基于比较转录组学分析NaCl胁迫影响德尔卑沙门氏菌的耐渗机制

【目的】研究高渗胁迫条件下德尔卑沙门氏菌(Salmonella enterica subsp. enterica Derby, S. Derby)的转录组调控机制,分析差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs)表达水平,探究在高渗胁迫影响下德尔卑沙门氏菌耐渗反应的相关代谢通路。【方法】通过高渗胁迫诱导德尔卑沙门氏菌的耐渗性,提取菌株的总RNA,去除rRNA,构建cDNA文库。利用转录组测序技术及生物学信息技术分析相关DEGs,并通过实时荧光定量PCR (real-time fluorescence quantitative PCR, qRT-PCR)进行验证。【结果】胁迫组德尔卑沙门氏菌通过转录组测序结果发现有3 950个DEGs,其中具有显著上调的基因21个,显著下调基因38个。涉及到细胞膜蛋白、氨基酸的代谢等相关基因上调,协助德尔卑沙门氏菌在高渗环境中存活。与此同时,胁迫组德尔卑沙门氏菌的糖转运系统(sugar transport system, PTS)、糖酵解过程以及抗氧化性相关基因表达显著下调,这是由于高渗环境菌体需要在体内储存大量糖类等物质,从而降低了糖原的消耗,进而导致细胞外膜的脂多糖合成受到抑制,降低了高渗胁迫下德尔卑沙门氏菌细胞膜表面的O抗原的合成。【结论】高渗环境诱导后显著提高了德尔卑沙门氏菌的耐渗性,其中Na⁺/H⁺逆向转运蛋以及谷氨酸的代谢通路发挥着重要的作用,为进一步了解以及更好地控制其在食品中的污染提供了理论依据。     

基于比较转录组学分析NaCl 胁迫影响德尔卑沙门氏菌的耐渗机制

【目的】研究高渗胁迫条件下德尔卑沙门氏菌(Salmonella enterica subsp.enterica Derby,S.Derby)的转录组调控机制,分析差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)表达水平,探究在高渗胁迫影响下德尔卑沙门氏菌耐渗反应的相关代谢通路。【方法】通过高渗胁迫诱导德尔卑沙门氏菌的耐渗性,提取菌株的总RNA,去除rRNA,构建cDNA文库。利用转录组测序技术及生物学信息技术分析相关DEGs,并通过实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)进行验证。【结果】胁迫组德尔卑沙门氏菌通过转录组测序结果发现有3950个DEGs,其中具有显著上调的基因21个,显著下调基因38个。涉及到细胞膜蛋白、氨基酸的代谢等相关基因上调,协助德尔卑沙门氏菌在高渗环境中存活。与此同时,胁迫组德尔卑沙门氏菌的糖转运系统(sugar transport system,PTS)、糖酵解过程以及抗氧化性相关基因表达显著下调,这是由于高渗环境菌体需要在体内储存大量糖类等物质,从而降低了糖原的消耗,进而导致细胞外膜的脂多糖合成受到抑制,降低了高渗胁迫下德尔卑沙门氏菌细胞膜表面的O抗原的合成。【结论】高渗环境诱导后显著提高了德尔卑沙门氏菌的耐渗性,其中Na+/H+逆向转运蛋以及谷氨酸的代谢通路发挥着重要的作用,为进一步了解以及更好地控制其在食品中的污染提供了理论依据。     

应用PMA-qPCR方法快速准确检测发酵乳制品中副干酪乳杆菌活菌的研究

目的 建立快速、准确检测发酵乳制品中副干酪乳杆菌活菌的方法.方法 发酵乳制品中副干酪乳杆菌先经PMA处理后,采用沸水浴的方法提取副干酪乳杆菌基因组,然后通过qPCR方法检测发酵乳制品中的活菌.结果 副干酪乳杆菌经90℃处理6 min,即为膜损伤菌:PMA能够抑制107 CFU/mL死菌DNA的扩增,而不影响活菌DNA的扩增;PMA-qPCR能够准确检测到样品中活菌.结论 建立了一种快速、准确的方法检测发酵乳制品中的副干酪乳杆菌活菌.     

