三疣梭子蟹Na+/H+-exchanger基因克隆鉴定及在盐度胁迫下的表达分析

为研究Na+/H+-exchanger基因在三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）盐度胁迫过程中的功能作用,克隆了三疣梭子蟹Na+/H+-exchanger基因并进行表达分析。结果显示,Na+/H+-exchanger基因（GenBank：KU519329）全长4233 bp,5和3非编码区（UTR）长分别为519和753 bp,开放阅读框（ORF）长2961 bp。编码986个氨基酸,预测蛋白质分子量和等电点分别为110.8 kD和7.42,具有信号肽和典型的Na+/H+-exchanger蛋白结构域,含12个跨膜螺旋;三疣梭子蟹Na+/H+-exchanger基因与普通滨蟹（Carcinus maenas）同源性最高,达到87.2%,系统进化分析也显示该序列与普通滨蟹聚为一支;表达分析显示,三疣梭子蟹Na+/H+-exchanger基因在鳃中表达量最高;在低盐（盐度5、10和20）胁迫过程中,Na+/H+-exchanger基因在0-12h上调表达明显,在24-168h间表达量呈下降趋势;在高盐（盐度50）胁迫初期（0-12h）,该基因表达量相对稳定,之后（24-168h）显著下调表达。研究表明低盐显著诱导Na+/H+-exchanger基因的高表达,推测三疣梭子蟹Na+/H+-exchanger基因在低盐环境下发挥重要的渗透调节功能。     

三疣梭子蟹Profilin基因全长cDNA的克隆与表达分析

三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）是我国沿海重要养殖品种之一,近年来养殖病害呈逐年上升趋势,制约了三疣梭子蟹养殖产业的健康可持续发展。克隆三疣梭子蟹免疫相关基因,研究免疫基因的功能和作用机制,可为三疣梭子蟹养殖病害的防治奠定基础。本研究从三疣梭子蟹血细胞全长cDNA文库中克隆了742 bp 的profilin基因全长cDNA。Profilin全长cDNA中开放阅读框长375 bp,编码125 aa。推导的三疣梭子蟹profilin理论等电点pI 5.87,氨基酸序列与冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）profilin同源性最高,序列一致性为42.9%。荧光定量RT-PCR分析结果显示在正常的三疣梭子蟹机体中,血细胞profilin表达水平最高,其次为肝胰脏;在致病菌副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）诱导后,血细胞中profilin表达量显著上升（P<0.01）,表明profilin可能参与了三疣梭子蟹的免疫防御反应,是一个免疫相关因子。     

恩诺沙星在三疣梭子蟹主要组织中的代谢动力学

应用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）研究了三疣梭子蟹（portunus trituberculatus）经口灌10 mg/kg恩诺沙星后体内的药代动力学规律。结果表明口灌给药后,三疣梭子蟹肝胰腺、肌肉和血淋巴组织中的恩诺沙星达峰速度快,肝胰腺和血淋巴在给药24h都有双峰现象出现。恩诺沙星在肝胰腺、肌肉、血淋巴中的Cmax分别为11.235μg/g、0.850μg/g和0.858μg/g,Vd/F为7.954 L/kg、10.367 L/kg和0.345 L/kg。t1/2β分别为283.361 h、47.869 h和17.681 h,AUC分别为245.618μg/g.h、24.753μg/g.h和20.111μg/g.h。给药后5 min在肝胰腺中即可检测到恩诺沙星的代谢产物环丙沙星,而肌肉和血淋巴在给药后2 h才能检测到,其含量均处于较低水平。用3P97软件对各组织中的药时数据进行房室模型拟合,结果显示：三疣梭子蟹口灌给药后,恩诺沙星在血淋巴、肌肉和肝胰腺中的代谢过程均符合一级吸收二室开放模型,而环丙沙星不能用房室模型来描述。     

