溶菌酶1在小鼠超数排卵前后孵化及休眠囊胚中差异表达的研究

目的研究溶菌酶1(lysozyme 1,LYZ1)基因在超数排卵前后小鼠孵化囊胚和休眠胚胎中的分布以及表达,探究动物胚胎着床过程中新的调节机制。方法从妊娠5 d ICR小鼠体内获取的正常孵化囊胚和超排囊胚,利用小鼠延迟着床模型于妊娠第8天获取休眠胚胎和超排休眠胚胎。利用免疫荧光和Western Blot方法检测LYZ1蛋白在四组胚胎中的分布和差异表达变化。结果 LYZ1在超数排卵前、后小鼠孵化囊胚和休眠胚胎中均有表达,且主要集中在内细胞团中,滋养层细胞和胞质中少见分布;与未进行超排的小鼠相比,LYZ1蛋白在超排后小鼠胚胎中表达量显著上调,与未营造休眠模型的小鼠相比,LYZ1蛋白在休眠模型小鼠胚胎中的表达量显著上调。结论 LYZ1蛋白在囊胚内细胞团中表达,可能参与调节胚胎内细胞团的发育;LYZ1蛋白在超排-休眠胚胎中的高表达,说明LYZ1蛋白在休眠和超数排卵的双重影响下,会因为抵御不利环境而上调。     

经程序化冷冻的小鼠休眠胚胎的基因表达谱差异分析

目的探讨小鼠休眠胚胎经程序化冷冻后基因表达谱的变化及相关信号通路的改变趋势。方法采用Affymetrix基因芯片检测小鼠正常休眠胚胎和经程序化冷冻后的休眠胚胎的差异表达基因;采用GO分析和Pathway分析等生物信息学方法进一步了解相关信号通路的改变。结果经程序化冷冻后的小鼠休眠胚胎与正常休眠胚胎相比,存在228个差异表达基因,其中50个基因表达上调,178个基因表达下调。Pathway分析显示黏着斑通路、细胞外基质受体相互作用通路、肌动蛋白细胞骨架调节通路、细胞凋亡通路、细胞通讯通路、泛素介导的蛋白质水解通路、甘油磷脂代谢通路、小细胞肺癌通路、TGF-β信号通路、MAPK信号通路等基因差异表达变化趋势明显。结论小鼠休眠胚胎经程序化冷冻后会导致一系列基因调控变化,并可能影响多条信号通路的协同变化。     

冻融后小鼠休眠胚胎超微结构的变化

目的从亚细胞超微结构的角度揭示其抗冻能力优于正常孵化胚胎的原因。方法利用透射电子显微镜观察小鼠休眠胚胎与正常孵化期胚胎在细胞连接和各细胞器形态与分布上的差异,以及冻融培养后的变化,并进行相关比较分析。结果通过亚细胞结构对比分析发现:冷冻前小鼠休眠胚胎为紧缩状,处于能量代谢较低的"基态",通过冻融后培养,细胞器结构恢复与正常孵化胚胎冷冻前相似;而正常孵化胚胎经过冻融后,线粒体数量减少,细胞核松散,异染色质增多。结论小鼠休眠胚胎与正常孵化胚胎冻融后相比,其细胞状态更有利于物质储存及能量代谢,表明小鼠休眠胚胎从亚细胞超微结构的角度比其正常孵化胚胎更具抗冻性。     

IGF-1对高糖诱导的小鼠早期胚胎凋亡的抑制作用

目的探讨胰岛素样生长因子1(IGF-1)对体外培养小鼠囊胚细胞凋亡的抑制作用。方法获取妊娠3.5d小鼠囊胚,分别移入3个培养皿中,分别为A、B、C三组:A组(基础培养液);B组(基础培养液+30mmol/L的葡萄糖溶液);C组(基础培养液+30mmol/L的葡萄糖溶液+100ng/ml的人重组IGF-1)。连续培养72h后,采用免疫组化S-P法检测各组囊胚细胞中Bax和Fas的表达,利用计算机图像分析技术测量各组囊胚细胞中Bax和Fas蛋白表达的平均光密度和平均阳性面积。结果B组囊胚细胞中Bax和Fas的表达明显高于A组和C组(P0.05)结论IGF-1对高糖诱导的小鼠着床前早期胚胎凋亡起了抑制作用。     

