其是对EGⅢ 2有强烈的激活作用。动力学分析表明各纤维素酶组分对底物亲和力的大小与酶的催化率之间并无相关性。     

土曲霉金色变种AT8951菊粉酶的纯化和性质的研究

土曲霉金色变种ＡＴ８９５１菊粉酶粗酶液经硫酸铵分段沉淀、ＤＥＡＥＣｅｌｕｌｏｓｅＤＥ３２离子交换、超滤、ＳｅｐｈａｄｅｃＧ－１５０凝胶过滤和ＦＰＬＣ,获得两个菊粉酶组分ＥＩ和ＥＩＩ,经分析型ＦＰＬＣ和ＰＡＧＥ鉴定为单一纯和分析纯。ＥＩ分量为６６ＫＤ,适适作用温度和ＰＨ分别５５℃和５．８;ＥＩＩ分子量为５６ＫＤ,最适作用温度为５７℃,最适ＰＨ为６．０。ＥＩ和ＥＩＩ皆为糖蛋白,多糖含量分别为２４．７％     

脱墨用棘孢曲霉SM-L22纤维素酶系中内切酶的纯化及性质

通过Bio-Gel P-60分子筛和DEAE-与Q-sepharose离子交换层析等手段,分离纯化了棘孢曲霉SM-L22纤维素酶系中五种内切酶组分EGⅡ-1、EGⅡ-2、EGⅢ-1、EGⅢ-2和EGⅣ,并且对这五种内切酶组分的基本性质进行了研究.通过SDS-PAGE和IEF电泳测得其分子量分别为38.7,34.4,31.4,36.9和23.7kD,等电点分别为pH＜3.5,＜3.5,4.9,4.5和5.0.5个酶组分均属酸性纤维素酶,最适pH在3.5～4.0之间;最适温度分别为55℃、60℃、(60～70)℃、(60～70)℃和60℃.各酶组分有较宽的pH稳定性;温度稳定性表现为EGⅡ-1＞EGⅡ-2＞EGⅢ-1＞EGⅢ-2＞EGⅣ.EGⅡ-1和EGⅡ-2有较高的底物专一性,而EGⅢ-1、EGⅢ-2和EGⅣ对木聚糖有交叉活性.Fe2+对除EGⅣ以外的四种酶组分都有激活作用,尤其是对EGⅢ-2有强烈的激活作用.动力学分析表明各纤维素酶组分对底物亲和力的大小与酶的催化率之间并无相关性.     

右旋糖酐酶的底物吸附

用35％乙醇保护,底物占旋糖酐能对右旋糖酐酶有效地吸附。采用0．2mol／L pH8．0的KzHPO4-KH2PO4缓冲液(内含30％乙醇)进行解吸,总同收率在80％以上。粗酶液经此过程提纯了9倍。低温对吸附有利。 在酶稳定范围内,pH对吸附影响不大。酶浓度过高,吸附效率下降。对稀酶液可连续多次吸附以达到浓缩目的。1．5％(W／V)的右旋糖酐使可得到满意的吸附效果,对五种不同来原的右旋糖酐酶吸附率都很高,但不同来源的底物适用情况差别很大。     

棘孢曲霉SM-L22 β-葡萄糖苷酶的纯化与性质*

通过分子筛层析和离子交换层析等手段,分离纯化了棘孢曲霉SM-L22纤维素酶系中的β-葡萄糖苷酶组分。通过SDS-PAGE和IEF电泳测得其分子量为57.9 kDa,等电点为pH 4.5。该酶组分的最适温度60℃,最适pH 5.5,在40℃以下以及pH 3.0~10.0范围内稳定。Fe2+和Mn2+ 对酶有激活作用,而 EDTA对酶有较明显的抑制作用。底物专一性实验表明,该酶可作用于纤维二糖、水杨素和乳糖。作用于纤维二糖和水杨素的Km值分别为17.13 10-3 mol/L 和11.93 10-3 mol/L,Vmax分别为3.456 10-4 mol/L/min和7.139 10-4 mol/L/min,Kcat分别为3.75 S-1和7.73 S-1。     

右旋糖酐酶产生菌的筛选及其酶学性质的比较研究

从3162株真菌中筛出具有右旋糖酐酶话力的菌株528株,其中黄柄白曲霉(Asp. Flavi-pes)、蠕形青霉(Pen. Vermiculatum)、产黄青霉(Pen. Chrysogerum)和构巢曲霉(Asp. Nid-ulans)也产该酶,这在文献中尚未见报道。通过复筛,从中选出5株,它们分属黄柄白曲霉(Asp. Flavipe、二株)、肉色曲霉(Asp.carneus)、焦曲霉(Asp. Ustus)和淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)(各一株)。对它们的产酶特性作了一系列比较研究,发现所有酶的最适温度皆为50--55℃,最适作用PH为5.0—5.5,酶解最终产物是异麦芽塘、异麦芽三糖及少量葡萄糖,故它们皆属内切型右旋糖酐酶。此外它们在温度和PH稳定性、其它酶活力存在的情况、对不同底物作用的情况、凝胶电泳模式、金属离子和一些蛋白质变性剂的影响等方面都有一些差异。通过比较发现,由淡紫拟青霉8523菌产生的右旋糖酐酶具有较好的酶学性质：它在50\"0保温24小时和60℃保温1小时,剩余话力分别为95％和90％,在pH 3．5—1 0．5很宽的范围内是稳定的,此外它对SDS和脲的耐受性也较其它菌株的酶好。     

