小分子G蛋白Rapl shRNA表达载体的构建和鉴定

应用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术抑制Rapl基因的表达,构建Rap1 shRNA(small hairpin RNA,shRNA)表达载体,观察其对小鼠肝脏细胞中Rap1 mRNA和蛋白表达的干扰作用.根据小鼠Rap1 mRNA的全序列.设计了3种Rap1 siRNA序列(Rap1 siRNA1、Rap1 siRNA2、Rap1 siRNA3)和阴性对照序列(HK);采用克隆技术,将其插入带有报告基因绿色荧光(ECFP)的pGenesil-3栽体,构建Rap1 shRNA表达载体:经双酶切和测序证实Rap1 siRNA表达载体克隆构建成功,插入片段测序结果与合成的siRNA结果一致;昆明小鼠40只,体重18～20 g,随机分成4组: Ⅰ组(转染HK组)、Ⅱ组(转染Rapl shRNAl组)、Ⅲ组(转染Rap1 shRNA2组)、Ⅳ组(转染Rapl shRNA3组).于0、16、24 h腹腔内注射Rapl shRNA 2.0～2.5 mg/kg(用PBS稀释至1 mL);48 h后收集小鼠肝脏.用显微荧光、定量RT-PCT、免疫组化检测小鼠肝细胞中Rap1shRNA的转染率、Rap1基因表达以及蛋白质表达水平.Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组小鼠肝脏细胞体内转染率均大于60%,Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组的Rap1 mRNA表达、Rap1蛋白表达均降低,其中Rap1 shRNA1干扰效果最佳.     

肿瘤转移抑制蛋白MTss1shRNA慢病毒载体的构建与鉴定

肿瘤转移抑制蛋白MTss1在小脑浦肯野神经元发育中表达受到调控,然而功能并不清楚.拟通过RNAi的方法降低内源MTss1的表达,为MTss1在神经元中的功能研究建立基础.针对小鼠MTss1基因(Mtss1)的mRNA序列,设计合成三对shRNA序列,克隆到pSuper-Retro-Puro质粒中,瞬间转染GFP-Mts...     

不同长度茎部shRNA表达载体构建与鉴定

本研究针对同一目的基因设计构建不同茎部长度的shRNA表达载体,并对其在细胞及胚胎水平的干扰效应做一比较。以绿色荧光蛋白基因为沉默效应的靶基因,设计茎部长度分别为21bp、27bp、29bp的干扰片段,退火后连入带有H6启动子的真核表达载体psiSTRIKE中(分别命名为EGFP-21siRNA、EGFP-27siRNA和EGFP-29siRNA),将构建成功的载体以脂质体法转染小鼠胚胎成纤维细胞,利用荧光定量PCR对其荧光表达进行精确定量。不同茎部长度的shRNA载体均使绿色荧光蛋白基因表达降低,茎部为29bp时比21bp、27bp表现出更明显的沉默效应。细胞水平沉默效应的初步验证,为筛选适合小鼠个体水平的最佳发夹结构奠定了基础。     

绿色荧光蛋白标记的TGF-β1shRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的：构建小鼠转化生长因子β1（TGF-β1）短发夹RNA（shRNA）真核表达载体,探讨TGF-β1在血管发育中的调控作用。方法：根据GenBank小鼠TGF-β1mRNA序列,设计合成三对短链寡核苷酸,退火后形成双链DNA并克隆至入门载体DEN_mH1c。将插入目的基因片段的入门载体与带有绿色荧光蛋白（GFP）标签的shRNA真核表达载体pDS_hpEy进行LR重组反应,完成三个TGF-β1shRNA表达载体的构建,分别命名为pDS_Ta,pDS_Tb和pDS_Tc。经测序确认后,转染小鼠成纤维细胞（NIH／3T3）,筛选稳定表达的细胞克隆,以RT-PCR及Westem blot方法检测转染后TGF-β1mRNA和蛋白表达。结果：RT-PCR和Western blot显示pDS_Tc可明显下调NIH／313细胞TGF-β1的mRNA和蛋白表达,mRNA下调约为70％,蛋白表达减少约65％。结论：GFP标签TGF-β1shRNA表达载体能够阻断TGF-β1基因表达,可作为研究TGF-β1调控血管发育机制的一个工具,为阐明TGF-β1信号传导通路奠定基础。     

在大肠杆菌中高效表达可用于检测人源Rap1活性RapBD蛋白方法的建立

【背景】Rap1是一种小GTP酶,其活性的检测方法少,目前主要依赖试剂盒,检测成本太高。而Rap1下游效应蛋白RalGDS具有Rap1结合结构域(Rap binding domain,RapBD),该结构域能与有活性的GTP-Rap1特异性结合。【目的】利用大肠杆菌外源表达GST-RapBD融合蛋白,建立经济的检测人源Rap1活性的方法。【方法】合成RapBD基因序列,插入pGEX-4T-1载体,使该质粒表达GST-RapBD融合蛋白,再利用GST亲和树脂结合大肠杆菌中表达的GST-RapBD融合蛋白,最后利用GST-RapBD融合蛋白Pulldown检测GTP-Rap1。【结果】建立了检测人源Rap1活性的方法。【结论】序列优化使得pGEX-4T-1载体在大肠杆菌中高效表达能特异性结合人源GTP-Rap1且带有GST标签的RapBD蛋白,提高了Pulldown实验检测GTP-Rap1的效率,降低了检测人源小G蛋白Rap1活性的成本。     