牛体内囊胚经体外共培养诱导子宫内膜上皮细胞整合素αv,β3基因差异的表达

目的利用牛体内胚胎与其子宫内膜上皮细胞体外共培养的方式,探究共培养前、后子宫内膜上皮细胞中整合素αv,β3基因差异表达的变化,为今后建立快捷有效的牛子宫容受态预判方法提供参考。方法将体内冲出的牛囊胚与原代培养并传代纯化至第5代的牛子宫内膜上皮细胞进行24 h体外共培养,利用RT-PCR技术对共培养前、后的子宫内膜上皮细胞进行αv,β3基因的表达检测。结果 RT-PCR检测结果显示,共培养前、后均有整合素αv,β3的表达;共培养I组(囊胚组),其共培养后诱导整合素αv,β3基因的表达与未共培养对照组二者之间差异无显著性(P0.05);共培养II组(孵化囊胚组),其共培养后整合素αv,β3基因的表达显著高于对照组和共培养I组(P0.05)。结论牛体内孵化囊胚经体外共培养诱导牛子宫内膜上皮细胞表达整合素αv,β3的效果,明显优于早期囊胚;整合素αv,β3基因具有作为牛子宫容受态体外检测标志的潜力。     

自制载体冷冻小鼠原核期胚胎效果分析

目的探讨自制冷冻载体冷冻保存昆明小鼠体内原核期胚胎的可行性。方法首先,比较了两种流行的商业化载体:开放式拉长麦管(open pulled straw,OPS)和冷冻帽(cryotop)开展小鼠原核胚玻璃化冷冻保存效果。其次,以cryotop为对照,利用自制简易载体(cryotip)开展小鼠原核期胚胎的玻璃化冷冻保存。之后,利用ANOVA对各组胚胎在复苏后的体外培养卵裂率、囊胚率进行统计分析。结果 OPS和cryotop两组之间,胚胎在玻璃化冷冻/复苏后发育的2-细胞率、4-细胞率和囊胚率差异均无显著性(P0.05),但cryotop冷冻效果更接近对照组;cryotip玻璃化冷冻载体与cryotop相比,胚胎复苏后各组差异均无显著性(P0.05),数值上除了2-细胞发育率外,cryotip其他几项结果都稍微高于cryotop组。结论 OPS,cryotop,cryotip冷冻保存昆明小鼠体内原核期胚胎均是可行的;cryotop在冷冻效果上要优于OPS,笔者自制的cryotip因其成本低,制作简单,操作安全可靠,在实验中替代昂贵的商业化载体OPS和cryotop是可行的。     

不同温度条件下小鼠囊胚OPS法玻璃化冷冻保存技术的研究

本实验采用OPS法在不同温度条件下对小鼠囊胚实施冷冻保存,研究用EDFS和EFS溶液冷冻保存囊胚的效率和提供不同温度下筛选玻璃化溶液的依据,为家畜和人类胚胎的冷冻保存建立模型。25℃室温和37℃恒温台条件下OPS一步法冷冻保存小鼠囊胚,EFS40和EDFS40冷冻组扩张囊胚率(92.31%,92.30%)与对照(97.26%)均无显著差异(P>0.05),但EDFS40孵化囊胚率(59.62%)显著低于对照组(83.56%)(P<0.05);二步法冷冻结果显示,采用EDFS30和EFS40均能高效保存小鼠囊胚,解冻后扩张囊胚率(95.69%和95.05%)和孵化率(80.48%和78.95%)与对照无显著差异(P>0.05)。当改为25℃室温不使用恒温台条件下,一步法冷冻的胚胎解冻后,仅EDFS40冷冻组扩张囊胚率和孵化囊胚率(85.96%和75.44%)与对照(96.05%和82.89%)无显著性差异(P>0.05);实施二步法冷冻的胚胎,解冻后EDFS30,EDFS40和EFS40组均获得理想效果,扩张囊胚率(92.03%-95.31%)及孵化囊胚率(67.19%-76.76%)与对照均无显著差异(96.05%和82.89%)(P>0.05)。据体外发育结果,选择最佳冷冻组胚胎移植给假孕4d的受体母鼠,其妊娠率和产仔率(90.90%和37.33%)与新鲜胚对照组(91.67%和42.33%)无显著差异(P>0.05)。结果证实,EDFS30、EDFS40和EFS40三种冷冻液在不同的温度条件和采用不同冷冻程序,均能成功保存小鼠囊胚。     

