水稻新基因OsRwp34在大肠杆菌中表达的毒害作用

在水稻高温诱导cDNA文库中克隆了一个新的水稻基因O sRwp34,同源性分析表明O sRwp34是一典型的孤儿基因。为了研究O sRwp34的功能,构建了O sRwp34的表达载体pET-28(a)OsRwp34,并转化大肠杆菌菌株BL21(DE3),用IPTG诱导并定时从培养液中取样以检测OD600值和用平板记数法测定活菌数,结果发现在诱导30 m in后宿主菌开始大量死亡,表明O sRwp34的表达产物使宿主菌死亡。随后构建了1个N末端缺失15个氨基酸残基和2个C末端分别缺失12和47个氨基酸残基的O sRwp34缺失体,IPTG诱导后都没有出现毒性作用,推测N和C末端氨基酸残基的同时存在是OsRwp34的毒性作用所必须的。其详细机理有待进一步研究。     

水稻Osgrp-2基因的结构、表达特性和染色体定位

富含甘氨酸的蛋白质(GRP)是植物细胞壁的一种重要结构蛋白, GRP基因的表达具有组织特异性, 受发育阶段和多种环境因素的调控, 因此GRP基因为植物基因的表达调控研究提供了一个良好的模式. 从水稻基因组文库中克隆了一个新的GRP基因Osgrp-2, 测定了其序列, 并通过5′RACE实验确定了该基因的转录起始位点, 从而界定了约2.4 kb的启动子序列. 还详细分析了Osgrp-2在水稻中的时空表达特性和损伤诱导表达特性. 最后, 将Osgrp-2定位于水稻的第10号染色体上.     

农杆菌介导的苏云金杆菌抗虫基因cryIA(b)和cryIA(c)在水稻中的遗传转化及蛋白表达

通过农杆菌介导法用含有抗潮霉素和GUS基因的双元载体将杀虫结晶蛋白基因cryIA(b)和cryIA(c)导入到籼、粳稻幼穗愈伤组织中,然后经过在含有不同浓度潮霉素的培养基上进行数次筛选,获得一批Bt转基因株。经PCR、Southern杂交及Western印迹分析证实此二基因已整合进水稻中,饲虫试验结果表明,转基因株具有100%杀虫率。     

水稻矮秆基因iga-1的序列变异和表达分析

该研究以水稻矮秆突变体cha-2为材料,对控制其表型性状的iga-1基因进行候选基因筛选,利用基因注释数据库对定位区间进行候选基因预测,通过ORF及其上下游调控区域的测序、序列比对及关键元件分析进行序列变异研究,半定量PCR检测目标基因的表达模式,明确其在基因序列、表达模式的变异,探讨其分子遗传调控机理。结果显示:(1)在隐性核基因iga-1精细定位基础上预测得到3个ORF,其中2个编码dnaJ分子伴侣(含有dnaJ结构域的蛋白),分别是LOC_Os05g26902和LOC_Os05g26926;另外1个为已克隆的水稻矮秆基因RGA1(LOC_Os05g26890)。(2)ORF序列分析表明矮秆突变体cha-2与野生型仅在RGA1基因座存在SNP变异,但未造成氨基酸编码的改变。(3)表达模式分析发现,矮秆突变体cha-2的RGA1基因在种子萌发期、二叶期、四叶期和分蘖期等4个发育时期均不表达,且在‘中花11’、‘石狩白茅’的遗传背景下稳定遗传,均显现出失活状态,初步确定RGA1为iga-1的候选基因。(4)对RGA1基因上游和下游调控转录关键区进行测序结果表明,突变体cha-2存在865bp的大片段缺失,包括第1外显子、部分第1内含子和转录起始上游区域。研究推断,突变体cha-2的矮秆基因iga-1正是没有活性的RGA1基因,其转录关键区域的大片段缺失,导致无法正常转录表达。     

