基于宏基因组学方法挖掘新型α-L-鼠李糖苷酶资源

α-L-鼠李糖苷酶是特异性切割末端含α-L-鼠李糖的天然化合物的一类糖苷水解酶,该酶在食品、医药、化学等行业都有广泛的应用。本研究旨在利用保守氨基酸基序结合PCR驱动的宏基因组学方法,从提取的健康人体粪便宏基因组DNA中获得新型细菌源α-L-鼠李糖苷酶基因。通过对CAZy数据库GH78家族中193条细菌源α-L-鼠李糖苷酶氨基酸序列进行多重序列比对,首次将α-L-鼠李糖苷酶家族分为3个亚家族,并确定了其中两个亚家族的两对保守氨基酸基序。基于保守基序氨基酸序列设计简并引物,PCR扩增保守基序间基因片段,对PCR产物克隆测序,结果获得12条α-L-鼠李糖苷酶基因片段,对其编码的氨基酸序列在Gen Bank数据库进行Blast序列比对,其中两条基因片段的氨基酸序列一致性仅为52%,一条为73%,其余9条在94%以上。根据Gen Bank数据库中序列一致性94%以上片段对应全长基因序列设计上下游引物,以人体粪便宏基因组DNA为模板,扩增获得3条α-L-鼠李糖苷酶全长基因,并将其克隆于载体p ET-28a,在E.coli BL21(DE3)内进行异源表达,目的蛋白多以包涵体形式存在于沉淀中,少量以可溶性形式存在于上清中。人体肠道细菌宏基因组为新型α-L-鼠李糖苷酶基因发现提供了潜在的基因资源库,基于保守氨基酸基序驱动的宏基因组学方法,从人体肠道以及环境宏基因组中直接获取新酶基因是可行的。     

微生物来源α-L-鼠李糖苷酶的分子和结构生物学研究进展

α-L-鼠李糖苷酶(α-L-rhamnosidase(EC 3.2.1.40))是一种水解酶,分布在GH13、GH28、GH78和GH106家族,其中3种GH78家族的α-L-鼠李糖苷酶具有典型的(α/α)6桶状结构,它能够特异性地水解许多糖苷类物质末端的α-L-鼠李糖基,在食品饮料加工工业和医药业中具有重要的应用价值。介绍了微生物来源的α-L-鼠李糖苷酶的性质及应用,主要阐述了α-L-鼠李糖苷酶基因的克隆、表达及该酶晶体结构方面的研究进展。     

多形拟杆菌α-L-鼠李糖苷酶序列分析与酶学性质

α-L-鼠李糖苷酶在生物技术领域具有很好的生物催化应用前景。目前,仅16个细菌源GH78家族α-L-鼠李糖苷酶基因被报道,对α-L-鼠李糖苷酶的序列特征与分子催化机制了解尚不完善。人体肠道细菌多形拟杆菌可利用多种多糖与糖苷,其基因组包括6个预测的α-L-鼠李糖苷酶基因,本文集中于连续定位于一个基因座的2个α-L-鼠李糖苷酶基因BtRha78D和BtRha78E,通过研究二者的序列特征和酶学特性旨在确定此基因座的生物学意义。序列分析显示,BtRha78D和BtRha78E的序列组成与长度差异性大,与已发现的α-L-鼠李糖苷酶序列一致性较低,分子进化关系也较远;酶学性质研究表明,BtRha78D和BtRha78E可高效水解底物p NPR,最适p H分别为p H6.0与p H 7.0。BtRha78E在p H 7.5~8.0范围内,仍能保持52%以上的活性。BtRha78D和BtRha78E最适温度为50℃,对pNPR的kcat分别为14.78 s-1和5.48 s-1,Km分别为0.14 mmol/L和0.44 mmol/L,kcat/Km分别为105 600 s-1L/mol和12 500 s-1L/mol。BtRha78D和BtRha78E耐受低浓度(1%)有机溶剂,10%浓度显著降低酶活性,对二甲亚砜具有很好的耐受性,10%浓度下仍能分别保持42%和53%的活性。本研究揭示,α-L-鼠李糖苷酶BtRha78D和BtRha78E间的序列组成与长度差异性很大,具有相同的催化活性而酶学性质却不同,一个包含2个α-L-鼠李糖苷酶基因的基因座可能参与多形拟杆菌降解利用含α-L-鼠李糖基的多糖与糖苷化合物。     

