甲烷单加氧酶的催化性能和活性中心结构

甲烷单加氧酶是甲烷利用细菌代谢甲烷过程中的重要酶系,它能够催化烷烃羟基化和烯烃环氧化反应;还能催化降解氯代烃类,可用于环境中氯代烃类化合物污染的治理,是具有广泛应用前景的生物催化剂．甲烷单加氧酶是含有μ－氧桥双核铁催化活性中心的蛋白,它的研究对分子氧的活化、化学催化剂的设计具有重要意义．文章介绍了甲烷单加氧酶催化性能和机理的最新研究进展．     

甲基单胞菌Methylomonas sp.GYJ3中甲烷单加氧酶羟基化酶组分的纯化和性质

Methylomonassp．GYJ3菌株中经DEAE-SepharoseCL-6B阴离子交换层析和SephacrylS300凝胶层析分离纯化出甲烷加氧酶羟基化酶组分．经HPLC分析,纯度大于90％,分子量为240kD,纯化倍数为3．9,比活为225nmol环氧丙烷每分钟毫克蛋白．SDS-PAGE表明,羟基化酶由三个亚基组成,亚基分子量为56、43、27kD．ICPAES测定羟基化酶的Fe含量为2.1molFe每摩尔蛋白．HPLC法用于甲烷单加氧酶羟基化酶组分的纯化,纯化的羟基化酶组分比活为541nmol（环氧丙烷）每分钟毫克蛋白,是两步LC法纯化的羟基化酶的两倍,Fe含量为3．78molFe每摩尔蛋白．催化性质研究表明羟基化酶能够被化学还原剂还原为还原态羟基化酶,还原态的羟基化酶单独存在时表现出MMO活性,说明它是MMO活性中心,天然态的羟基化酶单独存在时无MMO活性,加入粗酶液中MMO活性明显增加,说明GYJ3菌中MMO是一个复合酶系．     

甲烷氧化菌Methylomonas sp.GYJ3中甲烷单加氧酶基因与16S rRNA序列分析

甲烷氧化细菌中的关键酶系甲烷单加氧酶是一个含双核铁的多组份氧化酶,常温、常压下能够催化甲烷转化为甲醇。对甲烷氧化细菌Methylomonas sp.GYJ3中溶解性甲烷单加氧酶基因和16SrDNA进行了测序与分析。利用已知相关基因数据库信息,设计了PCR引物和测序引物,获得了满意的测序结果。全长的溶解性甲烷单加氧酶基因为5690bp,部分16S rDNA的序列长度为1280bp。与已发表的甲烷氧化细菌中甲烷单加氧酶进行了比较,结果表明MMOX组份中氨基酸序列的同一性为78%到99%,基因序列的同一性为71%到97%,6个组份中orfY片段的同一性相对较低。MMOX氨基酸序列的多序列联配表明,MMOX序列具有高度保守性,特别是在双核铁中心区域。16S rDNA进化分析显示Methylomonas sp.GYJ3与γ蛋白细菌是相关联的,基于MMOX氨基酸序列的进化分析证明,与Methylomonas sp.GYJ3最近似的菌株是Ⅰ型甲烷氧化细菌Methylomonas sp.KSWⅢ。综合分析表明,菌株GYJ3属于Ⅰ型甲烷氧化细菌Methylomonas sp.属。这个结果为Ⅰ型甲烷氧化细菌也能表达溶解性甲烷单加氧酶提供了新的证据。羟基化酶的理论等电点是6.28,理论分子量为248874.41Da。     

甲烷氧化菌及甲烷单加氧酶的研究进展

甲烷氧化菌是以甲烷作为唯一碳源和能源进行同化和异化代谢的微生物,其关键酶之一是甲烷单加氧酶(MMOs),可以在氧气的作用下催化甲烷等低碳烷烃或烯烃羟基化或环氧化,甲烷氧化菌在自然界碳循环和工业生物技术中具有重要的应用价值.因此,近20年来对于甲烷氧化菌和MMOs的研究一直倍受生物学家的关注.以下从现代生物技术的角度,对近年来国内外在甲烷氧化菌的分类与分布,MMOs的结构与功能、甲烷氧化菌与MMOs的基因工程等方面取得的研究成果进行了总结,全面综述了甲烷氧化菌及MMOs的应用基础研究现状,并对其今后的研究和应用方向提出了展望.     