shRNA表达载体构建方法的优化

目的探讨shRNA表达载体的构建方法 ,以加速RNA干扰研究的进程。方法对shRNA表达载体的构建过程进行分析和监测 ,并加以优化。结果发现shRNA表达载体构建的退火过程容易产生障碍 ,经优化退火缓冲液的NaCl含量后 ,能明显提高退火效率及shRNA表达载体构建的成功率。结论shRNA表达载体构建的退火过程需加以关注 ,退火缓冲液中NaCl含量应提高至 2 0 0mmol/L以上为宜     

neuronatin shRNA真核表达载体的构建及其生物学功能

目的:获得能持续干扰neuronatin（nnat）基因表达的细胞,观察nnat基因沉默对神经细胞发育与分化的影响,为研究基因功能奠定基础。方法:构建含nnat基因短发夹RNA(shRNA)表达质粒,将质粒转染大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞PC12,RT-PCR方法筛选出最有效干扰质粒,稳定转染PC12细胞后观察细胞表型变化,免疫荧光检测nnat蛋白表达,NGF诱导观察nnat表达下调对细胞分化的影响。结果:成功构建并筛选出有效的靶向nnat基因的shRNA真核表达载体;载体稳定转染PC12细胞之后能特异性沉默nnat基因的表达,PC12细胞长出突起,向神经元方向分化,加入诱导因子NGF后能促进突起生长。结论:nnat可能是作为神经分化抑制因子在神经发育与成熟过程中发挥作用。     

小G蛋白Rap的信号通路与生物学功能

Rap在细胞内控制着许多重要的信号通路,这些通路与细胞极性的形成、细胞增殖、分化和癌变、细胞黏附和运动等重要的生物功能密切相关,并进一步在组织器官水平影响一些重要的生理功能,如神经极性的建立、神经突触生长、突触可塑性和神经元迁移等。Rap属于Ras家族,含有Rap1和Rap2两个亚类。Rap通过结合GTP或GDP,在激活与失活两种状态之间切换,从而发挥分子开关的功能。此外,Rap在癌症的发生和发展过程中也发挥着关键作用,它可抑制癌基因Ras诱导的细胞转化;还可通过与其下游靶分子的相互作用,作为细胞信号通路上的一个开关分子诱导细胞恶性转化。本文对上述Rap的生物学功能做了概括总结,并在此基础之上探究Rap及受其调控的蛋白质对肿瘤和神经系统疾病的药物开发和治疗的重要意义。     

用pLNCX2携带人MCPH1基因shRNA重组逆转录病毒载体的构建及鉴定

目的建立逆转录病毒介导的MCPH1基因RNA干扰表达体系并观察其在宫颈癌Caski细胞中对MCPH1表达的影响。方法将人MCPH1基因RNA干扰双链DNA片段重组到逆转录病毒质粒pLNCX2中,构建携带人MCPHI基因RNA干扰的逆转录病毒载体pLNCX2-shRNA—MCPH1,经PT67细胞包装后,产生的重组逆转录病毒感染宫颈癌细胞株Caski细胞,并用G418筛选产生稳定的细胞克隆,用RT—PCR和Western印迹检测细胞中MCPH1mRNA和蛋白表达的变化。结果重组逆转录病毒质粒经测序鉴定正确,逆转录病毒感染Caski细胞后用G418筛选出稳定的细胞克隆,RT—PCR和Western印迹检测人MCPH1mRNA和蛋白表达水平明显低于阴性对照组和未干扰组。结论携带人MCPHI基因RNA干扰双链DNA片段的逆转录病毒感染Caski细胞后能明显抑制MCPHImRNA和蛋白表达,为进一步研究MCPH1在宫颈癌中的作用奠定了基础。     

TPP1基因慢病毒干扰载体的构建及鉴定

目的:构建抑制TPP1基因的短发夹RNA(sh RNA)干扰载体。方法:以人的TPP1基因为靶序列,设计并合成sh RNA序列TPP1-si1和TPP1-si2,分别与RNA干扰慢病毒载体pll3.7连接,双酶切鉴定质粒得到阳性克隆pll-TPP1-si1和pll-TPP1-si2,经测序正确后将其与慢病毒包装载体(RRE、REV、VSVG)共转染293T细胞,进行病毒的包装,将得到的病毒感染稳定高表达外源TPP1蛋白的HT1080细胞,通过Western印迹检测其对TPP1蛋白表达的抑制效果,并进行比较;将抑制效果好的病毒感染高表达外源Pot1蛋白的Hep G2细胞,检测Pot1蛋白在内源TPP1被敲低的情况下能否在端粒定位。结果:经双酶切验证,外源片段成功插入载体pll-TPP1-si1和pll-TPP1-si2中;pll-TPP1-si1和pll-TPP1-si2均能明显抑制TPP1的表达,其中pll-TPP1-si1的抑制效果最好;pll-TPP1-si1病毒感染高表达外源Pot1蛋白的Hep G2细胞,经免疫荧光鉴定能够有效抑制内源TPP1的表达,使Pot1不再端粒定位。结论:构建的抑制TPP1基因的sh RNA干扰载体能有效抑制TPP1的表达,为端粒蛋白TPP1功能的研究奠定了实验基础。