重组酶介导等温核酸扩增方法快速检测土壤沙门氏菌

【背景】沙门氏菌(Salmonella)是一种可以引起人畜患病的致病菌,也是最主要的食源性细菌之一。土壤中的沙门氏菌可通过蔬菜等植物进入人体,引发食物中毒。但由于土壤性质及其他微生物的干扰,如何快速甄别土壤是否受到沙门氏菌的污染仍是一个难题。【目的】建立一种快速、灵敏检测土壤沙门氏菌的实时重组酶介导等温核酸扩增(Real-Time Recombinase Aided Amplification,RT-RAA)方法。【方法】针对沙门氏菌invA基因序列设计特异性引物和探针,构建含有invA基因待检片段的重组质粒,评价RT-RAA方法的灵敏度;分别以肠炎沙门氏菌、大肠杆菌、福氏志贺氏菌和金黄色葡萄球菌的基因组DNA为模板,评价RT-RAA方法的特异性;RT-RAA方法用于番茄、生姜土壤中沙门氏菌的检测,同时用平板培养法进行验证。【结果】RT-RAA方法可用于重组质粒中invA基因片段的检测,在39℃条件下,20 min内即可获得检测结果,最低检测质粒拷贝数为10拷贝/反应,而且与大肠杆菌、福氏志贺氏菌和金黄色葡萄球菌无交叉反应。土壤样品DNA的RT-RAA检测结果显示,供试番茄土已被沙门氏菌污染,而生姜土则没有,与平板培养结果一致。【结论】RT-RAA方法具有灵敏度高和特异性强的特点,可用于土壤沙门氏菌污染的快速检测。     

叠氮溴化丙锭-荧光定量PCR法实时快速检测5种乳杆菌活菌数方法的建立与应用

【背景】乳杆菌属是发酵食品中最常见的微生物之一,与食品的品质和安全密切相关,定量检测乳杆菌活菌数、解析乳杆菌群落组成对发酵乃至肠道微生物等具有重要意义。【目的】建立一种在种水平上定量检测5种乳杆菌活菌数的叠氮溴化丙锭-荧光定量PCR(propidium monoazide-quantitativePCR,PMA-qPCR)检测方法并探讨其适用性。【方法】以植物乳杆菌、发酵乳杆菌、短乳杆菌、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌等发酵食品中常见的5种乳杆菌为目标菌株,查找并筛选特异性引物用于荧光定量PCR(qPCR)检测,优化叠氮溴化丙锭(PMA)处理条件,测定PMA-qPCR检测法的特异性、灵敏度及可靠性。最后利用PMA-qPCR法检测黄酒酿造过程中5种乳杆菌的活菌数。【结果】PMA最佳处理条件为:浓度20μmol/L下暗处理15 min后曝光15 min,此时可抑制样品中99.89%的死菌DNA扩增。该方法特异性高,能够准确识别5种乳杆菌;线性关系强,R2>0.98;灵敏度高,检测限为101.8-103.2 CFU/mL;重复性好,Cq值变异系数小于1%;与平板计数相比差异不显著(统计学上),...     

PMA结合ddPCR检测食品中金黄色葡萄球菌的研究

研究了将叠氮溴化丙锭(PMA)与微滴式数字PCR(ddPCR)技术相结合,用于金黄色葡萄球菌活菌的检测。结果表明,强烈光照15 min,可以使PMA与死菌DNA共价交联,同时钝化游离的PMA;可以有效抑制金黄色葡萄球菌死菌DNAPCR扩增的PMA终浓度为2.0μg/m L;不抑制活菌DNA扩增的PMA最高浓度是5.0μg/m L。在不同死、活菌比例下,PMA-ddPCR可以定量检测活菌,避免了死菌DNA的干扰,本方法的检出限为10 copy/20μL。利用PMA-ddPCR检测人工污染鸡肉样品,最低可检出102cfu/m L的金黄色葡萄球菌。表明PMA-ddPCR方法的灵敏度高。     

SD-PMA-ddPCR检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌

【目的】检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌活菌。【方法】利用脱氧胆酸钠(SD)对受损细胞预处理,然后使叠氮溴化丙锭(PMA)进入受损细胞与DNA发生共价交联,提取细菌基因组DNA进行微滴式数字PCR(dd PCR)检测。【结果】0.1%SD和5.0 mg/L PMA协同作用,可以有效抑制108 CFU/m L的单核细胞增生李斯特氏菌死菌DNA的PCR扩增。经过SD和PMA对样品预处理,dd PCR可以在死菌存在条件下,定量检测鸡肉中单核细胞增生李斯特氏菌活菌,消除了"假阳性"结果的出现。活菌灵敏度检测结果显示:SD-PMA-dd PCR的灵敏度为2.0 copies/20μL。SD-PMA-dd PCR方法精密度和稳定性良好。【结论】SD-PMA-dd PCR在检测食源性致病菌方面有巨大的发展空间。     

