甜菜坏死黄脉病毒外壳蛋白基因在大肠杆菌中的高效表达

将甜菜坏死黄脉病毒内蒙古分离物的外壳蛋白基因亚克隆到ｐＪＷ２上构建成在大肠杆菌中表达的载体。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测的结果表明,该表达载体在大肠杆菌ＤＨ５α中经温度诱导后特异地表达２１ｋＤ的甜菜坏死黄脉病毒外壳蛋白。经光密度扫描估测,其表达量占大肠杆菌总蛋白的１９．５％。     

甜菜坏死黄脉病毒外壳蛋白基因的克隆和序列分析

以甜菜坏死黄脉病毒(BNYVV)内蒙分离物的RNA为模板,通过PcR扩增获得外壳蛋白(CP)基因的目的片段。将其重组到pGEM一7zf(+)并转化JMl01得到了含有完整CP基因的重组子。采用双脱氧终止法进行序列分析,结果表明CP基因为567nt,与文献(1]报道相比,氨基酸和核苷酸的同源性分别为98．4％和96．7％。     

甜菜坏死黄脉病毒75kDa通读蛋白基因构建与表达

利用DNA重组技术,将甜菜坏死黄脉病毒(BNYVV)内蒙分离物的CP基因和54kDa通读区片段拼接。构建了BNYVV 75kDa通读蛋白基因。序列分析表明,构建的75kDa通读蛋白基因与野生型相比．只有4个核苷酸发生了改变(包括将CP基因的终止密码子TAG改造为ATG),相应地2个氨基酸也发生了改变。将75kDa通读蛋白基因及其54kDa片段分别克隆到pJw2上,构建了这两十基因的原核表达载体。SDS—PAGE和western blotting检测结果表明,75kDa通读蛋白基因在E coli BL21(DE3)中经温度(42℃)诱导后除可特异地表达75kDa蛋白外。还产生两种小蛋白。75kDa通读蛋白基因的54kDa片段只表达出37kDa的蛋白。     

甜菜坏死黄脉病毒分子生物学的研究进展

甜菜坏死黄脉病毒分子生物学的研究进展姚华建,于嘉林,刘仪（北京农业大学农业生物技术国家重点实验室,北京１０００９４）ＡｄｖａｎｃｅｓｏｆＲｅｓｅａｒｃｈｏｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙｏｆＢｅｅｔＮｅｃｒｏｔｉｃＹｅｌｌｏｗＶｅｉｎＶｉｒｕｓ￥Ｙ...     

甜菜坏死黄脉病毒的分离提纯及其生物化学特性的研究

本研究工作中,建立了一个有效的甜菜坏死黄脉病毒的分离提纯程序,解决了该病毒粒体易于聚集难以提纯的问题,其操作要点是,(1)通过Sepharose 2B柱层析代替超离心,有效地除去一些小分子量核酸杂质;(2)经PEG再次沉淀浓缩后,调整pH至酸牲(pH3.0),使病毒充分悬浮以减少凝聚;(3)在病毒等电点(pH4.8～4.9)条件下,进一步沉淀以纯化病毒。根据病毒提取物的OD260/OD280比值,算出核酸含量约4.5％。核酸电泳出现4条带,分子量分别为:2.25×10~(?),1.8×10~(?),1.05×10~(?),0.75×10~(?)道尔顿。病毒提取物经超速离心出现4个界面,沉淀系数分别为,200.8S,165S,125.8S,100S。说明甜菜坏死黄脉病毒可能是4组分病毒粒体。病毒粒体含一蛋白亚基,分子量约为2.05±0.05×10~4道尔顿,由16种共199个氨基酸组成。     

马铃薯Y病毒外壳蛋白基因在转基因马铃薯中的表达

ＰＶＹ是马铃薯Ｙ病毒组的典型成员,主要感染马铃薯、番茄、辣椒和烟草等。近年来,利用植物基因工程手段获得了不少抗病毒转基因工程植物,为培育抗病毒作物新品种提供了新途径［１］。病毒外壳蛋白基因导入并使之在植物中表达可获得抗相应病毒的转基因植物,已在烟草、番茄、马铃薯、苜蓿、黄瓜和番木瓜等植物中获得成功［１～３］。本室已成功地对在我国流行的ＰＶＹＮ株系外壳蛋白基因进行了克隆及序列测定［４］,在此基础上,我们构建了植物表达中间载体,通过土壤农杆菌介导的叶盘法转化马铃薯,获得了大量转基因植株。分子检测证明…     

马铃薯X病毒外壳蛋白基因在转基因烟草植株中的表达及抗病

通过根癌农杆菌介导的叶盘法,将马铃薯Ｘ病毒外壳蛋白基因导入烟草细胞并获得大量再生的转基因烟草植株。经胭脂碱检测、酶联免疫分析和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析,证明已获得了具有马铃薯Ｘ病毒外壳蛋白基因表达的转基因烟草。用２μｇ／ｍｌ的ＰＶＸ磨擦接种烟草,８天后进行观察,发现对照植株开始发病,而转基因烟草植株在２０后才开始发病,有的转基因烟草植株在整个生长期中都不得病。对ＰＶＸＣＰ基因表达量较高的４株植     

