菜豆重金属响应基因PvSR2在烟草中的表达及镉抗性分析

重金属特异诱导基因PvSR2(Phaseolus vulgaris stress-related)是从法国菜豆中克隆出来的, 为了研究该蛋白能否提高植物的抗重金属能力, 将PvSR2基因插入到植物转化中间载体pCAMBIA2301中CaMV 35S启动子的下游, 用根癌农杆菌介导的叶盘法将其导入烟草中, 在含有100 mg/L Kan的MS培养基上筛选, 获得了转基因植株. PCR和Southern杂交结果表明PvSR2已整合在烟草基因组中, GUS和Northern分析表明PvSR2在转基因烟草中获得表达. 重金属抗性实验表明: 与野生型烟草相比, PvSR2转基因烟草具有较高的抗重金属镉(Cd)的能力. 组织Cd含量分析显示: 在低浓度Cd (0.5~0.75 mmol/L)处理时, Cd在PvSR2转基因烟草与野生型烟草根中的累积量没有明显的差别, 而在高浓度Cd(0.1 mmol/L)胁迫下, 转基因烟草根中Cd的累积量低于野生型烟草, 说明PvSR2的表达能够提高植物的抗重金属能力, 同时表明PvSR2可能与重金属在植物中的运输和积累有一定关系.     

无苞芥锌指蛋白基因OpZFP提高烟草耐盐性的研究

旨在研究C2H2型锌指蛋白在植物生长发育、非生物胁迫信号转导过程中的作用。前期从新疆无苞芥中克隆的一个单锌指基因Op ZFP,利用叶盘法将Op ZFP基因转入普通烟草中。半定量RT-PCR表明,在转基因植株中Op ZFP基因能够高效表达。烟草耐盐性分析显示,在高盐胁迫下,转基因植株的根长要长于野生型植株,且转基因烟草丙二醛(MDA)的含量要明显低于野生型植株;并且高盐胁迫处理,野生型烟草离体叶片叶绿素降解率高于转基因植株。这些结果表明,过量表达Op ZFP的转基因植株可以提高植物对盐胁迫的抗性。     

转MhGlu基因烟草灰霉病抗性及光合特性研究

以湖北海棠盆栽及组培苗叶片为材料,经NaCl、PEG-6000及4℃下ABA处理后,通过RT-PCR技术克隆了湖北海棠β-1,3-葡聚糖酶基因MhGlu;构建MhGlu基因的植物表达载体,通过农杆菌介导法将MhGlu基因转入烟草中,并通过PCR和RT-PCR检测,成功获得了4个转基因株系T6、T8、T11和T18;以转基因烟草株系T6及T8和非转基因对照植株为材料,对MhGlu基因的功能进行了进一步分析。结果显示:(1)半定量qRT-PCR显示,NaCl、PEG-6000及4℃下ABA处理均可以诱导湖北海棠盆栽及组培苗叶片MhGlu基因的表达;NaCl和PEG-6000处理48h内MhGlu基因的表达随处理时间延长逐渐增强,4℃下ABA处理的MhGlu基因表达量在4h时开始上调,12h时略降低,48h时又达到最大。(2)半定量RT-PCR检测转基因烟草植株几个病程相关基因PRs的表达量,表明过表达的MhGlu基因诱导并增强了烟草病程相关基因NtPR1、NtPR3和NtPR5的表达。(3)用灰霉病侵染烟草叶片,转基因烟草株系T6、T8均表现出较强的抗灰霉病特性。(4)测定烟草植株光合特性参数,转MhGlu基因烟草株系的净光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)和气孔导度(Gs)较对照组均显著提高,且T8的净光合速率和蒸腾速率均显著高于T6,而T8与T6的气孔导度差异不显著。MhGlu基因在烟草中的过量表达能诱导病程相关基因PRs的表达,激活了烟草的光合特性保护机制,提高了转MhGlu基因烟草植株的灰霉病抗性。     