植物检疫性病毒等温扩增检测技术研究进展

植物病毒严重影响农林作物的产量和质量.随着全球化的快速发展,植物检疫性病毒跨境入侵风险加剧,研发植物检疫性病毒的精准、快速的检测技术对于保障进出口贸易及农林业生产安全具有重要作用.早期植物病毒检测主要基于寄主生物学症状、病毒形态观察以及ELISA为主的血清学检测方法等.当前,核酸扩增技术成为主要的植物病毒检测方法,特别是近20年来发展起来的等温核酸扩增技术,因其具有快速、灵敏、适于现场检测等优势,在许多植物病毒检测中广泛开展研究.其中,我国20余种进境植物检疫性病毒已建立了等温扩增检测技术.本文在综述等温扩增技术原理的基础上,归纳总结了主要等温扩增技术在植物检疫性病毒检测中的研究进展,并对其在口岸检疫的应用前景进行展望.     

等温核酸扩增技术在病原体检测中的应用

近年来,新型传染病相继爆发,如严重急性呼吸综合征（severe acute respiratory syndrome,SARS）、H7N9禽流感等,严重威胁着人类健康和社会、经济的可持续发展,同时给传染病的防控带来了严峻挑战。病原体检测是传染病防控的重要环节,越来越多的新技术被应用其中。等温核酸扩增技术作为一种快速、灵敏度高的病原体检测技术,已取得了长足发展。对等温核酸扩增技术的原理、重要特性及其在病原体检测中的应用进展进行了较为全面的综述,以期为这一技术的推广和应用提供重要参考。     

重组酶聚合酶等温扩增快速检测肺炎支原体方法的建立和初步应用

摘要 目的：建立基于重组酶聚合酶扩增技术（RPA）技术快速检测肺炎支原体的方法。方法：本研究以肺炎支原体编码P1黏附蛋白为靶基因,利用Primer Premier 5软件进行引物、探针的设计,最终筛选出最佳引物。同时设计相应的实时荧光定量PCR（RT-PCR）引物用于后续的验证试验。对反应体系试剂比例、反应时间、反应温度、引物探针浓度进行确定。肺炎支原体、解脲支原体、人型支原体、肺炎克雷伯菌、肺炎双球菌、大肠杆菌和链球菌作为对照评估RPA检测肺炎支原体的特异性及敏感度。结果：RPA快速检测肺炎支原体方法仅需14 min,检测灵敏度达200 copies/mL;6种非肺炎支原体均不能扩增,特异性较高。结论：本研究建立了肺炎支原体的RPA快速检测方法,具有迅速、简便、经济等优势,为肺炎支原体的快速检测提供一个新的有利工具。     

一株牛源都柏林沙门氏菌的全基因组测序及毒力与耐药性分析

【背景】沙门氏菌(Salmonella spp.)是重要的人畜共患病原菌,其毒力和耐药性的不断增强引起广泛关注。【目的】了解从通辽市一犊牛死亡病例中所分离牛源都柏林沙门氏菌的毒力及耐药性情况。【方法】以病死犊牛肺脏为材料,经细菌分离纯化及16S rRNA基因测序,鉴定病原为沙门氏菌。采用动物试验、药敏试验和PCR方法对分离菌进行毒力、耐药性,以及毒力基因和耐药基因检测,并对其进行全基因组测序分析。【结果】分离菌具有较强毒力,对小鼠半数致死量为2.8×10⁶ CFU/mL。分离菌为多重耐药菌,仅对多粘菌素B和噻孢霉素敏感,对强力霉素和恩诺沙星中度敏感。检测13种沙门氏菌常见毒力基因,检出率为92.3%。对分离菌进行全基因组测序分析,该菌株为都柏林沙门氏菌,基因组大小为4 965 370 bp,GC含量为52.12%,同时携带2个质粒,大小分别为79 524 bp (pTLS-1)和45 301 bp (pTLS-2)。分离菌中共携带996个毒力基因和24个毒力岛;共携带42个耐药基因,其中4个为可水平转移基因,基因组中存在9个可移动遗传元件,包括插入序列和转座子等。【结论】分离牛源都柏林沙门氏菌菌株具有较强毒力且为多重耐药株,携带大量毒力基因及耐药基因。     

