大灰象甲实时定量PCR内参基因的筛选

【目的】筛选出适合分析大灰象甲Sympiezomias velatus成虫不同组织中基因表达水平的内参基因。【方法】利用转录组测序技术获得大灰象甲管家基因序列作为候选内参基因,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析候选基因在大灰象甲雌雄成虫触角、头、胸、腹和足中的表达量;并利用geNorm, NormFinder和BestKeeper软件及在线工具RefFinder评价候选基因的表达稳定性。以大灰象甲气味结合蛋白1(odorant bindng protein 1, OBP1)基因为目标基因验证候选基因在大灰象甲成虫不同组织中的表达稳定性。【结果】基于大灰象甲转录组数据首次鉴定得到β-肌动蛋白基因(ACT)、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)、18S核糖体RNA基因(18S rRNA)、60S核糖体蛋白L12基因(RPL12)、60S核糖体蛋白L32基因(RPL32)、40S核糖体蛋白S20基因(RPS20)、延伸因子2基因(EF2)、α-微管蛋白基因(TUA)和β-微管蛋白基因(TUB)共9个管家基因序列。geNorm分析结果显示,RPL12和RPS20是最稳定表达的内参基因,而BestKeeper和NormFinder分析结果显示最稳定表达的内参基因分别是TUA和TUB。综合各分析方法得出9个候选基因中TUB,TUA,RPS20和RPL12是最稳定表达的内参基因,而18S rRNA,ACT和GAPDH这3个广泛应用的内参基因则表现出最低的表达稳定性。最后以OBP1为目标基因对稳定性不同的4个候选基因进行稳定性验证,发现以TUB和RPL12为内参基因,OBP1在成虫不同组织之间的表达模式基本一致;而以RPL32为内参基因,表达模式与应用TUB作为内参基因时稍有不同,使用18S rRNA作为内参基因得到的OBP1表达模式则与应用TUB作为内参基因时的完全不一致。【结论】TUB,TUA,RPS20和RPL12可以作为分析大灰象甲成虫不同组织中基因表达水平的内参基因,为后续基因表达研究奠定了基础。     

Bt毒素诱导下小菜蛾实时定量PCR 内参基因的筛选

【目的】筛选出Bt毒素诱导后的小菜蛾Plutella xylostella (L.)的实时定量PCR最适内参基因。【方法】选取核糖体18S rRNA (18S rRNA)、 肌动蛋白（ACTB）、 延伸因子（EF1）、3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）、 核糖体蛋白L32 (RPL32)、 核糖体蛋白S13 （RPS13）、 核糖体蛋白S20 （RPS20）和β-微管蛋白(TUB)基因作为候选内参基因, 以geNorm、 Normfinder和BestKeeper软件分析这8个基因在Bt毒素诱导后的小菜蛾不同品系中肠组织中的表达稳定性。并应用筛选出来的内参基因分析小菜蛾氨肽酶2（aminopeptidase N2, APN2）基因的表达水平。【结果】geNorm软件以RPS13和EF1为最稳定内参基因, NormFinder和BestKeeper软件均以RPS13和RPL32为最稳定基因。使用3种不同内参基因分析Bt毒素诱导后的小菜蛾Bt抗性和敏感品系中ANP2表达水平时, 新的内参基因EF1和传统内参基因RPL32表现了良好的稳定性, 二者作为标准化因子, ANP2表达量结果基本一致, 而使用18S rRNA作为内参基因, 却导致部分表达量分析结果有所误差。【结论】筛选出PRS13,RPL32和EF1可以作为小菜蛾某些试验条件下的内参基因, 对小菜蛾基因表达研究奠定了一定基础, 也对其他昆虫内参基因的筛选具有参考价值。     

五龄飞蝗不同发育时间实时定量PCR内参基因的筛选

【目的】筛选5龄飞蝗不同发育时间的最适内参基因,为相关研究提供基础数据。【方法】本文选取β-肌动蛋白(β-actin)、延长因子(EF-1α)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、核糖体蛋白49(RP49)、α-微管蛋白(α-Tubulin)和18S核糖体RNA(18S rRNA)基因作为候选内参基因,运用实时定量PCR(qPCR)方法研究各基因在5龄飞蝗不同发育时间的相对表达量,用geNorm与Normfmder软件分析这6个基因表达稳定性。【结果】geNorm分析结果显示6个内参基因表达稳定度M值顺序为:β-actin(0.3720)>RP49(0.3750)>α-Tubulin(0.4030)>18S rRNA(0.4270)>EF-1α(0.4970)>GAPDH(0.6040)。M值越小表示基因表达稳定度越高,同时geNorm软件以标准化因子配对差异值(Pairwise variations)0.15默认为取舍值,由于V2/3=0.098<0.15,所以最适内参基因数目为2个。运用NormFinder软件也得出相似的结果。【结论】β-actin与RP49为5龄飞蝗不同发育时间的最适内参基因。     