抗甜菜坏死黄脉病毒单抗轻链可变区基因的克隆及全序列测定

甜菜是温带地区主要糖料作物,甜菜丛根病是其一种毁灭性病害,在世界范围内广泛蔓延,发病田块可以造成２０％—５０％以上的减产,甚至绝收,糖度可以降低４—８度。甜菜坏死黄脉病毒（ＢＮＹＶＶ）是丛根病的主要病源,目前没有好的防治方法。为了探索用基因工程抗体技术与植物转化技术防治丛根病的可行性,首先要把抗ＢＮＹＶＶ的单克隆抗体的可变区基因扩增和克隆出来,本文报道轻链可变区基因的扩增、克隆和全序列分析的结果。材料和方法抗甜菜坏死黄脉病毒的单抗杂交瘤（３Ｃ４）由北京农业大学植物病毒研究室制备［１］。细胞培养于…     

甜菜坏死黄脉病毒75kDa通读蛋白基因54kDa片段的克隆及其序列分析

以甜菜坏死黄脉病毒(BNYVV)内蒙分离物的总RNA为模板,通过反转录和PcR扩增获得75kDa通读蛋白基因54kDa片段的目的片段。将其克隆到pGEM－7Zf(+)上并转化DH5α得到了含有完整s4kDa片段的重组子pGBW52。采用双脱氧终止法进行序列分析。结果表明内蒙分离物的54kDa片段全长为1509nt,与法国的F13分离物相比缺失了3个核苷酸。其核苷酸序列和由此推导的氨基酸序列的同源性分别为94．97％和96．42％．     

中国甜菜坏死黄脉病毒RNA5的检测及其核苷酸序列分析

利用反转录 Ｐ Ｃ Ｒ 方法,对甜菜坏死黄脉病毒（ Ｂ Ｎ Ｙ Ｖ Ｖ）５ 个中国分离物的 Ｒ Ｎ Ａ５进行了检测,结果表明新疆分离物、黑龙江分离物和内蒙古乌拉特前旗分离物不含有 Ｒ Ｎ Ａ５ ,只有包头分离物和呼和浩特分离物有 Ｒ Ｎ Ａ５ 。序列分析结果,包头分离物和呼和浩特分离物 Ｒ Ｎ Ａ５ 基因组分别为１３３８ ｎｔ 和１３５８ ｎｔ,均只包含１ 个开放阅读框架,编码产生２６ ｋ Ｄ 蛋白。与法国 Ｆ７２ 分离物和日本 Ｄ５ 分离物相比, 各分离物间核苷酸序列同源性为９３７ ％ ～９８５ ％ ,由此推导的氨基酸序列同源性为９１８ ％ ～９８２ ％ 。     

Expression of single-chain antibody fragments (scFv) specific for beet necrotic yellow vein virus coat protein or 25 kDa protein in Escherichia coli and Nicotiana benthamiana

The coding sequences for the variable regions of heavy and light chains of monoclonal antibodies (mAbs) to beet necrotic yellow vein virus (BNYVV) coat protein (cp) or the 25 kDa nonstructural protein (P25) were cloned into the pCOCK vector and expressed as single-chain antibody fragments (scFv) in Escherichia coli. For expression in higher plants the scFv were targeted either to the secretory pathway by including the sequences encoding the pectate lyase B (PelB) or the phytohemagglutinin (PHA) signal peptides in the vector constructs or they were targeted to the cytoplasm by omitting a signal peptide-encoding sequence from the constructs. The scFv were detected mainly in plants in which the PHA signal peptide had been used for targeting demonstrating for the first time the usefulness of this peptide for enabling scFv expression in plants. The scFv were not secreted into the culture fluids of suspension cultures, but were retained in the cells. The amount of expression of scFv in the best expressing plants was at least as high as in bacterial culture supernatants. In a dot blot immunoassay, 0.4 ng BNYVV cp or 0.8 ng P25 were detected by the respective scFv either from E. coli or from plants. The majority of the 21 plants expressing cp-specific scFv had near-normal growth whereas the three plants expressing P25-specific scFv grew poorly and did not form roots.     

甜菜坏死黄脉病毒内蒙分离物RNA3序列分析及编码25kD蛋白基因在大肠杆菌中的表达

以甜菜坏死黄脉病毒（ＢＮＹＶＶ）内蒙分离物的总ＲＮＡ为模板,通过反转录－ＰＣＲ扩增获得ＢＮＹＶＶＲＮＡ３全长ｃＤＮＡ。将其克隆到ｐＧＥＭ－７Ｚｆ（＋）上,得到重组质粒ｐＧＢＹ５６。序列分析结果表明,内蒙分离物ＲＮＡ３基因组全长为１７７５ｎｔ,其中包含３个开放阅读框架,分别编码２５ｋＤ蛋白、４．６ｋＤ蛋白和一种由５９个氨基酸组成的Ｎ蛋白。与法国Ｆ２分离物、德国Ｇ１分离物和日本Ｓ分离物相比,其核苷酸序列的同源性分别为９６．４％、９６．８％和９７．３％。将２５ｋＤ蛋白编码基因克隆到ｐＪＷ２上,构建了该基因的原核表达载体。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ分析结果表明,２５ｋＤ蛋白基因在Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）中经温度（４２℃）诱导后,可特异地表达２５ｋＤ蛋白