α-L-鼠李糖苷酶特性简述及影响酶活的因素

α-L-鼠李糖苷酶是一个非常重要的工业酶,广泛分布于各种生物中。不同来源的α-L-鼠李糖苷酶具有多样性。细菌来源的α-L-鼠李糖苷酶的最适pH接近中性或偏碱性,而真菌来源的α-L-鼠李糖苷酶的最适pH在酸性范围。除此之外,不同来源的α-L-鼠李糖苷酶在最适温度、热稳定性和底物特异性等方面也不尽相同,酶学性质的差异,决定了其在工业应用时所具有的优势和限制。因此,分析不同来源的α-L-鼠李糖苷酶的酶学性质、阐明其在催化机制和底物特异性等方面的异同点、探究底物的糖苷配体和金属阳离子对酶活性的影响以及L-鼠李糖和葡萄糖对酶的竞争性抑制作用,可以为工业生产中准确选择α-L-鼠李糖苷酶提供参考,进一步推动该酶的工业化应用进程。     

千里光脂肪醛脱羰基酶(CER1蛋白)的保守基序(CSM)与功能结构域分析

基于已构建的千里光全长c DNA文库,克隆其脂肪醛脱羰基酶基因(Gen Bank No.:KT895253),并进一步分析该基因所编码蛋白质(CER1蛋白)的氨基酸保守基元序列(conserved sequence motif,CSM)和蛋白质功能结构域的关系。蛋白质一级结构分析发现,千里光CER1蛋白由623个氨基酸残基组成;进化树和序列比对结果提示SH-片段和LH-片段这两个富含His的保守基元序列在不同物种中表现出高度保守性;3-D结构预测结果表明,高等植物CER1蛋白水合状态下具有高效的底物结合能力和脂肪醛脱羰基的催化效率。因此,根据脂肪醛脱羰基酶氨基酸保守基序对蛋白质功能域的决定作用,推测CER1蛋白的保守结构域是形成底物结合部位和酶催化活性中心的结构基础。     

宏基因组样本数据的分析比较与分类

宏基因组学研究试图通过测序并分析微生物群落的DNA序列,以理解环境微生物的组成及其与环境的交互作用。宏基因组学革命性地改变了微生物学,使得以免培养的方式研究复杂生物系统中的微生物群落成为可能。第二代测序技术的不断进步和生物信息学的高速发展促进了高通量宏基因组研究的发展,大批高质量的宏基因组数据不断产生并对科学界开放,宏基因组学的重要作用被科学界广泛认可。与此同时,对应个体不同健康状态和人体不同部位的大量宏基因组样本数据不断产生,使得比较和分类宏基因组样本在微生物学研究上变得更加重要,比较宏基因组学成为宏基因组学的重要分支。主要介绍了宏基因组数据的分析比较,以及样本分类的相关研究和算法。     

山药Actin基因片段的克隆及表达分析北大核心CSCD

通过山药Actin基因的克隆和表达分析,为研究山药生长发育中肌动蛋白的作用及其他基因的表达和调控奠定基础。根据Gen Bank中已经公布的其他植物肌动蛋白基因(Actin)的保守序列设计一对简并引物,采用RT-PCR技术从山药块茎中分离出1个Actin基因cDNA片段,命名为DoActin。片段长度为1 091 bp,编码357个氨基酸,并提交Gen Bank(登录号:KU669295)。与NCBI核酸和蛋白质数据库序列比对,该序列与其他植物Actin基因核苷酸序列的同源性均在83%以上,氨基酸序列的同源性均在97%以上。进化分析结果显示,DoActin与海枣Actin-2、木本棉Actin-7的亲缘关系最近。实时定量PCR结果显示,DoActin在山药叶片、地上茎和地下块茎以及不同发育期的块茎和叶片中表达量相对稳定,表明其适宜作为山药的内参基因。     