不同冷冻保护剂对早期卵裂期小鼠胚胎冷冻后成活率和发育的影响

为了评价利用不同冷冻保护剂冷冻早期卵裂期胚胎的效果,用小鼠为实验动物,采用慢速冷冻、快速融解的冷冻技术,比较丙二醇、二甲基亚砜和甘油作冷冻保护剂对小鼠2-细胞、4-细胞、8-细胞胚胎冷冻后胚胎存活率和囊胚形成率的影响。发现以丙二醇和蔗糖为冷冻保护剂冷冻4-细胞、8-细胞胚胎,解冻后胚胎成活率和囊胚形成率显著高于以二甲基亚砜或甘油为冷冻保护剂。结果表明,丙二醇是一种冷冻早期卵裂期小鼠胚胎有效的冷冻保护剂。     

应用乙二醇冷冻小鼠胚胎：优化和简化程序的探索

提高解冻胚胎的发育能力和简化冷冻解冻程序是胚胎冷冻研究的两大永恒的主题。尽管乙二醇（EG）广泛用于家畜胚胎冷冻,但很少用于冷冻小鼠和人胚胎。为数很少的以EG慢冻小鼠或人胚胎的研究均采用较为复杂的人胚冷冻程序,未见简化程序和用EG冷冻小鼠桑椹胚的报道。采用简单的牛胚胎冷冻程序研究了发育时期、EG浓度、平衡方法、添加蔗糖以及解冻后脱除EG等对小鼠胚胎冻后发育能力的影响。结果显示：（1）致密晚期桑椹胚冻后体外培养囊胚发育率（81.92%±2.24%）和孵出率（68.56％±2.43%）显著（P＜0.05)高于4-细胞、8-细胞胚胎和致密早期桑椹胚胎;（2）1.8mol/L EG冷冻小鼠致密晚期桑椹胚的囊胚发育和孵出率显著高于其它浓度;（3）在EG中平衡10min的冻后囊胚发育显著好于平衡5、20或30min;（4）两步平衡冷冻胚胎的囊胚发育率和孵出率显著高于一步平衡;（5）用EG冷冻小鼠胚胎无需添加蔗糖;（6）解冻后可不脱除EG;（7）冻后发育的早期囊胚和囊胚细胞数明显少于体内发育胚胎。因此,用EG冷冻小鼠胚胎的最佳方案为：致密晚期桑椹胚用1.8mol/L EG不添加蔗糖、两步平衡15min、以简单的牛胚胎冷冻程序冷冻解冻、解冻后不脱除EG直接培养或移植。     

小鼠休眠胚胎与正常胚胎冻融后体内外发育潜力的比较

目的检验小鼠休眠胚胎冻融后的质量及体内外发育潜力,为胚胎休眠技术的生产应用提供必要的参考。方法采用常规冷冻方法将正常孵化期胚胎和休眠胚胎进行冷冻,之后分别进行体外复苏培养实验和胚胎移植实验。随后利用双重荧光染色的方法分别对冻融前后的小鼠休眠胚胎与正常孵化期胚胎进行细胞计数,观察两种胚胎冻融前后的质量变化。结果休眠胚胎的冷冻解冻回收率、发育率均极显著高于孵化期胚胎(72.1%vs 50.2%,P<0.01;94.2%vs 73.9%,P<0.01)。休眠胚胎的移植妊娠率显著高于孵化期胚胎(40.8%vs 30.1%,P<0.05)。休眠胚胎的内细胞团细胞数显著高于孵化期胚胎(27.83 vs 19.53,P<0.05),滋养层细胞数差异不显著。冻融培养后休眠胚胎的内细胞团数,滋养层细胞数均显著高于孵化期胚胎(25.18 vs 14.68,P<0.05;114.09 vs 73.88,P<0.05)。结论小鼠休眠胚胎冻融后胚胎质量及体内外发育潜力均优于小鼠正常孵化期胚胎。     