构树转录因子BpbZIP1的鉴定及镉胁迫响应分析

重金属污染不仅影响土壤有效面积,限制植被分布,也会对食物链和人体健康造成危害,其中镉（Cd）污染尤为突出。选择重金属耐受性强的植物应用于尾矿区的土壤修复亟待进行。构树（Broussonetia papyrifera）是重金属污染土壤的先锋树种,为探明构树响应重金属胁迫的分子机制,本研究从构树中克隆获得1个碱性亮氨酸拉链（basic leucine zipper,bZIP）转录因子（命名为BpbZIP1）,对其基本生物信息、Cd胁迫响应及转化酵母的功能进行分析,预测BpbZIP1响应Cd的功能。结果显示,BpbZIP1基因开放阅读框长1 713 bp,编码的蛋白含570个氨基酸,分子量为62 902.38 Da,等电点为4.62。与拟南芥（Arabidopsis thaliana）AtbZIP1具有较近的进化关系。在150 μmol·L^-1 CdCl₂处理下,BpbZIP1基因能被不同程度的诱导表达,在3 h时BpbZIP1在根中的表达为对照的17.4倍。将BpbZIP1转入酵母能显著提高转基因酵母的抗Cd能力,当浓度高于0.6%时,转基因酵母的生长活力是对照的1.54~1.71倍。以上结果表明BpbZIP1基因能积极响应Cd胁迫,其表达可改善Cd胁迫耐受力,是构树Cd胁迫响应的重要基因。     

烟草NtGSH2基因的克隆及表达特性分析

谷胱甘肽(glutathione,GSH)是生物体内的非蛋白巯基类化合物,具有抗氧化、抗衰老和重金属解毒等重要的生理功能。本研究从烟草(Nicotiana tabacum L.)中克隆到谷胱甘肽合成酶基因NtGSH2,该基因编码555个氨基酸残基的蛋白质。氨基酸序列比对和进化树分析发现,NtGSH2与其他植物同源蛋白具有较高的一致性,且与枸杞(Lycium chinense)LcGSHS/LcGS和番茄(Solanum lycopersicum)SlGSH2归为一类,亲缘关系最近。组织表达模式分析表明,NtGSH2基因在烟草的根、茎、叶、花和种子中均表达,其中在花中的表达量最高,在种子中的表达量最低。实时荧光定量PCR检测表明,NtGSH2受CdCl_2和ZnCl_2诱导表达。将NtGSH2连接到原核表达载体pET32a上,转化获得含有NtGSH2基因的大肠杆菌BL21(DE3)工程菌并成功表达目的蛋白。该研究结果为进一步分析NtGSH2基因功能及谷胱甘肽的生物合成提供了一定的理论依据。     

胡杨谷胱甘肽过氧化物酶PeGPX基因的克隆及转化植株耐盐性分析

胡杨(Populus euphratica Oliv.)具有极强抗盐碱能力。本实验室前期胡杨微阵列芯片数据结果显示:盐胁迫下,胡杨谷胱甘肽过氧化物酶基因(PeGPX)的转录上调,暗示该基因可能对胡杨耐盐性具有一定的作用。为分析 GPX 对植物耐盐性的贡献,本研究以胡杨为材料,利用 RT-PCR 方法克隆了胡杨谷胱甘肽过氧化物酶PeGPX基因,并在烟草中过量表达该基因,以分析谷胱甘肽过氧化物酶活性与植物耐盐性的关系。研究结果显示,实验中克隆的 cDNA (PeGPX)编码谷胱甘肽过氧化物酶,其 ORF 为 693 bp,其蛋白由 231 个氨基酸编码。过量表达 PeGPX 基因的烟草与野生型烟草的耐盐性实验结果显示,野生型烟草植株在加 NaCl(200 mmol/L)的 MS 培养基中生长 15 d 后,无明显的长高,且不长根;而转基因烟草在同样的加盐培养基上,生长基本没有受到抑制,植株生长状态良好,并且能够长根。光合数据显示,在盐胁迫下过量表达 PeGPX 基因烟草的净光合速率受到影响明显小于野生型烟草的净光合速率。酶活数据显示,转基因株系 GPX 酶活与野生型的相比在盐胁迫下活性有非常显著的提高。我们的研究结果说明:过表达 PeGPX 基因使得烟草的耐盐性得到显著提高,这对深入研究PeGPX基因在胡杨耐盐机制中的作用具有重要的意义。高,这对深入研究PeGPX基因在胡杨耐盐机制中的作用具有重要的意义。     

转星星草金属硫蛋白基因烟草的获得及其抗重金属镉能力分析

用农杆菌介导法将星星草金属硫蛋白基因（MD转化烟草,PCR及PCR—Southern检测的结果表明,该基因已导入烟草中。Real-TimePCR检测显示,该基因在转基因后代中的转录水平高于非转基因植株。Cd2＋胁迫下,转基因植株能够正常生长,鲜重、株高、叶绿素含量、Cd2＋含量和SOD活性均高于非转基因植株,表明MT基因的过量表达可提高转基因烟草的抗Cd2＋能力。     