外源基因在大肠杆菌中表达研究进展

近年来,基因工程技术的迅速发展,大量有价值的蛋白质大肠杆菌中获得了高表达。多种表达系统的完善与发展,及蛋白质分离纯化技术的提高,异源蛋白的产量与纯度已不再是困扰人们的主要问题,人们开始更多地关注异源蛋白的活性,比活性及异源蛋白的正确性,完整性。随着这些问题的解决,重组蛋白的应用才能真正走向成熟。     

对水稻MADS-box基因M79的表达模式和功能的分析

利用简并引物和T引物,通过RT-PCR, 从水稻减数分裂时期的小花中扩增并克隆出一个MADS-box基因M79,序列分析表明M79与OsMADS7在DNA水平上同源性达到97.5%,推导的蛋白序列同源性却只有91.0%.M79的转录本有5个不同的 poly (A)添加位点,它同OsMADS7一样在水稻中为单拷贝基因,也定位在水稻的第8号染色体上.M79仅在花器官中表达,其表达从减数分裂前期开始贯穿整个花的发育各时期,并且成熟雌蕊中的表达量比成熟雄蕊中多.对两代转基因水稻的分析表明,M79涉及水稻的花时控制,异位表达可使烟草的花期提前,并且还可能参与控制营养生长中的分枝以形成更多的花芽.     

含VHb基因和GFMcryIA基因的双价基因植物高效表达载体的构建

将人工合成的、密码子优化后的透明颤菌血红蛋白基因与人工合成的GFMcryIA基因构建成双价基因植物高效表达载体PGBI4ASVHBBt,vgbM基因表达盒中含2个增强子的35S启动子、Ω前导序列、Kozak序列、多联终止密码子及Nos终止子;Bt基因表达盒中,除含有以上提高转录和翻译的调控元件外,还包含有正确切割、加工序列、Poly(A)信号序列。利用根癌农杆菌介导转化烟草,获得了转基因植株;PCR及Southern blot检测,证实了双价基因在烟草基因组中的整合;Western blot检测证实了vgbM基因在转基因烟草中的表达;杀虫实验表明GFMcryIA基因也表达出活性毒蛋白。     

大豆中L34基因的克隆与表达分析

目的:采用分子手段试图分离与大豆种子低温吸胀相关的基因.方法:利用cDNA-AFLP(cDNA-amplified fragment length polymorphism)和RACE技术从大豆种子胚轴中克隆到一个编码132 kD的全长核糖体蛋白基因,命名为SOL34.结果:序列分析表明,SOL34和苜蓿(gi | 113205273 |)、茄科植物(gi | 48057670 |)及拟南芥(gi | 2500376 |)中L34蛋白基因的同源性分别为95%、95%和90%.半定量RT-PCR结果表明:大豆种子在4℃下吸胀24h内,胚轴中的SOL34被诱导表达,其中当种子低温吸胀6h,SOL34表达量升高非常明显,18h的表达量最大,24h表达量和18h相似;SOL34在大豆不同部位的表达不同,4叶期的大豆幼苗经过低温处理后,根尖中SOL34的表达比非处理材料增强约5倍,同时比胚轴中高约2倍;但是在叶片中,SOL34表达量并没有受到温度的影响,表达量也很弱,说明SOL34在叶片中是组成型表达.结论:结果分析表明,SOL34可能和大豆根的代谢有关.     