茶树单萜合成酶CsTPS基因的克隆及表达分析

该研究在茶树转录组测序的基础上,以‘铁观音’茶树品种的芽叶为供试材料,采用RT-PCR技术,克隆了茶树的1条单萜合成酶(TPS)基因全长cDNA序列,命名为CsTPS(GenBank登录号为KY829105)。CsTPS基因全长2 077bp,其开放阅读框(ORF)为1 752bp,编码583个氨基酸。CsTPS基因编码蛋白含有单萜合成酶蛋白特有的2个天冬氨酸富集基序及RRx8W、RxR保守基序,N端具有一段叶绿体转运肽。同源比对分析显示,CsTPS氨基酸序列与多种植物的单萜合成酶序列相似性较高,与黄胡萝卜α-松油醇合成酶、白簕柠檬烯合成酶、蓖麻单萜合成酶相似性分别为74%、71%和66%。系统进化树分析表明,CsTPS属于TPSb亚家族类型。荧光定量PCR结果显示,在白茶萎凋、乌龙茶做青、红茶发酵等加工过程中,CsTPS基因的表达量均有上调,推测CsTPS基因的表达与茶叶加工过程中茶叶香气形成密切相关。     

山药Actin基因片段的克隆及表达分析

通过山药Actin基因的克隆和表达分析,为研究山药生长发育中肌动蛋白的作用及其他基因的表达和调控奠定基础。根据Gen Bank中已经公布的其他植物肌动蛋白基因(Actin)的保守序列设计一对简并引物,采用RT-PCR技术从山药块茎中分离出1个Actin基因cDNA片段,命名为DoActin。片段长度为1 091 bp,编码357个氨基酸,并提交Gen Bank(登录号:KU669295)。与NCBI核酸和蛋白质数据库序列比对,该序列与其他植物Actin基因核苷酸序列的同源性均在83%以上,氨基酸序列的同源性均在97%以上。进化分析结果显示,DoActin与海枣Actin-2、木本棉Actin-7的亲缘关系最近。实时定量PCR结果显示,DoActin在山药叶片、地上茎和地下块茎以及不同发育期的块茎和叶片中表达量相对稳定,表明其适宜作为山药的内参基因。     

黄杆菌菌株RC2-3基因组生物信息学分析及高效降解岩藻多糖功能基因的挖掘

以从海带中筛选获得的一株具有降解岩藻多糖能力的黄杆菌菌株RC2-3为研究对象，该菌株产的岩藻多糖酶可以高效降解不同来源的岩藻多糖。为进一步探究菌株RC2-3降解岩藻多糖的机制，推动岩藻寡糖的酶法生产，采用Illumina测序技术对菌株RC2-3进行基因组测序、基因功能注释和碳水化合物活性酶注释以及岩藻多糖降解相关基因的生物信息学分析。结果表明，黄杆菌菌株RC2-3基因组全长3 414 532 bp,共编码2 967个基因，GC含量为30.92%。经碳水化合物活性酶数据库注释获得213个基因，与岩藻多糖降解有关的包括7个岩藻糖结合结构域的基因；2个β-D-岩藻糖苷酶(EC 3.2.1.38)基因；2个属于GH141家族的α-L-岩藻糖苷酶(EC 3.2.1.51)基因；12个属于GH29家族的α-1, 3/1, 4-L-岩藻糖苷酶(EC 3.2.1.111)基因；9个属于GH95家族的α-1, 2-L-岩藻糖苷酶(EC 3.2.1.63)基因。此外，通过与已报道的蛋白序列比对发现，岩藻多糖酶基因RC2.3＿GM001247编码的蛋白序列与FunA蛋白序列同源性达到70.98%,岩藻多糖酶...     

基于皱皮软海绵宏基因组的PKS基因筛选的研究

提取皱皮软海绵及其共附生微生物的宏基因组总DNA,使用聚酮合酶(PKS)基因的酮酰合酶(KS)域引物PCR扩增PKS基因片段获得一条671bp的片段,以pUCm-T vector为载体将该基因片段克隆到大肠杆菌中,从阳性克隆中分离出PKS基因片段,测序推导出氨基酸序列。通过BLAST比对发现此氨基酸序列与红细菌目的Rhodobacterales bacterium PKS基因KS域的氨基酸序列有96%的同源性。通过基于氨基酸序列的系统发育分析,推测此筛选得到的PKS基因属于trans-AT型。本文首次证实了皱皮软海绵中存在细菌来源的PKS基因。     