黑木耳实时荧光定量PCR内参基因的筛选

黑木耳Auricularia heimuer是我国主要栽培的食用菌之一,具有较高的经济价值和生态价值。本研究以黑木耳不同菌株（A14、A137和A12）和不同生育期的样品（菌丝体、原基和子实体）为实验材料,提取RNA,反转录成cDNA,在全基因组注释结果的基础上,选择12个候选内参基因（APRTase、β-TUB、RPL2、EF-1a、EF-2、PGI、PGM、H ⁺-ATPase、Tspd、TUB-1a、18S rRNA和28S rRNA）并设计跨内含子的引物,采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术进行扩增,利用geNorm、NormFinder、BestKeeper和ΔCt算法以及综合评价软件RefFinder,筛选适宜的内参基因。结果表明18S rRNA、β-TUB、EF1-a和28S rRNA适宜作为不同菌株的内参基因,APRTase、18S rRNA和28S rRNA适宜作为不同生育期的内参基因。     

光裸星虫(Sipunculus nudus)不同发育时期卵细胞内参基因的筛选

内参基因的选择对功能基因表达量的归一化处理尤为重要。为了筛选出光裸星虫不同发育时期卵子的最适内参基因,利用qRT-PCR测定了甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、肽基脯氨酰顺反异构酶A(PPIA)、60S核糖体蛋白L10(60S-L10)、铁蛋白(Ferritin)、β-肌动蛋白(β-actin)、泛素C(UBC)、真核生物翻译起始因子(eIF)、NADH脱氢酶(NDH)、28S核糖体RNA(28S)、TATA盒结合蛋白(TBP)、18S核糖体RNA(18S)和琥珀酸脱氢酶A亚基(SDHA)共12个候选内参基因的表达水平,并通过4个程序(geNorm,NormFinder,BestKeeper以及RefFinder)综合分析了各基因的表达稳定性。结果显示:(1)12个候选内参基因均能获得特异性扩增产物,但表达情况各异;(2)对候选内参基因进行综合打分,得到候选内参基因稳定性排名为18S>GAPDH>28S>β-actin>UBC>e IF>NDH|TBP>PPIA|Ferritin>60S-L10>SDHA。18S和GAPDH稳定性较好,可作为不同发育时期卵细胞基因表达研究的单内参基因,或最优组合内参基因。     

冬虫夏草菌实时荧光定量PCR内参基因的筛选

以冬虫夏草单子囊孢子分离得到的菌株TZ8-1的3种菌丝形态为实验材料,提取RNA,经反转录获取cDNA,选择了11个持家基因为候选内参基因（18S rRNA、APRTase、β-TUB、RPL2、EF1-α、PGI、PGM、H⁺-ATPase、ACT1、UBQ和GAPDH）,根据该菌基因组注释结果来设计引物,采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术进行定量扩增,利用geNorm、NormFinder和BestKeeper算法程序进行表达稳定性评估,并用RefFinder对评估结果进行综合排比,最终筛选得到了最适内参基因。结果表明,所选取的11个候选内参基因均可作为冬虫夏草菌菌丝体时期的内参基因,稳定性最好的3个内参基因分别是UBQ、PGE和ACT1,稳定性较差的3个内参基因分别是GAPDH、RPL2和β-TUB。     

山羊不同组织器官的内参基因筛选

本研究通过比较9个内参基因在山羊不同组织中的表达水平进而确定最适合研究山羊组织表达的内参基因。本试验以简州大耳羊为试验材料,利用实时荧光定量PCR技术分析9个内参基因(GAPDH,PPIA,18S rRNA,PPIB,UXT,RPLP0,ACTB,EIF3K和TBP)在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、大肠、瘤胃、背最长肌和皮下脂肪等组织中的表达差异情况,并利用geNorm、NormFinder和BestKeeper等程序分析了它们的表达稳定性。geNorm和NormFinder程序一致显示TBP表达最稳定,其次是UXT和RPLP0;BestKeeper分析显示18S rRNA表达最为稳定,其次为TBP和ACTB;3个程序一致认为GAPDH表达稳定性最差。综合3个程序分析得出TBP最适合作为山羊组织中的内参基因,其次为UXT和RPLP0,GAPDH表达稳定性最差,不适合作为山羊组织内参,这为后续研究其他目的基因在山羊组织器官中的表达模式提供数据保障。     