甲烷氧化细菌Methylosinus trichosporium 3011甲醇累积条件的研究

本文考察了甲烷氧化细菌Methylosi nus trichosporium 3011的生理特性及反应条件对甲烷单加氧酶和甲醇累积的影响。M.3011菌株在4℃保存30～40天内,菌株的细胞生长量和甲烷单加氧酶活性均不受影响。在生长对数期收获细胞,其甲烷单加氧酶活力最高可达125nmol甲醇/mg(细胞干重)·min。在M.3011菌株的生长对数期后期收集细胞,将反应菌悬液浓度控制在0.15—0.3mg(细胞干重/ml,pH为6.7,反应温度为35℃,甲醇累积量可达3.1μmol甲醇/mg(细胞干重)·h。反应液的磷酸缓冲液的最适浓度为60mmol/L。     

丙烯酶催化氧化产生环氧丙烷的研究 I.甲烷氧化菌的筛选及其特性

从甘肃玉门油田土样、油样和水样中分别筛选到具有低碳烃催化氧化活性的菌种。以甲醇为碳源培养的菌体没有丙烯酶催化氧化为环氧丙烷的活力。只有以甲烷作为唯一碳源、能源培养发酵的菌体才有高专一性的酶催化氧化活性,并对筛选到的一株具有较高活性的菌株从形态、营养和生长特征等方面进行了研究,经初步鉴定表明为甲烷氧化菌甲基单胞菌属(Methylomonas sp,)。     

甲烷氧化菌素的产生和铜捕获作用

甲烷氧化菌素(mb)是由甲烷氧化菌产生的与铜捕获和吸收有关的生物螯合剂。采用NMS/CAS-Cu劈半平板法检测发现甲基弯菌 Methylosinus trichosporium IMV3011在以甲烷和甲醇为碳源时均具有向外界分泌mb的能力。甲基弯菌 Methylosinus trichosporium IMV3011在限铜胁迫下能够在培养介质中积累mb,甲醇为碳源时mb的积累量明显高于甲烷为碳源时mb的积累量,推测mb的合成与细胞中NADH含量有关。mb的专一性研究发现从甲基弯菌 Methylosinus trichosporium IMV3011发酵上清液中分离到的mb能够提高其它3种甲烷氧化菌由无铜培养基向含铜培养基转移时的pMMO活性的表达,并明显缩短它们由无铜培养基转移到含铜培养基时生长的延滞期,提高生长速度。表明其它3种甲烷氧化菌同样能够吸收来自于甲基弯菌Methylosinus trichosporium IMV3011的mb捕获的铜。     

甲烷氧化细菌的一个新种

从沼气发酵装置中,分离出一株H型专性甲烷氧化细菌81Z菌株。它具有甲烷氧化细菌的一般典型性状。根据其极生单鞭毛和过氧化氢酶阴性的特征,该菌株明显地区别于已知的任何一种甲烷氧化细菌,被认为是一个新种并命名为沼气甲基弯菌(Methylosinus methanica)。本文还讨论了它在厌氧条件下的生命活动。     

一株Ⅱ型甲烷氧化菌中甲烷单加氧酶基因和16S rDNA的分析

[目的]利用分子生物学方法对-株甲烷氧化菌Methylosinus trichosporium IMV 3011中的16S rDNA和溶解性甲烷单加氧酶基因序列进行分析并探索其进化分类地位.[方法]利用基因数据库已有的基因序列信息,设计PCR扩增引物和基因测序引物,对溶解性甲烷单加氧酶基因和16s rDNA进行扩增和测序,并进行溶解性甲烷单加氧酶的6个基因和氨基酸序列与同类菌株的相应序列进行联配分析.[结果]获得了全长为5319 bp甲烷单加氧酶基因序列和长度为1290 bp的16S rDNA序列.该菌株与Methylosinus trichosporium OB3b中相对应基因的同一性是99.0%～82.7%,MMOX氨基酸序列的同一性为99.4%～81.8%,相似性为99.8%～89.2%.基于以上分析表明MMOX组分有很高的序列保守性,特别是在活性中心区域.[结论]菌株IMV3011属于甲基弯菌属,最近似的菌株是Methylosinus trichosporium OB3b.     

甲基单胞菌Methylomonas sp.GYJ3中甲烷单加氧酶羟基化酶组分…

从Ｍｅｔｈ ｙｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＧＹＪ３菌株中经ＤＮＥＡＥ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣｌ－６Ｂ阴离子交换层析和ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ３００凝胶层析分离出纯化出甲烷加氧酶羟基酶组分,经ＨＰＬＣ分析,纯度大于９０％,分子量为２４０ｋＤ,纯化们数为３．９,比活为２２５ｎｍｏｌ环氧丙烷每分钟毫克蛋白,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ表明,羟基化酶由三个亚基组成,亚基分子量为５６、４３、２７ｋＤ．ＩＣＰＡＥＳ测定羟基化酶的Ｆｅ     

