巨大芽胞杆菌与普通生酮基古龙酸菌共培养过程中相互作用分子机制研究进展

混菌发酵法广泛应用于维生素C前体2-酮基-L-古龙酸的生产.为进一步改善工艺,多年来,科研人员一直致力于研究发酵过程中两菌相互作用的科学本质.目前,随着组学技术、高通量技术、生物信息学和生理学等多种技术与学科的迅速发展,为深入研究相互作用分子机制提供了新的方法和工具.通过蛋白质组学、代谢组学、比较基因组学、转录组学等多种组学数据的挖掘和分析,提供了系统中各层次之间的相互作用关系网络.在此基础上结合高通量的生理学验证分析,为诠释两菌相互作用分子机制和开发代谢工程改造策略奠定了基础.本文就近些年来在该研究方向的进展及其应用进行了简要归纳,并提出进一步研究的方向.     

山梨糖脱氢酶在乙酸钙不动杆菌中的表达

目的:在乙酸钙不动杆菌Y2004中表达山梨糖脱氢酶。方法:将酮古龙酸菌山梨糖脱氢酶基因sdh以及从pWH1266质粒上扩增的复制原点ori先后酶切连接到pBBR1MCS2质粒上,构建pBBR1MCS2-ori-sdh穿梭质粒;再以pBBR1MCS2-ori-sdh/DH5α为供体菌、乙酸钙不动杆菌Y2004为受体菌、pRK2013/HB101为辅助菌进行三亲本接合转移;从氨苄青霉素和卡那霉素双抗平板上挑取转化子进行培养,通过菌落PCR和提取质粒复转筛选阳性克隆,再通过活性电泳和体外糖酸转化实验检测阳性克隆的山梨糖脱氢酶活性。结果:构建了pBBRMCS2-ori-sdh质粒并转入乙酸钙不动杆菌Y2004中,活性电泳和体外实验证实阳性克隆具有山梨糖脱氢酶活性。结论:实现了山梨糖脱氢酶在乙酸钙不动杆菌Y2004中的表达,为单菌糖酸转化的进一步研究奠定了基础。     

产氢产乙酸菌ZR-1 的分离鉴定及产酸特性

采用改良的亨盖特厌氧操作技术, 从有机废水污泥中分离到一株耐低温高效产氢产乙酸菌ZR-1。经过对其形态学观察、生理生化特征研究及16S rRNA 序列比对, 初步鉴定为梭状芽胞杆菌属的乙二醇梭菌(Clostridium glycolicum)。通过单因子实验, 在厌氧条件下对该菌株的培养温度、pH、最适底物、金属离子的影响等产酸条件进行了优化。结果表明该菌株最适生长温度37 °C,最佳培养基初始pH 值8.5, 最适发酵底物丁酸盐, Mn²⁺对其产酸有一定的激活作用。最适培养条件下丁酸盐降解率达到12.7%, H₂ 含量达到了28.73%。     

一株芽孢杆菌在维生素C二步发酵中对小菌的促进作用

从土壤中分离到1株能更好促使小菌生长和产酸的芽孢杆菌B601,作为伴生菌与巨大芽孢杆菌相比,在生长过程中,发酵液中B601活菌数小于巨大芽孢杆菌,而其芽孢数则多于巨大芽孢杆菌。对B601组成菌系的发酵条件进行优化,得到如下结果：100g／L L-山梨糖、6g／L尿素、10g/L玉米浆、培养温度30℃和发酵周期44h。与巨大芽孢杆菌组成菌系相比其底物,L-山梨糖质量浓度提高了25％,尿素下降了50％．玉米浆质量浓度下降了33％,温度提高了2℃,发酵周期缩短了4h。结果表明：B601作为伴生菌,与巨大芽孢杆菌相比,该菌株明显提高了发酵效率。     

氧化葡萄糖酸杆菌中硫辛酸合成模块对维生素C一步混菌发酵的影响

在由氧化葡萄糖酸杆菌和普通生酮古龙酸杆菌构建的维生素C两菌一步发酵体系中,为了强化氧化葡萄糖酸杆菌对普通生酮古龙酸杆菌生长和产酸的促进作用,文中在氧化葡萄糖酸杆菌中构建硫辛酸合成功能模块。由含硫辛酸功能模块的氧化葡萄糖酸杆菌和普通生酮古龙酸杆菌组成的两菌一步体系,能减轻普通生酮古龙酸杆菌单菌培养时的生长抑制,强化两菌的互作关系,使维生素C前体(2-酮基-L-古龙酸,2-KGA)的产量提高到73.34 g/L(对照组为59.09 g/L),醇酸转化率提高到86.0%。研究结果为进一步优化维生素C两菌一步发酵体系提供了新思路。     