紫玉兰‘红元宝'花芽分化阶段基因定量分析的内参基因筛选

为筛选紫玉兰‘红元宝’(Magnolia liliflora‘Hongyuanbao’)二次花芽分化阶段稳定表达的内参基因,该研究以‘红元宝’不同花芽分化时期的花芽和叶为材料,基于转录组数据,筛选出8个候选内参基因,即泛素酶基因(UBC)、肌动蛋白(ACT)、微管蛋白β链(β-TUB)、微管蛋白β-5链(β-TUB5)、微管蛋白α-3链(α-TUB3)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PEPC)、酰基载体蛋白2(ACP2)、酰基载体蛋白3(ACP3)。运用Primer Premier 5设计引物,简单克隆和熔解曲线验证引物特异性;利用qRT-PCR技术检测各个候选内参基因的表达情况,结合GeNorm、NormFinder、BestKeeper软件和RefFinder在线工具综合评估其表达稳定性,并通过目的基因TFL1的表达分析验证其可靠性。结果表明:(1)8个候选内参基因条带位置正确,熔解曲线呈单一峰,说明引物特异性良好。(2)β-TUB、β-TUB5和α-TUB3是‘红元宝’不同花芽分化时期较为稳定的内参基因,而UBC和ACT为稳定性最低的内参基因。(3)β-TUB5、α-TUB3、β-TUB及其组合的相对表达量趋于一致,而ACT和UBC并未对目的基因的表达量进行有效的标准化。因此,β-TUB、β-TUB5和α-TUB3可作为‘红元宝’二次花芽分化研究中稳定表达的内参基因。该研究结果将为木兰属植物二次成花分子调控机制研究提供依据。     

梨小食心虫实时荧光定量PCR内参基因的筛选

【目的】本研究旨在探明梨小食心虫Grapholita molesta在不同发育阶段、成虫不同组织以及不同浓度的3种杀虫剂处理后成虫中稳定表达的内参基因,为后续对梨小食心虫目的基因表达的研究奠定基础。【方法】基于梨小食心虫转录组数据筛选10个候选内参基因(β-actin, 18S rRNA,β-tubulin,EF-1α,RPL13,RPL32,RSPL40,UBC7,α-tubulin和RPS20);通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)测定候选内参基因在梨小食心虫不同发育阶段(卵、1-5龄幼虫、蛹和成虫)、成虫不同组织(头、前肠、中肠、后肠、脂肪体、马氏管、精巢和卵巢)以及不同浓度的3种杀虫剂(阿维菌素：19.819, 72.897和179.663μg/mL;吡虫啉：17.638, 163.323和762.986μg/mL以及高效氯氟氰菊酯：33.791, 96.123和198.282μg/mL)通过玻璃管药膜法处理后成虫中的表达量;利用geNorm, NormFinder,ΔCt, BestKeeper和RefFinder对10个候选内参基因的表达稳定性进行评价。选择梨小食心虫细...     

牧草盲蝽实时定量PCR内参基因的筛选

【目的】筛选出适合牧草盲蝽Lygus pratensis在不同条件下稳定表达的内参基因。【方法】选取编码牧草盲蝽α-微管蛋白、β-微管蛋白、肌动蛋白、延伸因子、琥珀酸脱氢酶复合体A、泛素、转录起始因子TFIID亚基、谷胱甘肽S-转移酶、核糖体蛋白L32及TATA盒结合蛋白的10条基因为候选内参基因,采用qRT-PCR技术测定其在牧草盲蝽不同性别成虫、成虫不同组织、不同龄期、对功夫菊酯不同抗性成虫、不同温度及不同杀虫剂分别处理后的成虫共6类样品中的表达量;采用BestKeeper, geNorm, NormFinder及RefFinder 4种计算程序对各候选基因的表达稳定性进行评价。【结果】依据获得的有效qRT-PCR数据前提,利用不同计算方法综合分析得出：在牧草盲蝽成虫不同组织中和对功夫菊酯不同抗性成虫中最稳定表达的内参基因均为RPL32;不同温度处理、不同性别成虫中、不同杀虫剂处理和不同龄期牧草盲蝽中最稳定表达的内参基因分别为UBQ, SDHA, β-tubulin和TAF。通过geNorm软件判断配对变异数确定的内参基因最佳数目,结合RefFinder对基因表达稳定性综合排序的结果可得：牧草盲蝽不同成虫组织中、不同性别成虫中、不同龄期、对功夫菊酯不同抗性成虫中、不同温度及杀虫剂分别处理的成虫等各组的最优内参基因组合分别为RPL32+TAF, SDHA+GST, TAF+GST+UBQ, RPL32+GST, UBQ+ACT+β-tubulin和β-tubulin+TAF+RPL32。【结论】本研究获得的牧草盲蝽在不同条件下表达最稳定及最适内参基因组合,都可用于后续的基因定量表达研究。     

六种藓类植物茎的比较解剖学研究

通过对6种藓类植物,即褶叶青藓(Brachythecium salebrosum(Web.et Mohr.)B.S.G.)、湿地匐灯藓(Plagiomnium acutum(Lindb.)Kop.)、侧枝匐灯藓(Plagiomnium maximoviczii(Lindb.)Kop.)、大凤尾藓(Fissidensnobilis Griff.)、大羽藓(Thuidium cymbifolium(Doz.et Molk.)B.S.G.)和大灰藓(Hypnum plumaeforme Wils.)嫩茎和老茎的石蜡切片和显微观察发现,同一藓类植株的嫩茎和老茎,茎结构稳定,不同种藓类植物茎横切面具有不同特征.植物体茎横切面形状、表层细胞的层数、细胞大小和细胞壁厚薄、皮层细胞大小和形状、中轴的有无以及比例等特征可以作为藓类植物的分科分类依据之一.