三疣梭子蟹aqp2基因克隆及其在蜕皮中的功能

为研究水通道蛋白AQP的生理功能, 克隆了三疣梭子蟹 (Portunus trituberculatus) 水通道蛋白2基因(ptaqp2), 该基因全长4126 bp, 编码522个氨基酸, 具有水通道蛋白基因家族的保守结构域及功能结构域; 进化树聚类分析结果显示, ptaqp2基因属于水通道蛋白基因家族C-AQP类基因; 组织表达结果显示, ptaqp2呈泛组织表达特征, 在眼柄中的表达量最高, 在肠和肌肉中也有较高表达, 在血淋巴中的表达最低; ptaqp2基因在不同蜕皮时期呈显著差异表达(P<0.05), 且在蜕皮前期表达量最高; 在蜕皮激素(Molting Hormone简称MH)刺激下, 该基因在肌肉、肠及胃中均呈不同程度的上调表达趋势; 通过RNAi技术在蜕皮前期敲降ptaqp2的表达, 发现能够显著推迟蜕皮过程。研究初步证明了ptaqp2基因在三疣梭子蟹蜕皮中发挥重要作用。     

三疣梭子蟹胚胎期中枢神经系统的发生和发育

应用组织学方法研究三疣梭子蟹胚胎期中枢神经系统的发生和发育,光学显微镜下镜检切片,在第二期卵内无节幼体阶段开始观察到脑;第二期卵内状幼体阶段,前脑由视神经层、侧原脑和中央原脑组成,与位于食道两侧的中脑和后脑形成完整的脑。三疣梭子蟹胚胎期腹神经链由1对大颚、2对小颚和2对颚足所对应的神经节以及腹部神经链组成。光镜下大颚神经节可于第二期卵内无节幼体阶段观察到,2对小颚和2对颚足神经节则在第二期卵内状幼体阶段观察到;腹部神经链则在第三期卵内状幼体阶段观察到。三疣梭子蟹胚胎期中枢神经系统由脑和腹神经链组成,脑由前脑、中脑和后脑组成,脑位于背部,通过2条围食道神经与腹神经链相连。中枢神经系统的不同部分的形成在胚胎发育过程中具有阶段性差异。     

三疣梭子蟹nm23基因克隆及在卵巢发育中的表达分析

Nm23基因编码的核苷二磷酸激酶（NDPK）参与调控生物体的多项生理功能;包括生长、发育、分化和肿瘤转移等。根据三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）转录组数据库中的nm23同源序列;利用cDNA末端快速扩增技术（RACE）首次克隆获得了三疣梭子蟹nm23基因的全长cDNA序列（GenBank登录号:KP027331）。该序列全长777 bp;编码一个151个氨基酸的蛋白;该蛋白包含一个典型的核苷二磷酸激酶（NDPK）区域;具有NDPK活性位点和多肽结合位点。推导的氨基酸序列与已知甲壳动物的nm23一致性达到90%以上;与脊椎动物第一类nm23的一致性也达到70%以上。系统进化树分析发现第一类nm23与第二类nm23分别聚为一支;甲壳动物nm23属于第一类;且与nm23-1和nm23-2亲缘关系较近。采用实时荧光定量PCR（qPCR）技术分析了三疣梭子蟹nm23的组织差异表达及其在卵巢发育过程中的表达水平变化;结果表明nm23在三疣梭子蟹各组织内均有表达;其表达水平在眼柄、肌肉和Y器中最高;卵巢和肝胰腺次之。在三疣梭子蟹卵巢发育过程中;卵巢中nm23的表达水平在Ⅰ期最高;之后随着卵巢发育的进行;其表达水平逐渐下降;并在成熟期降至最低;这表明nm23可能参与调控三疣梭子蟹的卵巢发育。     