羊草LcPIP基因遗传转化露地菊及其抗盐性鉴定

PIP是重要的水孔蛋白之一,与植物的抗逆性有关。本文用叶盘法将羊草LcPIP遗传转化露地菊火焰,通过常规PCR和GUS染色方法鉴定转基因株系,Real-time PCR检测盐胁迫下转基因和野生植株中CmPIP1和CmPIP2的相对表达量,并测定SOD、POD活性和MDA含量。结果显示,在转LcPIP基因的露地菊植株叶片中,CmPIP1和CmPIP2基因表达量均上升,是野生型植株的2倍;根部的CmPIP1与CmPIP2基因的表达量均上升,CmPIP1上升程度高于CmPIP2。在200 mmol·L~(-1) NaCl的胁迫下,野生型植株中CmPIP1基因表达量明显下降,而转基因植株中CmPIP1基因表达量在12~48 h出现明显的上升;在盐胁迫12 h后,转基因植株中CmPIP2基因表达量上升程度明显高于野生型植株。盐胁迫12 h后,转基因植株的SOD活性提高更为明显。在盐胁迫前期(0~24 h)转基因植株MDA含量增加幅度低于野生型植株;在盐胁迫后期(48~72 h)转基因露地菊POD活性出现明显上升,而野生型露地菊呈下降趋势。     

转油菜素内酯合成基因DET2烟草对NaCI胁迫的反应

通过农杆菌介导法,将含有油菜素内酯合成基因DET2的植物表达栽体pCAMBIA2301-DET2转入烟草,获得转基因烟草植株.用T1代转基因阳性株进行耐NaCl试验,结果显示,NaCl胁迫下转基因烟草、非转基因对照烟草的出苗率、幼苗鲜重、株高及根长均随NaCl浓度增加而下降.但在相同NaCl浓度下,转基因植株鲜重、株高及根长均明显高于非转基因对照烟草,并且转基因植株的丙二醛( MDA)含量低于非转基因植株,诱导蛋白基因P5CS表达高峰出现时间晚于非转基因植株.说明DET2的表达提高了烟草的耐NaCl能力.     

基于菌植互作的植物根际细菌钝化镉作用和机制研究进展

土壤重金属镉(Cd)污染严重危害农产品安全生产,植物根际细菌在钝化土壤Cd和帮助作物抵御Cd胁迫方面发挥重要作用。本文首先概括在修复Cd污染土壤中得到广泛应用的植物根际细菌种类,并从根际细菌直接吸附Cd、调整土壤理化特性、调控土壤微生物群落和其他作用4方面阐述了植物根际细菌对Cd的钝化作用,其次从菌植互作角度阐述植物根系分泌物与根际细菌群落相互影响对土壤Cd的钝化作用。最后展望重金属胁迫下植物根际钝化Cd核心菌群的构建,以在新兴学科与技术的快速发展中探明植物根系-微生物互作体系的分子机制,深入开展植物根际细菌钝化修复重金属污染土壤的理论研究和实践。     

Distinct responses to copper stress in the halophyte Mesembryanthemum crystallinum

Selective gene expression allows the halophyte Mesembryanthemum crystallinum to survive a salt stress. To broaden our understanding of the environmental cues initiating diverse stress responses in this higher plant, unstressed and 0.4 M NaCl‐stressed plants were compared to plants treated with several concentrations of copper (CuSO₄), an increasingly relevant environmental heavy metal pollutant. Comparisons of control and copper‐stressed plants included germination, chlorophyll content, accumulation of proline, heat shock protein (HSP) 60 and a Crassulacean acid metabolism (CAM)‐specific marker enzyme, phospho enol pyruvate carboxylase (PEPCase). In germination and whole plant tests, M. crystallinum was significantly more tolerant to copper than Arabidopsis thaliana. Mature M. crystallinum plants stressed with 50 ppm CuSO₄ for 48 h became dehydrated. These plants produced a 4‐fold increase in proline concentration and accumulated both the CAM‐specific PEPCase and HSP 60 compared to controls. Higher levels of copper stress resulted in a 10‐fold increase in leaf proline content, 10‐fold HSP 60 accumulation but no detectable PEPCase protein compared to unstressed controls. HSP 60 did not accumulate under NaCl stress. Concurrent with copper‐induced genetic responses to stress, copper was accumulated and concentrated in leaves (3 500 ppm). Together, these results suggest that this halophyte copes with copper metal exposure through distinct genetic mechanisms.     