高致病性美人鱼发光杆菌美人鱼亚种胞外产物的毒力特性分析

【目的】美人鱼发光杆菌美人鱼亚种(Photobacterium damselae subsp. damselae,PDD)是一种可导致多种海洋生物患病的重要病原菌。本研究以从我国海水养殖环境中分离的具有强磷脂酶活性、强溶血性表型且具有高致病性的2株PDD菌株为研究对象,分析PDD菌株胞外产物(extracellularproducts,ECP)的致病性及细胞毒性,及其与菌株致病性表型的相关性。【方法】利用培养基平板法测定菌株PDD1605、PDD1608的ECP体外磷脂酶活性和溶血性;通过人工感染实验测定PDD1605和PDD1608活菌株及其ECP对许氏平鲉的致病性,并进行组织病理切片观察组织的病理损伤;通过向人胚肾细胞系HEK293T和小鼠成纤维细胞系MCFS等2种培养细胞中添加菌株PDD1605和PDD1608的ECP测定其对哺乳动物的细胞毒性。【结果】人工感染PDD1605和PDD1608活菌株对许氏平鲉均表现为高致病性,5×108CFU/mL的菌液浓度24h内受试鱼全部死亡;菌株PDD1605和PDD1608的ECP对许氏平鲉同样表现为高致病性,受试鱼的死亡曲线与感染活菌株的...     

High efficiency transformation of Salmonella typhimurium and Salmonella typhi by electroporation

Summary Salmonella typhimurium and S. typhi were transformd with high efficiency by electroporation. Transformation efficiencies of up to 10¹⁰ transformants per g of pBR322 were obtained. In contrast to chemical transformation methods, neither the smooth lipopolysaccharide of S. typhimurium nor the Vi capsular polysaccharide of S. typhi greatly affected transformation efficiency. The introduction of a galE mutation slightly improved transformation efficiency in S. typhimurium (< tenfold) while the Vi antigen of S. typhi had no detectable effect. The transformation efficiency of S. typhimurium with DNA derived from Escherichia coli was increased greatly by the removal of the hsd restriction system (100-fold). Under these conditions electroporation can be used for the routine and direct transformation of Salmonella strains with partially purified (alkaline lysis) plasmid DNA from E. coli.     

新疆外来入侵杂草豚草属LAMP快速检测技术的建立

【目的】开发外来入侵生物三裂叶豚草和豚草不同生育期、不同部位的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技术,以达到田间快速、准确和高效识别的目的。【方法】以SYBR Green Ⅰ为指示剂,分别针对三裂叶豚草和豚草不同发育阶段(幼苗期、生长期、种子期)开展LAMP技术开发。【结果】特异性验证结果显示,所检测杂草的LAMP产物均呈阳性(产生白色沉淀),而与其对照的其他2种杂草的LAMP产物均为阴性(无白色沉淀)。灵敏度检测结果显示,该体系的DNA最低检测限为10^-10 ng·μL^-1,比常规聚合酶链式反应灵敏度高。【结论】本研究建立的LAMP检测体系能有效应用于三裂叶豚草和豚草样本的快速检测,为其快速、高效识别提供技术支撑。     

Rapid detection of viable bacteria by nested polymerase chain reaction via long DNA amplification after ethidium monoazide treatment

In assays to determine whether viable cells of Enterobacteriaceae are present in pasteurized milk, the typical ethidium monoazide (EMA) polymerase chain reaction (PCR) targets a short stretch of DNA. This process often triggers false-positive results owing to the high level of dead cells of Enterobacteriaceae that had initially contaminated the sample. We have developed a novel, direct, real-time PCR that does not require DNA isolation (DQ-PCR) to detect low levels of cells of Enterobacteriaceae regardless of live and dead cells first. We confirmed that the DQ-PCR targeting a long DNA (the 16S ribosomal RNA [rRNA] gene, amplified length of 1514 bp) following EMA treatment is a promising tool to detect live bacteria of all genera owing to the complete suppression of background signal from high levels of dead bacteria in pasteurized milk. However, when identifying viable bacteria in pasteurized milk, commercial PCR primers designed for detecting long stretches of DNA are generally not available. Thus, we treated samples with EMA and then carried out an initial round of PCR of a long stretch of DNA (16S gene, 1514 bp). We then performed another round of PCR, a novel nested PCR to generate short products using commercial primers. This procedure resulted in the rapid detection of low levels of viable cells of Enterobacteriaceae.     

唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒假单胞菌酵米面亚种环介导等温扩增荧光方法的建立

【目的】建立一个基于环介导等温扩增与荧光探针结合的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌椰毒假单胞菌酵米面亚种(Burkholderia gladioli pv. cocovenenans)特异性检测方法。【方法】通过多重序列比对分析,选择B. gladioli pv. cocovenenans共有的bonA为靶位点,设计环介导等温扩增的特异性引物和荧光探针,通过19株B. gladioli和3株非目标菌株,验证该方法的特异性。将该方法的检测特异性与现有的基于实时荧光定量PCR鉴定B. gladioli pv. cocovenenans的方法进行比较,并对建立的方法进行灵敏度探究。【结果】建立的环介导等温扩增荧光鉴定方法对B. gladioli pv.cocovenenans具有特异性,能在30 min内得出结果,且该方法能进行可视化直接观测。该方法的基因组DNA最低检测限度为1.98pg/μL,检测灵敏度为2.7×10²CFU/mL。另外,该方法能应用到食品样品中B. gladioli pv. cocovenenans的检测。【结论】本研究建立了一个快速、可视化、特异性强的检测方...     