维生素C前体2-酮基-L-古龙酸二步混菌发酵研究新进展

维生素C（Vc）二步混菌发酵是我国首创具有自主知识产权的唯一应用于工业化生产Vc的微生物转化方法,该方法利用混合菌发酵L-山梨糖生产Vc前体物质-2-酮基-L-古龙酸,再经化学转化合成Vc;具有简化工艺,减少污染,降低能耗等优点。本文主要从产酸菌代谢关键酶、伴生菌胞外物质、组学以及外源添加物等方面综述Vc二步混菌发酵的最新研究进展,并提出进一步研究和探索的方向。     

家蚕肠道产蛋白酶细菌的分离筛选与分子鉴定

目的肠道细菌对家蚕具有重要的生理作用,探明家蚕肠道产蛋白酶细菌菌群对家蚕肠道细菌的高效开发与利用具有十分重要的意义。方法从菁松×皓月品种4龄家蚕肠液中分离与纯化肠道细菌,获得一株产高活力蛋白酶细菌,对该菌菌落进行形态学鉴定及菌体的显微镜检并结合16S rDNA方法进行了鉴定。结果该菌为革兰阴性杆菌,属于嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophom onas maltophilia)。结论该产蛋白酶细菌产酶能力较高,可进一步开发研究并用作微生态制剂。     

16S rDNA-RFLP分析新疆快生大豆根瘤菌的分类地位

采用１６Ｓ ｒＤＮＡ－ＲＦＬＰ技术,对自新疆土壤中捕捉的３４株快生大豆根瘤菌及相关已知种的模式菌株进行了比较分析。从酶切图谱类型和在结果表明,所有新分离的菌株与Ｓ．ｘｉｎｊｉａｎｇｅｎｓｉｓ的图谱类型基本一致,而与Ｓ．ｆｒｅｄｉｉ的图谱类型有明显差异,与Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ,Ｓ．ｓａｈｅｌｉ,Ｓ．ｍｅｄｉｃａｅ,Ｓ．ｔｅｒａｎｇａ也不相同。３４株新分离的菌株全部与Ｓ．ｘｉｎｇｊｉａｎｇｅｎｓｉｓｉ     

芽孢杆菌促普通生酮基古龙酸菌产酸机制研究进展

随着高通量测序技术、组学技术、生物信息学技术等多种技术的兴起与发展,关于维生素C混菌发酵中两菌作用关系的研究取得了一些成果。基于此,本文从芽孢、氨基酸、B族维生素、环境应力及小分子物质方面,对目前关于两菌间相互作用机制的研究进行综述,并为接下来的进一步研究提供新思路。     

一株果胶酶产生菌HDYM-02的分离鉴定及系统发育分析

对1株从沤麻液中分离的果胶酶产生菌HDYM-02进行了形态、生理生化特征及16S rDNA序列分析,结果表明该菌株为革兰染色阳性,菌体大小为(1~1.2)×(2.7~2.9)μm,最适生长温度为33~35℃之间,最适生长pH为6.5~7.0。以该菌株16S rDNA序列同源性为基础,比对分析发现其与蜡状芽胞杆菌(Bacillus cereus)的同源性高达99.5%。     

一株苯酚降解菌的分离与鉴定

目的：筛选能高效降解苯酚的微生物,并进行初步鉴定。方法：从某焦化厂排水沟采集污泥,通过逐步驯化筛选苯酚降解菌株;利用形态观察、生理生化检测、16SrDNA序列分析进行初步鉴定。结果：筛选获得1株苯酚降解菌JDM-2—1,该菌能够以苯酚为惟一碳源,耐酚能力高达2200mg／L,在30℃和pH7．0条件下,42h内能将800mg／L的苯酚彻底降解;初步鉴定其为球形芽孢杆菌（Bacillus sphaericus）。结论：菌株JDM-2-1是一株高效降解苯酚的球形芽孢杆菌。     