重组大肠杆菌表达水稻白叶枯病菌FtsZ蛋白

旨在通过现代分子生物学技术制备水稻白叶枯病菌FtsZ蛋白。以水稻白叶枯病菌总DNA为模板,采用巢式PCR方法扩增获得水稻白叶枯病菌fts Z基因,构建fts Z基因的表达载体p ET-22b-ftsZ,转化表达宿主E.coli BL21后,经PCR、Nde I/Xho I双酶切及测序鉴定、阳性克隆子经IPTG诱导表达,融合蛋白经镍柱纯化后,通过SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定。结果显示,水稻白叶枯病菌ftsZ基因的重组表达载体构建成功,且阳性克隆子在IPTG的诱导下表达了Fts Z-6×His融合蛋白,并通过镍柱纯化获得了电泳纯的Fts Z-6×His融合蛋白。     

水稻谷氨酰半胱氨酸合成酶基因的结构和表达分析

利用该实验室T-DNA标签的编号为L395的水稻突变体,克隆了一个编码水稻谷胱苷肽(GSH)合成途径中关键酶即谷氨酰半胱氨酸合成酶(GCs)的基因,将其命名为OsGCS(Genbank accession No.AJ508915).该基因位于水稻第五染色体上,OsGCS基因含有15个外显子和14个内含子,编码492个氨基酸.该基因与拟南芥的GCS基因相比较,编码区域同源性较高,而启动子区域的序列没有显著的相似性.通过RT-PCR的方法确定OsGCS基因的转录起始位点可能位于翻译起始位点(ATG)上游211bp处.在L395突变体中,T-DNA是单拷贝形式插入在OsGCS基因的第二内含子和外显子连接处,并且造成了3个碱基的缺失.在重金属耐受性、OsGCS基因表达以及体内GsH含量方面突变体L395和对照中花11之间没有明显的差别.     

Genetic analysis and gene mapping of a rice few-tillering mutant in early backcross populations ( Oryza sativa L.)

A rice mutant,G069, characteristic of few tiller numbers, was found in anther culture progeny from theF ₁ hybrid between anindica-japonica cross, Gui630×02428. The mutant has another two major features: delayed tillering development and yellowing apex and margin on the mature leaves. As a donor parent,G069 was further backcrossed with the recurrent parent,02428, for two turns to develop aBC ₂F₂ population. Genetic analysis in theBC ₂F₂ population showed that the traits of few-tillering and yellowing apex and margin on the mature leaves were controlled by one recessive gene. A pool of equally mixed genomic DNA, from few-tillering individual plants inBC ₂F₂, was constructed to screen polymorphism with simple sequence repeat (SSR) markers in comparison with the02428 genome. One SSR marker and three restriction fragment length polymorphism (RFLP) markers were found possibly linked with the recessive gene. By using these markers, the gene of few-tillering was mapped on chromosome 2 between RFLP marker C424 and S13984 with a genetic distance of 2.4 cM and 0.6 cM, respectively. The gene is designatedft1.     

一种构建基因组文库的改进方法

构建基因组文库是一项非常基础和重要的工作。但利用传统方法构建基因组文库存在操作步骤繁琐、背景高等问题。为了解决这些问题,对传统构建文库的方法进行了改进。由于Ear I位点经酶切后突出3个可变碱基,经过设计可使酶切后的两个粘端无法匹配,从而防止载体环化,所以用两个Ear I位点作为克隆位点。基因片段是通过用Sau3AI部分酶切基因组总DNA,并在部分酶切片段的3`凹端补一个碱基G获得,因此片段无法串连或环化。本实验构建了基于上述改进的ARS探针载体pHBM803/Trp,并分别用改进方法和传统方法构建水稻基因组文库进行比较。实验结果表明,经过上述两点改进可使文库质量大大提高。     

具有增强蛋白质表达活性序列ER3的筛选及其功能区域的初步鉴定

目的:利用构建的增强子样序列筛选载体,筛选在大肠杆菌中增强外源蛋白质表达的序列,并利用删除突变体初步鉴定其功能区域。方法:以氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因序列与人乳头瘤病毒(HPV)主要衣壳蛋白基因L1的截短序列L11连接作为报告基因,从采集的样品中筛选增强子样序列,通过蛋白质表达来检测其增强活性,并通过构建删除突变体来初步鉴定其功能区域。结果:成功筛选到一条增强子样序列,可使检测载体氯霉素抗体提高11倍,融合蛋白表达水平提高2.26倍,其功能区域主要集中在1~265bp。结论:从收集的样品中成功筛选出一个增强子序列,能提高外源基因在大肠杆菌中的表达。     