人ACT1基因P7启动子的克隆及序列分析

克隆并测定人酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶1(ACAT1)基因P7启动子的序列,进一步探讨ACAT1基因表达的转录调控特点并分析其特异性转录位点。根据GenBank数据库提供的人A- CAT1基因P7启动子核苷酸序列,应用PCR方法从人单核细胞系THP-1扩增分离出ACAT1基因P7启动子全长片段,将PCR产物克隆入T载体,并对所获得的序列进行生物学信息分析。经琼脂糖凝胶电泳及直接测序鉴定,克隆的ACAT1基因P7启动子片段碱基序列与Gen Bank数据库一致。成功克隆了ACAT1基因P7启动子,为研究在动脉粥样硬化过程中AcAT1基因的转录调控机制奠定基础。     

草莓果实MADS-box基因保守片段的克隆与序列分析

根据多种植物MADS-box基因保守区序列设计简并引物,应用PCR技术从草莓绿果中分高出33条MADS-box基因cDNA片段.序列分析表明,这些片段长度在137 - 146 bp之间,包含基因起始密码子.推导的氨基酸序列与已登录的草莓的MADS-box基因同源性超过87％.推导的氨基酸序列与已知的革莓和其他物种调控果实发育成熟的MADs-box基因以及拟南芥的MADS-box家族基因进行系统发育分析,可将这些基因片段分科归入拟南芥MADS-box基因不同亚家族中,证明草莓果实中存在各类MADS-box家族基因,克隆的部分片段可能参与调控果实发育和成熟软化的调节.     

冬瓜BhMAPK15基因的克隆及其非生物胁迫下的表达分析

该文为探究MAPK15基因的结构和功能,根据冬瓜(Benincasa hispida (Thunb.) Cogn.)转录组高通量测序结果,采用RT-PCR方法从冬瓜中分离得到MAPK15基因的完整编码序列,命名为BhMAPK15。序列分析表明,BhMAPK15开放阅读框(ORF)长1 704 bp,编码567个氨基酸。亚细胞定位预测表明,BhMAPK15可能定位于细胞核或细胞质。以NCBI数据库为基础,从数据库中获得模式植物水稻、拟南芥和其他不同物种间的MAPK15家族成员,分析该基因与这些成员的氨基酸序列、保守基序,并构建系统进化树。经系统进化树分析表明,BhMAPK15属于D组家族成员,与甜瓜、南瓜、黄瓜和苦瓜的相似性较高。氨基酸序列和保守基序结果表明,该基因家族成员保守性较高。实时荧光定量PCR分析表明,BhMAPK15在不同组织器官中均有表达,且非生物胁迫处理可以上调BhMAPK15的表达水平。上述研究结果表明,BhMAPK15基因可能在冬瓜响应非生物胁迫中发挥作用。     

海州香薷Actin基因片段克隆及表达分析

通过克隆海州香薷Actin基因片段并分析其组织表达,为研究海州香薷重金属抗性相关基因的表达调控奠定基础。根据Gen Bank中其他植物Actin基因保守序列设计兼并引物,以海州香薷根总RNA为模板,利用RT-PCR技术分离得到Actin基因片段。序列分析结果表明,海州香薷Actin基因片段长576 bp,编码192个氨基酸,与其他植物同源基因的氨基酸序列相似性为84%-97%,所克隆的序列为Actin基因的同源片段,将其命名为Eh ACT,在Gen Bank中提交序列,获得登录号AGT37260。半定量RT-PCR分析结果表明,Eh ACT在海州香薷的根、茎和叶中表达相对稳定,初步表明其可作为研究海州香薷基因表达的内参基因。     