刚毛柽柳ThDREB基因在酵母中的表达及抗逆能力分析

DREB蛋白能特异地与DRE（dehydration responsive element）顺式作用元件结合,从而调控下游多个与逆境相关基因的表达,在植物对多种逆境胁迫的应答反应中起重要调节作用。为了研究刚毛柽柳ThDREB基因是否具有抗逆功能,将ThDREB基因插入到酵母表达载体pYES2中构建成重组载体,转入酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中获得重组型酵母。分别比较转ThDREB基因酵母和转空载体对照酵母在山梨醇、H₂O₂、CdCl₂、NaCl、Na₂CO₃、MgCl₂、-20℃胁迫处理之后的存活能力。结果显示,ThDREB基因能有效提高转基因酵母的抗干旱、盐、碱、氧化、重金属及低温胁迫的能力,表明ThDREB基因可能参与了柽柳多种抗逆调控过程。     

miRNA在植物重金属胁迫应答中的作用

microRNA （miRNA）是一种新型的长度为20~24 nt的非编码RNA,通过对靶基因的表达调节进而参与调控植物体的多种生理代谢活动。重金属是一类重要的环境污染物,严重危害植物的生长发育,甚至导致植物死亡。植物在长期的进化过程中形成了抵御重金属胁迫的多种机制,如miRNA对特定基因转录后水平的调控就在逆境胁迫应答中发挥重要作用。本文综述了植物中参与重金属胁迫应答miRNA的种类及作用机制,为揭示重金属胁迫条件下基因表达调控机制,以及利用基因工程手段改良植物对重金属的耐受性提供了线索和依据。     

硫化氢通过抑制镉离子内流降低拟南芥体内的镉毒性

硫化氢（H₂S）作为一种新兴的气体信号分子,在植物体内主要由半胱氨酸脱巯基酶（CDes）降解半胱氨酸产生。已有报道表明,H₂S信号与植物激素共同作用增强植物的镉（Cd）耐受。然而,H₂S信号响应重金属Cd胁迫的作用机制尚缺乏系统研究。本文以拟南芥为实验材料,从不同水平探究H₂S分子对Cd胁迫诱导氧化应激的保护作用。结果表明,CDes基因表达量和H₂S的产率随CdCl₂浓度升高而逐渐增加。重金属Cd胁迫导致幼苗干重降低约33%、体内过氧化氢显著增加、丙二醛含量升高约110%、超氧化物歧化酶活性增加约100%、谷胱甘肽还原酶活性和过氧化氢酶活性分别下降27%和21%,还原性谷胱甘肽含量随之显著降低。生理浓度NaHS（H₂S供体）预处理显著缓解以上Cd胁迫产生的影响,使恢复到对照水平。同时,H₂S处理可显著下调质膜中Cd转运蛋白（HMA4和IRT1）的表达,同时上调液泡膜中MRP3和CAX2的表达。利用非损伤微测技术测定植物根系Cd²⁺的流动速度和流动方向。结果显示,生理浓度的H2S显著抑制Cd^{2 +}内流,最终表现为植物叶片和根中的Cd含量显著降低,分别下降了15%和38.4%。总之,在Cd胁迫条件下,H₂S信号可激活植物体内的抗氧化酶促和非酶促系统,以清除细胞内H₂O₂。H₂S对Cd²⁺转运和液泡区式化的调节,降低了体内Cd²⁺的浓度,减小Cd毒性对植物生长的影响。为理解农作物应对重金属胁迫的机制提供了新的思路。     

基因工程改良植物重金属抗性与富集能力的研究进展

基于分子水平上对植物吸收、解毒、忍耐以及超富集重金属的几个关键步骤的认识,以及一些功能基因相继在细菌、酵母、植物和动物中被分离、鉴定,近年来,人们利用转基因技术提高植物重金属抗性和富集能力方面已获得进展, 一些功能基因（如gsh1, MerA和ArsC)及其工程植物已显示出植物修复产业化潜力。特别对转基因技术所采取的分子生物学途径、达到的效果以及存在的问题进行了详述,对今后研究的重点和策略进行了探讨。     

Evaluation of Transgenic Poplars Over-Expressing Enzymes of Glutathione Synthesis for Phytoremediation of Cadmium