中国黑粉菌属和利罗黑粉菌属

黑粉菌属是Roussel 1806年建立的,全世界记载有三百余种,主要寄生于禾本科,是经济作物及牧草的重要致病菌·长期以来,对黑粉菌的邢子使用过各种名称,如厚垣孢子,冬孢子及黑粉孢子等.本文采用黑粉孢子以区别锈菌的冬孢子. 芳’(1979)在《中国真菌总汇》中列出黑粉菌属五十种及一个变型.作者经过显微结构和超显微结构的研究,承认其中二十九种为正确名称,八种及一变型为异名,顶黑粉菌(Ustilago acrearus Berk.)由于错拼而被废弃.埃地黑粉菌(Ustilago emodensis Berk.)被转移至利罗粉菌属(Liroa).另有十一种黑粉菌因缺少标本留待今后订正.自1979年以后,杨信东(1983)增加黑粉菌属二种我国新纪录,K.范基和郭林(1986)描述一新种,四种新纪录.在本文中,作者描述一新种:鸢尾蒜黑粉(Ustilago ixiolirii Guo L) ,孢子堆生在蒴果内,不开裂,黑色,粉末状.黑粉孢子球形,近球形,稀椭圆形, 12.5-21×10-21μm,黑褐色,壁厚1-1.Sμm,纹饰脑状.是迄今生在石蒜科植物上唯一黑粉菌的种,其它几种黑粉菌均属条黑粉菌属.本文增加七种我国新纪录.共计四十九种,寄生于六科四十四属植物,主要是禾本科和蓼科.这仅是黑粉菌属研究的初步报告,在全国范围内大量采集黑粉菌标本后,作者相信会有更多新种和我国新纪录被发现.利罗黑粉菌属(Liroa)是从黑粉菌属(Ustaligo)分出的,此属为单种属.     

伤寒沙门菌基因组DNA芯片的制备与基因表达谱分析应用

伤寒沙门菌是一种具有鞭毛的革兰阴性人类肠道致病菌,也是一种重要的原核生物研究用模式菌．基因组芯片能够系统、全面且高效地观察生物的基因表达及进行基因组结构比较．利用伤寒沙门菌现有的全基因组序列,以Ty2菌株的基因组为基准,选取CT18菌株和z66阳性菌株的特异性蛋白编码基因,设计特异性引物,经PCR有效扩增出4 201个基因,产物纯化后点样于多聚赖氨酸玻片制备伤寒沙门菌基因组DNA芯片,并验证了芯片样点位次与效果．通过对基因表达谱分析的各种条件进行优化,建立相应的表达谱分析方法,并用于比较伤寒沙门菌野生株在高渗、低渗条件下的基因表达差异,结果与以前的报道基本一致．结果表明,成功建立了伤寒沙门菌基因组DNA芯片及表达谱分析方法,可为有关伤寒沙门菌基因表达调控及致病性机理、进化和基因多样性等方面的深入研究提供有效的技术支持．     

多酶恒温扩增核酸试纸条法快速检测肺炎支原体方法的建立及应用

【背景】肺炎支原体是导致儿童和青少年呼吸道感染的重要病原体,长期以来由于其临床表现不特异而容易错过最佳治疗时期。【目的】结合多酶恒温扩增(multienzyme isothermal rapid amplification,MIRA)技术和核酸试纸条建立一种快速检测肺炎支原体的方法。【方法】以肺炎支原体社区获得性肺炎呼吸窘迫综合征(community acquired respiratory distress syndrome, CARDS)毒素编码基因为靶基因设计引物和探针,对反应体系的温度、时间等进行优化,评估其敏感性,通过检测肺炎支原体和其余7种病原体分析其特异性,并对35份临床样本进行验证。【结果】MIRA核酸试纸条法在37℃条件下,15 min内便可完成对肺炎支原体的检测,最低检出限为10 copies/μL;除肺炎支原体外,其余7种病原体均不能扩增,特异性较好。以实时荧光PCR检测为标准,MIRA核酸试纸条法对35份临床样本检测后的诊断特异度为100.00%、灵敏度为96.15%、阴性预测值为90.00%、阳性预测值为100.00%。【结论】本研究建立了MIRA核酸试纸条法...