甲烷单加氧酶的研究进展

甲烷氧化细菌在转化甲烷制造新型燃料、单细胞蛋白和新功能酶生产、污水处理等方面有着潜在的应用前景,因此,甲烷单加氧酶作为其代谢过程中重要的酶系也受到人们的广泛关注。我们简要综述了近年来对甲烷单加氧酶的性质、结构、催化机理等方面的研究,特别是对颗粒性甲皖单加氧酶的相关性质进行了详细的阐述。     

细菌脱色酶TpmD对三苯基甲烷类染料脱色的酶学特性研究

从嗜水气单胞菌DN322中分离纯化出能够对三苯基甲烷类染料结晶紫、碱性品红、灿烂绿及孔雀绿进行有效脱色的脱色酶,命名为TpmD。该酶的亚基分子量为29.4kDa,等电点为5.6。该酶催化上述4种三苯基甲烷类染料脱色反应的适合温度为40~60℃,适合pH范围为5.5~9.0。动力学参数测定结果显示TpmD对结晶紫、碱性品红、灿烂绿及孔雀绿的Km值分别为24.3、40.65、4.2、68.5μmol-1.L-1,Vmax值分别为19.6、74.1、82.8、115.6μmol.L-1.s-1。结晶紫为该酶的最适反应底物。TpmD催化的脱色反应依懒于NADH/NADPH及分子氧的存在,显示该酶属于NADH/NADPH依赖型的氧化酶类。这是国内外首次关于细菌中三苯基甲烷类染料脱色酶酶学性质的描述。     

颗粒状甲烷单加氧酶异源表达方法

由于甲烷氧化菌只能利用甲烷作为唯一的碳源和能源,存在生长缓慢、细胞密度低、培养困难等问题,限制了其工业应用。解决该问题的有效途径之一是在容易实现高密度培养的异源宿主菌中表达甲烷单加氧酶(Methane monooxygenase,MMO)。本实验室前期首次在一种红球菌中成功地表达了来自于甲烷氧化菌(Methylosinus trichosporium)OB3b的pMMO(颗粒状甲烷单加氧酶),但比酶活较原始菌低很多。本实验在该结果的基础上,通过选用不同的启动子和宿主细胞探索表达pMMO的可能性,结果得到了具有氧化甲烷活性的重组菌,但是产物检测到乙醇的生成,且该重组菌的pMMO活性不稳定,暗示pMMO的催化特性可能发生了变化。另外,很多重组菌检测到pMMO蛋白的表达,但没有催化活性,说明pMMO在宿主细胞中的正确组装是其功能表达的关键。     

好氧甲烷氧化菌生理生态特征及其在自然湿地中的群落多样性研究进展

甲烷氧化菌是一类可以利用甲烷作为唯一碳源和能源的细菌,在全球变化和整个生态系统碳循环过程中起着重要的作用。近年来,对甲烷氧化菌的生理生态特征及其在自然湿地中的群落多样性研究取得了较大进展。在分类方面,疣微菌门、NC10门及两个丝状菌属甲烷氧化菌的发现使其分类体系得到了进一步的完善;在单加氧酶方面,发现甲烷氧化菌可以利用pM MO和sM MO两种酶进行氧化甲烷的第一步反应,Ⅱ型甲烷氧化菌中pM MO2的发现证实甲烷氧化菌可以利用这种酶氧化低浓度的甲烷;在底物利用方面,已经发现了越来越多的兼性营养型甲烷氧化菌,证实它们可以利用的底物比之前认为的更广泛,其中包括乙酸等含有碳碳键的化合物;在生存环境方面,能在不同温度、酸度和盐度的环境中生存的甲烷氧化菌不断被分离出来。全球自然湿地甲烷氧化菌群落多样性的研究目前主要集中在北半球高纬度的酸性泥炭湿地,Ⅱ型甲烷氧化菌Methylocystis、Methylocella和Methylocapsa是这类湿地主要的甲烷氧化菌类群,尤其以Methylocystis类群最为广泛,而Ⅰ型甲烷氧化菌尤其是Methylobacter在北极寒冷湿地中占优势。随着高通量测序时代的到来和新的分离技术的发展,对甲烷氧化菌的现有认识将面临更多的挑战和发展。     

土壤大气甲烷氧化菌研究进展

土壤微生物催化是大气中痕量甲烷(约1.8ppmv)氧化的唯一生物途径。目前的研究表明好氧土壤中存在专性和选择性大气甲烷氧化菌2种类型:前者(USCα和USCγ)广泛分布于各种好氧旱地土壤,其甲烷氧化酶对低浓度甲烷亲和力极高,属真正的寡营养型,但至今尚未获得该种类的纯培养菌株。后者属于传统甲烷氧化菌Methylocystis/Methylosinus属,广泛分布于各种周期性排放高浓度甲烷的土壤环境中。该属大部分菌株含有亲和力不同的2套甲烷单加氧酶系统,其中的高亲和力甲烷单加氧酶使这些菌株可以在相当长的时间内(3个月)保持大气浓度甲烷氧化活性,但其生长和繁殖还需依赖于土壤内部阶段性产生的高浓度甲烷。本文详细阐述了2类大气甲烷氧化菌的发现历程及其可能的生存策略,最后系统梳理了几种关键的环境因子(土壤温度及湿度、土壤pH、植被、土地利用及氮输入)对大气甲烷氧化菌群落结构和甲烷氧化活性的影响,提出并展望了土壤大气甲烷氧化菌研究的重要方向。     