黄肢散白蚁β-糖苷酶基因的克隆及特性分析（英文）

【目的】黄肢散白蚁Reticulitermes flaviceps是我国代表性的食木白蚁之一,具有高效的纤维素酶系统。本研究旨在克隆黄肢散白蚁中纤维素酶基因并进行其特性分析,为白蚁纤维素酶资源的开发提供理论基础。【方法】采用反转录PCR(RT-PCR)、简并PCR以及c DNA末端快速扩增实验(RACE)法克隆黄肢散白蚁β-糖苷酶基因序列并进行生物信息学分析;利用大肠杆菌Escherichia coli原核表达该基因,表达出的蛋白质经纯化后进行纤维素酶活力测定。【结果】从黄肢散白蚁中克隆到一个β-糖苷酶基因GZRfbg1(Gen Bank登录号:KU886065)的全长c DNA序列,全长1 691bp,开放阅读框1 488 bp,编码448个氨基酸残基,预测分子量为56.45 k D,具有典型的糖基水解酶家族1(GHF1)的蛋白功能结构域。氨基酸序列多重比对显示,GZRfB G1与北美散白蚁Reticulitermes flavipes的唾液腺β-glucosidase氨基酸序列一致性为95%。GZRfB G1在大肠杆菌Rosetta 2(DE3)中进行体外表达,经纯化的GZRfB G1纤维素酶活力测定结果显示,其对水杨苷、羧甲基纤维素钠(CMC)以及纤维二糖的水解活性依次上升,能够在CMC-琼脂平板中产生清晰的水解圈。【结论】结果表明,来自黄肢散白蚁与北美散白蚁两个近缘白蚁的唾液腺β-糖苷酶在氨基酸序列及其水解特征方面亦具有高度保守性。该β-糖苷酶基因的研究丰富了白蚁纤维素酶开发及系统发生研究的理论基础。     

大眼长蝽卵黄原蛋白基因克隆、序列分析及表达研究

旨在为研究大眼长蝽(Geoco ris pallidipennis)卵黄原蛋白(Vitellogenin,Vg)分子特性及其基因生理功能。利用RT-PCR、RACE及ELISA方法对大眼长蝽Vg基因进行克隆、序列分析和表达研究。该基因c DNA全长5 667 bp(Gen Bank登录号:KP688587),编码1 848个氨基酸残基,N-末端的前19个氨基酸为信号肽。氨基酸序列中有两个保守的多聚丝氨酸区域和RXXR酶切位点,接近C-末端有GLAG基序,其后有5个保守的半胱氨酸残基,DGYR基序位于GLAG上游18个氨基酸残基处。该基因编码氨基酸序列与其它半翅目昆虫Vg氨基酸序列相似度较高,氨基酸序列分析显示它有Vg的典型特征,表明克隆的c DNA序列是大眼长蝽的Vg基因序列。ELISA检测发现随着发育时间的延长,卵黄原蛋白表达量逐渐增加,羽化后22 d达到高峰,随后开始下降,结果表明大眼长蝽雌虫卵黄原蛋白的表达量与大眼长蝽产卵量紧密相关。     

滨海适生植物草海桐Actin基因片段的克隆及序列分析

[目的]本文为研究草海桐功能基因的表达模式提供可供参考的内参基因。[方法]根据Actin基因的保守区设计简并性引物,采用RT-PCR扩增草海桐Actin基因的片段。将获得的片段连接于T载体并进行测序,运用分子生物学软件对该序列进行分析。[结果]获得一段大小为554 bp的基因片段,编码184个氨基酸;该序列与其它Actin基因核苷酸序列的同源性均在82%以上,与氨基酸序列的同源性达96%以上。[结论]克隆的基因为Actin基因片段,将其命名为Ss Actin1,并登录在Gen Bank,登录号为KU564628。     

野生茄子（Solanum torvum）抗黄萎病相关基因Sto Vel的克隆与分析

采用RT—PCR和RAcE技术从野生茄子中扩增克隆到一个抗黄萎病相关基因,命名为StoVel,其cDNA全长3400bp,含有3153bp的完整开放阅读框,编码1051个氨基酸,该基因编码的蛋白序列与刚果野茄、类番茄和番茄Vel编码的氨基酸序列同源性分别为82％、81％和80％,且有很高的功能区段保守性。将该cDNA全长序列提交Gen Bank,登陆号为DQ020574。半定量PCR表明该基因为组成型表达,在根中表达最多,叶中最少。     

番杏Actin基因片段的克隆及生物信息学分析

本实验为研究番杏(Tetragonia tetragonioides)功能基因表达模式提供内参基因,根据登录在NCBI上植物的Actin基因的保守区域设计简并性引物,通过RT-PCR克隆获得番杏的Actin基因片段,将该片段连接于载体pGEM-T后进行测序,并将该基因序列通过生物信息学软件进行分析。结果显示,克隆所得基因片段大小为598 bp,编码198个氨基酸;该序列与登录在NCBI上的其他植物的Actin基因的核苷酸序列的同源性最大可达86%以上,编码蛋白的氨基酸序列同源性在88%以上。结果表明,本研究克隆所得的基因序列为番杏Actin基因片段。该基因命名为TtActin1,在Gen Bank的登录号为MH33308。