蛋白激酶Cα在小鼠孤雌及四倍体胚胎早期发育过程中的分布和作用

为了观察蛋白激酶Cα(protein kinase Cα,PKCα在昆明白小鼠受精卵、孤雌激活和四倍体胚胎早期发育阶段的亚细胞定位和致密化进程中的表达变化,本实验利用免疫荧光化学染色与激光共聚焦显微镜观察相结合的方法,对受精卵、孤雌激活和四倍体胚胎早期发育阶段PKCα的表达进行了定位观察,并利用Western blot对三组胚胎致密化进程中PKCα的表达进行定量分析.结果显示,PKCα在上述三组胚胎发育的2-细胞期至囊胚期均有表达,虽然不同胚胎PKCα的分布在同一发育阶段存在差异,却表现出在各胚胎期主要分布于卵裂球核染色质内,以及在胚胎致密化开始,PKCα在卵裂球连接处发生重新分布的共同特点.此外,三组胚胎PKCα在致密化进程中的表达呈升高趋势,即致密化后的表达高于敛密化前.结果表明,PKCct对胚胎致密化的调节具有重要作用,其在8-细胞/4-细胞期的重新分布是胚胎进入桑椹胚期的必然事件,是胚胎致密化的前提,同时伴随蛋白表达增多.此外,PKCα在囊胚期发生了植入前的第二次重新分布.PKCα在三组胚胎各发育阶段表达情况各不相同,它对小鼠胚胎发育的影响体现在整个早期发育阶段.PKCα在小鼠受精卵早期发育阶段的两次重新分布可能与在致密化开始时启动的细胞黏附事件存在某种必然联系.     

PGE2、PGF2α和Iloprost对小鼠2-细胞胚胎体外发育的影响

目的研究PGE2、PGF2。以及Hoprost（PGl2的稳定类似物）对小鼠2-细胞胚胎体外发育的影响。方法在含0．5％BSA的mCZB液中分别添加0、10^-4、10^-5和10^-6mol／L的PGE2,0、10^-4、10^-5和10^-6mol／L PGF2α以及0、1×10^-6、2×10^-6和4×10^-6mol/L Iloprost,观察小鼠2-细胞胚胎的体外发育,同时利用H33342染色进行囊胚和孵化囊胚的细胞核计数。结果添加PGE2、PGF2α以及Iloprost的各处理组2-细胞胚胎体外培养的囊胚率和孵化率均显著低于对照组（P〈0．05）,但各处理组与对照组之间在囊胚或孵化胚胎的细胞数上差异不显著（P〉0．05）。结论培养液中添加这三种前列腺素均不利于小鼠2-细胞胚胎的体外发育,但不影响囊胚或孵化胚胎的细胞数。     