三疣梭子蟹PtCrustin2成熟肽在毕赤酵母中的表达

Crustin主要分布于甲壳动物中,是一种富含半胱氨酸的小分子抗菌肽,在甲壳动物的先天免疫系统中发挥重要作用。根据crustin的一级结构特征可以将其分为不同的类型,本文以三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)的PtCrustin2成熟肽为研究对象,通过构建毕赤酵母表达系统,以期实现PtCrustin2成熟肽在毕赤酵母中的重组DNA表达。首先,从其鳃中提取总RNA,通过RT-PCR得到编码PtCrustin2成熟肽的cDNA(m Pt Crustin2),并在其5'和3'端分别引入EcoRⅠ和NotⅠ限制性内切酶位点;然后将此片段与表达载体p PIC9K连接,构建重组表达载体pPIC9K-m Pt Crustin2;电转入毕赤酵母GS115细胞后,以不同浓度的G418筛选到高拷贝酵母转化子,经0.5%甲醇诱导表达和固化金属离子亲和层析(IMAC)分离,获得了纯化的重组体mPt Crustin2,Tricine-SDS-PAGE分析显示其分子量约10.5 k Da;抑菌实验证明重组体mPtCrustin2对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌具有一定的抑菌效果。本研究首次实现了三疣梭子蟹Pt Crustin2成熟肽在毕赤酵母中的重组DNA表达,为进一步研究提供参考。     

不同病原菌刺激下三疣梭子蟹主要组织LGBP基因的时序表达

脂多糖-β-1,3-葡聚糖结合蛋白（lipopolysaccharide-β-1,3-glucan binding protein,LGBP）作为一种模式识别受体能够识别革兰氏阴性菌和真菌的细胞壁多糖成分脂多糖和β-1,3-葡聚糖,在甲壳动物的免疫系统中占有重要地位,为了解LGBP在蟹类动物抗菌免疫应答中的作用,采用SYBR Green I实时荧光定量PCR方法,对分别经溶藻弧菌,酵母菌,溶-酵混合菌、金黄色葡萄球菌刺激6 h、12 h、24 h、48 h的三疣梭子蟹血细胞、肝胰腺、肌肉3种组织LGBP基因的相对表达量进行了检测。结果显示,LGBP基因在3种组织中的时序表达量总体趋势基本一致,呈现＂上升-下降-再上升-下降＂的趋势,各实验组在实验6 h时表达量均达到了峰值;不同病原菌刺激下LGBP基因在梭子蟹肝胰腺和血细胞中的表达量明显高于肌肉,且溶-酵混合菌刺激组织LGBP的表达量最高,酵母菌和溶藻弧菌刺激组次之,金黄色葡萄球菌组最低,说明LGBP主要参与蟹类抵抗革兰氏阴性菌和真菌侵入的免疫防御反应,但对革兰氏阳性菌也有一定的作用。     

三疣梭子蟹UHRF1基因在胚胎、幼体和性腺发育过程中的表达分析

为探讨泛素样含PHD和环指域蛋白1(UHRF1)基因在三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)发育过程中的作用, 实验采用SMART RACE方法, 克隆了三疣梭子蟹UHRF1(PtUHRF1)基因。该基因cDNA全长为2849 bp, 开放阅读框(ORF)为2298 bp, 预测其编码1个含有765个氨基酸的蛋白质。结构域分析显示, 该蛋白质包含UBL、PHD、TTD、SRA、RING finger 5个功能结构域。同源分析表明, 三疣梭子蟹PtUHRF1的氨基酸序列与其他物种有较高的同源性。qRT-PCR结果显示, PtUHRF1基因在三疣梭子蟹所有组织中均有表达, 但在精巢中表达量显著高于其他组织。该基因在胚胎和幼体发育不同时期表达差异显著, 在受精卵中的表达量最高, 并显著高于胚胎发育其他时期, 是多细胞时期表达量的2.5倍。PtUHRF1基因在性腺发育不同时期表达存在显著差异, 在卵巢II期表达量达到峰值, 之后逐渐下降; 在精巢Ⅰ期的表达量最高, 随着精巢发育逐渐下降。实验结果表明, PtUHRF1参与了三疣梭子蟹胚胎、幼体和性腺发育调控, 为进一步深入研究该基因在三疣梭子蟹及甲壳动物生长发育中的作用提供参考。