A calcium- and phospholipid-dependent protein kinase from rice (Oryza sativa) leaves

Protein kinases in plants have not been examined in detail, but protein phosphorylation has been shown to be essential for regulating plant growth via the signal transduction system. A Ca²⁺- and phospholipid-dependent protein kinase, possibly involved in the intracellular signal transduction system from rice leaves, was partially purified by sequential chromatography on DE52, Phenyl Superose and Superose 12. This protein kinase phosphorylated the substrate, histone III-S, in the presence of Ca²⁺ and phosphatidylserine. The apparent molecular mass of the Ca²⁺- and phosphatidylserine-dependent protein kinase (Ca²⁺/PS PK), determined by phosphorylation in SDS-polyacrylamide gel containing histone III-S, was 50 kDa. The protein kinase differed from Ca²⁺-dependent protein kinase (CDPK) in rice leaves in that Ca²⁺/PS PK showed phospholipid dependency and the molecular mass of Ca²⁺/PS PK exceeded that of CDPK. Investigations were carried out on changes in Ca²⁺/PS PK and CDPK activity in the cytosolic and membrane fractions during germination. The maximum activity of Ca²⁺/PS PK in the cytosolic fraction was observed before imbibition and that of CDPK in the membrane fraction was noted at 6 days following imbibition. Protein kinases are likely to regulate plant growth through protein phosphorylation.     

水稻蔗糖转运基因家族研究进展

蔗糖是韧皮部同化碳运输的主要形式,植物蔗糖转运体(SUT,Sucrose transporters)在参与植物碳素分配中起着重要的作用.编码SUT蛋白的基因在许多双子叶和单子叶植物中都已被分离.目前已经在水稻中鉴定出了5个蔗糖共运体(Sucrose symporter)基因家族成员.对这5个成员在水稻中的鉴定、克隆和表达分析,以及其蛋白结构、分类与进化进行了综述.这些信息可用于探索杂交稻高产的同化物分配和运输的分子原因.     

水稻花发育的分子生物学研究进展

水稻是世界上最重要的粮食作为之一,也是单子叶植物发育生物学研究较理想的模式植物。水稻花器官还是粮食赖以形成的基础。对水稻花发育的研究已开始成为植物分子遗传学的一个新的焦点。近年来有关水稻花发育基因调控的研究已取得了长足的进展,本文从水稻花的诱导、花分生组织的形成和花器官的发育三个方面综述近年来国内外的研究进展。Abstract:Rice (Oryza sativa L.) is not only one of the most important food crops in the world,but also a model plant for study of molecular developmental biology in monocots.In addition,the rice floral organs provide the basis for grain formation.Study of rice floral development has become a new focus of plant molecular genetics.Recently,notable progress has been made in study of gene regulation in rice floral development.In the review,genetic and molecular mechanisms of floral induction,floral meristem formation,and floral organ development in rice are summarized.     

对水稻4号染色体一个编码S位点相关的受体样蛋白激酶基因簇的分析

通过对水稻(Oryza sativa L.) 4号染色体一段323 kb 的序列测定和分析,在其中108 kb的区域内发现了一个由14个编码S位点相关的受体样蛋白激酶(SRK)基因组成的基因簇.RT-PCR实验证明了这14个基因中有9个基因表达,并且这9个基因有不同的表达模式: 其中2个基因主要在生殖器官中表达, 而另外7个基因在水稻的营养和生殖器官中均有表达.对这些基因的预测的氨基酸序列进行分析表明他们的细胞外受体部分均和甘蓝的SLG蛋白高度同源,而细胞内的激酶区都包含有丝氨酸/苏氨酸激酶中特异的氨基酸.