共培养对小鼠囊胚质量及其表观遗传修饰的影响

本研究探讨了共培养对小鼠囊胚质量及其表观遗传修饰的影响。将小鼠的受精卵体外随机分别置于含颗粒细胞(试验组I)、输卵管上皮细胞(试验组Ⅱ)、输卵管组织块(试验组Ⅲ)的KSOM培养液中作为试验组进行共培养,同时设立对照组A(体外培养,仅含KSOM)和对照组B(体内培养)。比较各组受精卵的卵裂率和囊胚发育率;并应用碘化丙啶和Hoechest333258对囊胚进行染色,利用ICM/TE值评价各组胚胎体外发育的质量;同时将囊胚进行免疫荧光染色,观察其基因组甲基化和组蛋白乙酰化的水平。结果表明,与对照组A相比,试验组的卵裂率和囊胚发育率均有显著提高(P<0.05);同时其囊胚细胞数目及内细胞团细胞数与滋养层细胞数比值(ICM/TE)值均显著高于对照组A(P<0.05);各试验组囊胚基因组甲基化水平与对照组A差异不显著(P>0.05),但各体外培养组均与对照组B差异显著(P<0.05);试验组组蛋白乙酰化水平与对照组A、B差异均不显著(P>0.05)。共培养能够有效促进小鼠胚胎的体外发育,提高囊胚的发育质量,但是仍不能克服由体外培养造成的基因组甲基化异常。     

猪胚胎常规冷冻及其去脂冷冻研究

1.引言 自1972年小鼠胚胎冷冻首次取得成功以来,胚胎的冷冻技术已逐渐应用到很多种哺乳动物。现在包括牛、绵羊在内的多种家畜物种的胚胎冷冻保存已经成为一种常规的技术。然而利用冷冻保存的胚胎生产出活的仔猪仍然处在摸索阶段,并且仅仅是孵出囊胚的冷冻保存获得成功。这种局限性以及胚胎移植后很低的存活率严重阻碍了猪胚胎冷冻保存技术的发展。     

两种冷冻保护剂对小鼠2-细胞胚冷冻效果的比较

乙二醇（ETG）和1,2-丙二醇（PROH）具有高细胞渗透性和低毒性特点,常被用于人及多种哺乳动物早期胚胎冷冻保存。为了比较ETG和PROH对小鼠2-细胞胚的冷冻保护效果,本试验分别采用这两种冷冻保护剂,对小鼠2-细胞胚进行冷冻保存,并采用冻后体外培养和囊胚移植进行冷冻效果检测。结果表明,PROH组胚胎解冻后胚胎存活率与ETG组无显著差异,但PROH组4-细胞胚发育率和囊胚发育率显著高于ETG组（82．7％vs．64．6％,61．2％vs．29．1％,P〈0．01）。囊胚移植结果表明,2-细胞胚胎冻存后能够发育为正常的后代,PROH组和ETG组的囊胚移植后妊娠产仔率无统计学差异（P〉0．05）,但均显著低于对照组（P〈0．05）。为了分析两组胚胎冻存后损伤情况,埘解冻后的胚胎细胞微丝进行检测,结果显示ETG组微丝受损的胚胎数高于PROH组。本研究结果证明采用PROH作为冷冻保护剂冷冻保存小鼠2-细胞胚的冻存效果优于ETG[动物学报54（6）：1098—1105,2008]。     

CD63/ME491在植入前小鼠胚胎及延迟着床小鼠子宫的表达

目的 研究肿瘤转移抑制因子CD63/ME491 mRNA和蛋白在植入前小鼠胚胎及延迟着床小鼠子宫中的表达规律,探讨其在胚胎着床过程中的作用以及雌激素对其表达的调节.方法 应用RT-PCR、免疫荧光、免疫组化技术观察CD63/ME491 mRNA和蛋白的表达规律.结果 在植入前小鼠胚胎中均有CD63/ME491 mRNA及其蛋白表达.CD63/ME491 mRNA在桑葚胚及囊胚期表达较丰富,CD63/ME491蛋白表达于各期胚胎细胞的胞膜和胞浆;CD63/ME491 mRNA在延迟着床小鼠子宫均有表达,但从D5到D8呈下降趋势,雌二醇(E2)激活后mRNA的表达显著上升(P<0.05).CD63/ME491蛋白在延迟着床D5弱表达于上皮下基质细胞,D6～8表达不明显,E2激活后该蛋白明显表达于上皮下基质细胞的胞膜和胞浆.结论 1. CD63/ME491在植入前小鼠胚胎中呈动态表达,提示它参与了胚胎的发育过程;2. CD63/ME491在小鼠子宫中的表达可能受雌激素调节.     