一株苯胺降解菌的分离及其苯胺降解特性的研究

目的:筛选高效苯胺降解菌并研究其降解特性,为利用微生物进行苯胺环境污染物修复奠定基础.方法:利用含苯胺的A15培养基分离筛选苯胺降解菌,探讨苯胺降解最佳条件、降解代谢途径,利用16S rDNA基因扩增测序法对株菌进行分子鉴定.结果:获得了一株以苯胺为惟一碳源、氮源生长的高效苯胺降解菌AN6-4.该菌降解苯胺的最高浓度为2500mg/L,降解苯胺的最适温度和pH值分别为30℃、7.0;该菌在60h内可以将1500mg/L浓度的苯胺完全降解;重金属离子对该菌株降解苯胺有不同程度的抑制作用;代谢机制研究表明,该菌株可以诱导合成邻苯二酚-2,3-双加氧酶并分泌到胞外降解苯胺;16S rDNA基因序列同源性比较结果表明该菌属芽孢杆菌的一种.结论:所获得的苯胺降解菌对于研究苯胺降解机制和苯胺环境污染物的生物修复具有重要的理论和潜在应用价值.     

越冬沼气池中甲烷螺菌的分离及其系统分类学分析

通过改进的亨盖特(Hungate)厌氧技术,从越冬猪粪发酵沼气池中分离到1株产甲烷菌菌株SH01。该菌呈弯曲杆状,革兰氏阴性,有运动性,形成淡黄色菌落,能利用二氧化碳和甲酸钠作为碳源,但不能利用甲醇、乙酸钠和三甲胺。该菌最适生长pH为6.8～7.2,最适生长温度为35～40℃,最适Na 浓度低于0.1mol/L。通过生理、形态结构特征与16S rDNA序列的同源性分析,表明菌株SH01是甲烷螺菌属中的一个成员,为亨氏甲烷螺菌(Methanospirllum hungatei)。     

利用-碳化合物(C1)细菌的分离及基因组文库的构建

从污水样品中筛选到能利用甲醇的菌株B,经16SrDNA测序分析鉴定为肺炎克氏杆菌（Klebsiella pneuumo-niae）。甲醛耐受能力的测试表明该菌对甲醛具有较强耐受能力,能在含有8～15mm。l／L甲醛的LB培养基上生长。S0uthem杂交分析说明这菌株的基因组中有甲基营养菌6-酸己酮糖合成酶（HPS）和6-磷酸果糖异构酶（PHI）基因的同源序列。本研究以pUC118为载体构建了基因组文库,进一步检测结果说明所构建的基因组文库质量符合要求。     

利用一碳化合物(C1)细菌的分离及基因组文库的构建

从污水样品中筛选到能利用甲醇的菌株B,经16SrDNA测序分析鉴定为肺炎克氏杆菌(Klebsiella pneumo-niae)。甲醛耐受能力的测试表明该菌对甲醛具有较强耐受能力,能在含有8￣15mmol/L甲醛的LB培养基上生长。Southern杂交分析说明这菌株的基因组中有甲基营养菌6-磷酸己酮糖合成酶(HPS)和6-磷酸果糖异构酶(PHI)基因的同源序列。本研究以pUC118为载体构建了基因组文库,进一步检测结果说明所构建的基因组文库质量符合要求。     

蛭弧菌Bdh5221株理化特性和16S rDNA序列分析

蛭弧菌海水菌株Bdh5221于2005年8月从海南琼海对虾养殖场周边排水沟水样中分离所得,具有裂解多数革兰氏阴细菌的特性.在前期Bdh5221噬菌谱研究的基础上,利用其可利用热致死革兰氏阴细菌的生长特性,对其理化特性、药敏特性和16S rDNA序列分析进行了相关研究.结果表明:该株蛭弧菌为革兰氏阴性菌,呈杆状、弧状,一端有极长的极生鞭毛,细菌大小在(0.2-0.5)μm×(0.6-1.5)μm左右;生化实验表明:Bdh5221明胶穿刺试验和接触酶试验呈阳性,氧化酶反应呈阴性,对弧菌抑制剂O/129敏感;药敏实验表明:此菌对新霉素、卡那霉素、恩诺沙星敏感,对青霉素、磺胺啼啶和万古霉素不敏感;对其16S rDNA序列的测定、分析表明,与其同源性最高的细菌是一株新发现的海洋新种细菌Kordiimonas gwangyangensis,同源性高达99%,而与其他蛭弧菌属细菌的同源性从90%到70%不等,并针对其基因序列做了相关进化分析.     