Abstract: Recently, phytoremediation of soils polluted with heavy metals has received a lot of attention. Since glutathione (GSH) and its derivatives (e.g., phytochelatins) play a major role in plant defence against environmental pollutants, we tested the effects of over-expression of bacterial genes for GSH synthesis in poplar on cadmium accumulation. A pilot experiment with CdCl₂ in hydroponics revealed that poplars over-expressing γ-glutamylcysteine synthetase (γ-ECS) accumulated significantly more Cd in root tissue than wild type or glutathione synthetase over-expressing poplars. To test the partitioning of Cd in different organs, poplar lines over-expressing γ-ECS in the cytosol and in chloroplasts were treated with 0.2 mM CdCl₂ in hydroponics. Significant amounts of Cd were translocated to leaves, but significant differences in Cd accumulation were not observed between transgenic and wild type plants. To evaluate these lines for large-scale phytoremediation of cadmium, plants were treated with 2 mM Cd in soil. Over a four-week period, the poplar plants were able to accumulate up to 5.3 mg Cd. Most remarkably, in young leaves of both transgenic lines, Cd was accumulated to concentrations 2.5 - 3 times higher than in the wild type. The increased allocation of cadmium to the young leaves represents a potentional advantage for the phytoremediation process using the same plants over several vegetation periods. The use of transgenic poplar lines with enhanced glutathione production capacity seems to be of particular advantage in highly polluted soils.     

西伯利亚蓼非特异性脂质转移蛋白基因PsnsLTP的功能分析

通过在农杆菌介导下,利用西伯利亚蓼非特异性脂质转移蛋白基因(植物表达载体：pROKII-PsnsLTP)对烟草进行遗传转化,经卡那霉素抗性分化筛选及PCR鉴定,获得6个转基因烟草株系。接种烟草炭疽病病菌和猝倒病病菌后观察转基因植株和野生型的表型差异,在NaCl、CdCl₂、7.5% PEG6000的胁迫下进行表型观察和生理指标的测定。结果显示：与野生型烟草相比,T1代转基因植株已具有较强的耐烟草炭疽病和猝倒病的能力;其超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）活性显著增强,丙二醛（MAD）含量显著降低,且幼苗具有较好的生长性状。由此证明,西伯利亚蓼非特异性脂质转移蛋白PsnsLTP增加了转基因烟草抵御生物胁迫和非生物胁迫的能力,这些工作为深入研究PsnsLTP基因的抗逆机制提供了参考。     

How Plants Cope with Cadmium: Staking All on Metabolism and Gene Expression

Environmental pollullon is one of the major problems for human health. Toxic heavy metals are normally present as soil constituents or can also be spread out in the environment by human activity and agricultural techniques. Soil contamination by heavy metals as cadmium, highlights two main aspects: on one side they interfere with the life cycle of plants and therefore reduce crop yields, and on the other hand, once adsorbed and accumulated into the plant tissues, they enter the food chain poisoning animals and humans. Considering this point of view, understanding the mechanism by which plants handle heavy metal exposure, In particular cadmium stress, is a primary goal of plant-blotechnology research or plant breeders whose aim is to create plants that are able to recover high amounts of heavy metals, which can be used for phytoremediation, or identify crop varieties that do not accumulate toxic metal in grains or fruits. In this review we focus on the main symptoms of cadmium toxicity both on root apparatus and shoots. We elucidate the mechanisms that plants activate to prevent absorption or to detoxify toxic metal ions, such as synthesis of phytochelatins, metallothioneins and enzymes involved in stress response. Finally we consider new plant-biotechnology applications that can be applied for phytoremediation.     

How Plants Cope with Cadmium: Staking All on Metabolism and Gene Expression

Environmental pollullon is one of the major problems for human health. Toxic heavy metals are normally present as soil constituents or can also be spread out in the environment by human activity and agricultural techniques. Soil contamination by heavy metals as cadmium, highlights two main aspects: on one side they interfere with the life cycle of plants and therefore reduce crop yields, and on the other hand, once adsorbed and accumulated into the plant tissues, they enter the food chain poisoning animals and humans. Considering this point of view, understanding the mechanism by which plants handle heavy metal exposure, In particular cadmium stress, is a primary goal of plant-blotechnology research or plant breeders whose aim is to create plants that are able to recover high amounts of heavy metals, which can be used for phytoremediation, or identify crop varieties that do not accumulate toxic metal in grains or fruits. In this review we focus on the main symptoms of cadmium toxicity both on root apparatus and shoots. We elucidate the mechanisms that plants activate to prevent absorption or to detoxify toxic metal ions, such as synthesis of phytochelatins, metallothioneins and enzymes involved in stress response. Finally we consider new plant-biotechnology applications that can be applied for phytoremediation.