牛血清白蛋白对小鼠原核期胚胎玻璃化冷冻的影响

以小鼠原核期胚胎为对象,以胚胎的存活率、卵裂率、囊胚率以及囊胚细胞数作为检测指标,在M2液的基础上添加8种浓度(0,2,4,8,16,32,64,96mg/mL)牛血清白蛋白(BSA)配置防冻液,探讨防冻液和玻璃化冷冻后对胚胎发育的影响。BSA防冻液对胚胎发育影响的实验结果表明,8个浓度组间以及与对照组间胚胎的卵裂率、囊胚率以及囊胚细胞数无显著差异(P>0.05),说明在防冻液中加入一定浓度的BSA对小鼠胚胎无毒性作用。防冻液经玻璃化冷冻后对胚胎发育影响的实验表明,8个浓度组间冷冻胚胎复苏后的存活率、卵裂率、囊胚率及囊胚细胞数无显著差异(P>0.05)。表明BSA在这种防冻液中没有明显的保护作用。从经济、实用、生物安全角度考虑,不支持在玻璃化防冻液中添加BSA。     

正常和冷冻保存复苏后的卵裂期胚胎的体外囊胚形成能力的观察

由囊胚中获得ICM是胚胎干细胞研究的基础,本文对体外授精/胚胎移植（IVF-ET）中移植后剩余的胚胎和冷冻复苏后胚胎的囊胚形成能力进行了观察。结果表明：冷冻复苏胚胎,培养3d移植后剩余胚胎,连续培养4-6d的胚胎及培养6d后的剩余胚胎的囊胚形成率分别为11.8%(6/51),28.3%(36/127),42.0%(74/176)和9.5%(2/21)。各组结果均显示卵裂细胞的正常卵裂时相的发育状态直接决定其囊胚形成能力。认为由剩余胚胎和冷冻保存复苏后的胚胎中获得囊胚是可行的。     

四种冷冻保护剂对小鼠2-细胞胚胎渗透性和毒性作用的比较

作为胚胎冷冻保存的基础性研究,冷冻保护剂的渗透性和毒性研究非常重要.本试验选用1,2-丙二醇、甘油、乙二醇和二甲基亚砜4种常用冷冻保护剂,对小鼠2-细胞胚胎进行渗透性和毒性研究.结果显示:1.5 mol/L的1,2-丙二醇、乙二醇和二甲基亚砜冷冻保护剂对2-细胞胚胎的渗透性显著高于甘油保护剂;4种冷冻保护剂对细胞膜的完整性没有影响;1.5 mol/L的乙二醇、1,2-丙二醇和甘油保护剂处理后的2-细胞胚胎的囊胚发育率和孵化率与对照组胚胎比较差异不显著(P>0.05),但显著高于二甲基亚砜处理后的2-细胞囊胚发育率和孵化率(P<0.01).结果表明:在4种冷冻保护剂中,乙二醇和1,2-丙二醇适合于小鼠2-细胞胚胎冷冻保存     

小鼠孤雌激活来源囊胚线粒体基因表达

为了探索孤雌胚胎和正常体外受精胚胎线粒体基因表达的差异,本研究用ICR小鼠孤雌和正常受精胚胎为研究对象。孤雌和正常受精的胚胎分别发育至2-细胞期和囊胚期的比率,用q PCR方法检测囊胚线粒体基因Cox2、tom40、tim23和cytochrome C,以及多能性囊胚质量相关基因Oct4、Sox2和nanog的表达水平。结果发现孤雌激活不影响小鼠卵母细胞的卵裂(95%vs 97.6%,p0.05),但影响胚胎发育到囊胚(39.4%vs 75%,p0.05),孤雌囊胚细胞线粒体Cyto C和Cox2显著高于体外受精组(p0.05);正常受精囊胚多能性基因Oct4和nanog表达水平显著高于孤雌组(p0.05),但Sox2表达水平显著低于孤雌组(p0.05)。本研究表明孤雌激活可影响胚胎线粒体和细胞基因表达水平。