日粮中添加鱼油后肉牛瘤胃细菌区系的变化

目的：研究肉牛日粮中添加2%鱼油后瘤胃细菌区系的变化。方法：分别于添加鱼油前后取瘤胃液提取总DNA,根据细菌通用引物27F/1492R扩增16S rDNA基因序列,分别构建2个16S rDNA基因文库;从每个文库中各随机挑取384个克隆,对阳性克隆用HhaⅠ进行限制性片段长度多态性（RFLP）分析、聚类,取各RFLP类群中的代表克隆进行16S rDNA序列测定,构建系统发育树,研究细菌区系多样性的变化。结果：添加鱼油前、后,文库的RFLP图谱分别可以分成74和41个RFLP类群;添加鱼油前后的优势菌群均为噬纤维菌-屈挠杆菌-拟杆菌（CFB）和低（G＋C）含量的革兰阳性菌（LGCGPB）,但添加鱼油后文库中LGCGPB比例降低,而且未检测到纤维菌门细菌;有50%～60%的测定序列与GenBank数据库中的序列相似性高于97%,90%以上为未培养的细菌;添加鱼油后瘤胃细菌的多样性减少。结论：日粮添加鱼油后CFB比例增高但多样性下降,LGCGPB、纤维杆菌比例下降,这一结果为调控瘤胃发酵提供了依据。     

长白山温泉无氧芽孢杆菌的分离鉴定

[目的]对长白山温泉中嗜热微生物进行分离鉴定,并了解其生理生化特性.[方法]采用橄榄油富集培养基,稀释平板涂布法对长白山温泉样品进行分离得到一株嗜热菌CBS-5;在电子和光学显微镜下观察菌体形态和芽孢;应用生理生化试验、16S rDNA序列分析以及(G C)mol%含量等方法对菌株特性进行鉴定.[结果]菌株CBS-5为革兰氏阳性菌,无鞭毛,产端生芽孢,最适生长温度为65℃,最适pH7.7左右,能以蔗糖、麦芽糖和乳糖等作为唯一碳源生长,具有酯酶和过氧化氢酶活性,对卡那霉素、红霉素和硫酸新霉素等抗生素均无抗性.Tm法测定该菌的(G C)mol%含量为41.9%.脂肪酸成分分析表明在CBS-5中iso-15:0的含量最高,为24.20%,与无氧芽孢杆菌属成员一致.以该菌的16S rDNA序列为基础构建了系统发育树;16S rDNA序列同源性比对表明该菌与无氧芽孢杆菌属各种之间的同源性在95.1%-98.5%之间.[结论]菌株CBS-5(=JCM 15484)是一株嗜热无氧芽孢杆菌,具有产酶活性,对于研究和开发化工、食品和环境保护方面的工业用酶具有重要价值.     

中国和美国原始土壤中非高温泉古菌的发现和鉴定

近年来在非极端环境中已经发现有古菌(Archaea)的存在, 但在中国原始土壤中还未见报道。本研究的目的是调查古菌是否存在于两个分别取自中国新疆和广西的土壤及两个美国亚利桑那州南部地区的土壤中。我们分别构建了这四个原始土壤的古菌16S rDNA文库并对28个克隆的16S rDNA进行了鉴定。所有这些16S rDNA的序列都归类于古菌的泉古菌门(Crenarchaeota)。进化树分析表明, 这些泉古菌的16S rDNA属于非高温陆地环境中的泉古菌种群, 明显区别于海洋和淡水地带的泉古菌种群。这个泉古菌种群又有两个分支, 这两个分支在16S rDNA序列上和G C含量上有明显的区别。本研究在两个中国和两个美国原始土壤中鉴定了非高温泉古菌的存在, 由此证明泉古菌的存在范围不只局限于高温等极端环境。另外, 美国原始土壤中的泉古菌只属于一个进化分支, 这说明非高温泉古菌种群的类型和土壤的地理位置及土壤特性有关。