一株曲霉的一种中温糖化酶的纯化及其部分酶学特性

本研究从广西花坪自然保护区采集的土壤中筛选获得了一株产糖化酶丝状真菌菌株57-45,通过形态学观察和真菌内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列比对分析,将其初步鉴定为曲霉属(Aspergillus sp.)的一个种。纯化真菌57-45所产的一种胞外糖化酶经过硫酸铵分级沉淀、疏水层析和阴离子交换层析三步蛋白质纯化步骤,得到在SDS-PAGE上约60kD的单一蛋白质条带,薄层层析分析表明该纯化的蛋白质水解可溶性淀粉的产物只有葡萄糖,证明该纯化的蛋白质为糖化酶。纯化的糖化酶Km值为1.9mg/mL,Vmax为4148μmol/(min·mg),最适作用pH5.5,最适作用温度50℃,在同步糖化发酵中有应用的潜力。金属离子Fe3+、Zn2+、Cu2+对酶活有较强的抑制作用,EDTA对酶活有较强的促进作用。本文结果将为进一步研究曲霉糖化酶的酶学特性提供新的材料。     

海枣曲霉β—木糖苷酶的提纯和性质

从海枣曲霉麦麸培养物抽提液中,通过聚乙二醇６０００－磷酸钾缓冲液双水相分离,相继用Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１００凝胶过滤、ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ－５０离子交换柱层析、羟基磷石吸附层析、ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ－５０离子交换层析、ＳＥ－Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ－５０离子交换层析以及最适温度为６５℃,在ｐＨ３．５－６．５之间稳定,酶保温３０分钟时的半失活温度（ｔ１／２）为６８℃。酶的分子量为９     

海枣曲霉β—葡萄糖苷酶的提纯与性质

A beta-glucosidase has been purified to electrophoretically homogeneity from the wheat bran culture of Aspergillus phoenicis by PEG 6000-phosphate biphasic separation, column chromatography on Sephadex G-100, DEAE-Sephadex A-50 and SE-Sephadex C-50. The enzyme showed optimal activity at pH 5.0 and 60 degrees C. It was stable in the pH range of 4.0-7.5 and up to 55 degrees C. The enzyme activity was strongly inhibited by Ag+ and Hg2+. The molecular weight of the enzyme was 118000 as determined by SDS-PAGE and 195000 by gradient-PAGE. The isoelectric point was pI 3.95 as determined by PAGIF.     

米曲霉6—193α-淀粉酶的纯化和性质的研究

米陆霉(Aspergillus oryzae)突变株6—193的麦麸固体培养物,经水浸泡其中α-淀粉酶活力为每克干曲600单位。用硫酸铵分段沉淀．Sephadex G_75凝胶过滤和制备垂直平板电泳纯化,经PAGE鉴定为一条带,SDS凝胶电泳测定分子量为52,000。酶作用最适PH为5.0-6．0,最适温立为60℃。在60℃处理30分钟酶活力保留90％．加Ca2+后,酶的热急定性有提高。Ca2+、Li+和Mg2+对酶有一定的激活作用,而Ag+、Al3+、Fe2+、Cu2+、cr3+、Hg2+、Zn2+和Mn2+等对酶均有抑制作用。酶作用产物经薄层色谱分析,扫描,所产生的二糖和三糖之和为69 4％。     

右旋糖酐发酵液酶解制备右旋糖酐40中氮的控制

右旋糖酐发酵液经过吸附除杂和陶瓷膜过滤后处理,在右旋糖酐酶的作用下降解制备右旋糖酐40,对氮进行过程控制,达到右旋糖酐40国家标准。首先以蛋白质作为检测目标,对右旋糖酐发酵液进行吸附条件研究,利用最佳吸附条件进行右旋糖酐发酵液的吸附除杂,氮的去除率达到57%以上,氮含量降至0.09%以下;然后通过陶瓷膜过滤将右旋糖酐与果糖等杂糖分离,并进一步去除氮,氮的去除率达到45%以上,氮含量降至0.040%以下;最后利用右旋糖酐酶对右旋糖酐发酵液处理液进行酶解,右旋糖酐酶解液经过乙醇分级沉淀分离制备右旋糖酐40,氮的去除率达到89%以上,氮含量降至0.003%以下,达到≤0.007%的国家标准。右旋糖酐发酵液酶解制备右旋糖酐40工艺过程氮的控制可以使氮去除率达到98%以上,产品氮含量达到国家标准(≤0.007%),分子量分布有所改善,重均分子量35 000以上,10%小分子＞7 000。