甲烷氧化菌吸附膜反应器中环氧丙烷的连续生物转化

以流化床作为固定化体系 ,在硅藻土颗粒表面构建了混合培养的甲烷氧化细菌的吸附膜。研究发现延迟期后固定化细胞的甲烷单加氧酶活性明显增加。流化床中 90 %以上的甲烷氧化细菌以吸附形式存在。吸附膜浓度为 3.3～3.7 mgdryweightcell gDS。通过批式反应考察了丙烯 甲烷共氧化过程合成环氧丙烷的可能性。研究了甲烷对丙烯环氧化以及丙烯对甲烷氧化细菌生长的影响。通过最佳配比的混合反应气体 (methane :35 % ;propene :20% ;oxygen :45 % )连续循环通入流化床反应器中抽提产物环氧丙烷 ,克服了产物抑制。该生物反应器最初产生环氧丙烷的日产量为 110～ 150μmol d ,连续操作25d ,未观察到环氧丙烷生产能力的明显减小.     

甲烷甲基单胞菌的一个新变种

对甲烷氧化细菌761M菌株做了进一步鉴定。结果表明,该菌株为甲烷甲基单胞菌的一个新变种,命名为甲烷甲基单胞菌成都变种(Methylomonas methanica vas.chengduensis)。     

一株可利用甲烷的克雷伯氏菌的分离及其在甲烷检测中的应用

从山西太原水稻田土壤中,分离得到一株能以甲烷为唯一碳源和能源生长的菌株C611。通过生理生化特征及16SrDNA序列分析,该菌株初步鉴定为克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)。采用响应面法优化了该菌株利用甲烷的培养条件,得到最佳培养条件为:温度24.4oC、接种量为6.7%、甲烷含量25%。以C611固定化细菌和溶氧响应仪为体系,采用电化学法研究了不同含量甲烷的响应时间以及溶氧变化与甲烷含量的关系。结果表明,菌株C611能利用甲烷,该反应体系对0～10%甲烷气体测定的响应时间小于100s;溶氧消耗量与通入甲烷气体含量呈线性关系,拟合系数(R2)为0.9994。以3%甲烷气体样品进行8次测量,测定平均值为3.09%,RSD为3.48%,相对误差为3%。表明该反应体系重现性良好,为该菌株进一步研究甲烷传感器奠定基础。     

粪肠球菌精氨酸脱亚胺酶酶学性质研究

经硫酸铵分级沉淀、Q-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析、SephadexG-75凝胶柱层析从NJ402自溶细胞超声破碎液中提纯得到精氨酸脱亚胺酶(ADI),纯化倍数为34.5,活力回收率为31.4%,经SDS-PAGE以及Native-PAGE测定结果表明,ADI亚基分子量约为46 kD,该酶非变性情况下的分子量约为190 kD左右,该酶为同四聚体结构.酶学,胜质研究结果表明:ADI催化最适温度和最适pH分别为50℃和6.5,在45℃以下和pH 5～8之间有很好的稳定性.ADI是L-型脱亚胺酶,具有严格的光学选择性,适当浓度的Mn2 、Mg2 、Co2 对ADI催化活力的促进作用较大,高浓度的Zn2 和Co2 对酶有一定程度的抑制作用,L-瓜氨酸对酶无抑制作用而L-鸟氨酸却表现出较强的抑制作用.ADI在最佳催化条件下作用于L-精氨酸的米氏常数为3.2686 mmol/L,最大反应速度为2.44 μmol/min.     

生物分子机器——甲烷单加氧酶的研究进展

甲烷氧化菌中的甲烷单加氧酶能够在生理条件下选择性地以甲烷和氧气为底物生成甲醇,麻省理工学院的Lippard教授称它为"神奇的生物分子机器"。本文重点对生物分子机器甲烷单加氧酶的结构、编码基因及调控机制、催化反应机理等进行了综述,此外也简要介绍了甲烷单加氧酶的产生菌甲烷氧化菌的研究历史及分类。生物分子机器甲烷单加氧酶可催化甲烷氧化成甲醇,不仅为甲醇的生产提供了一种新颖的生产方法,而且对生物分子机器的设计也有借鉴意义。