人源抗转铁蛋白受体单链抗体的筛选及其构建与表达

目的:在人源单链抗体库中筛选抗人转铁蛋白受体(TfR)单链抗体(scFv)。方法:人源展示型抗体库质粒转染293T细胞,通过第一轮流式细胞分选得到比例为0.2%的阳性细胞,提取质粒并扩增,得到的质粒转染293T细胞作为下一轮筛选所需抗体库;第二轮分选时降低抗原浓度,最后得到2个候选的scFv序列。经序列分析,选择1号单链抗体基因,利用基因工程技术构建分泌型表达质粒,转染293E细胞并通过镍亲和层析纯化获得单链抗体蛋白,经Forte Bio Octet进一步测定单链抗体蛋白的亲和力。结果:经过2轮筛选获得了全新的抗TfR单链抗体序列,构建并表达了该单链抗体蛋白,该单链抗体与TfR的亲和力常数为5.57×10-7。结论:从展示型人源scFv抗体库中获得了全新的抗TfR单链抗体,该单链抗体与TfR具有较好的亲和力。     

人源性抗bFGF单链抗体表达载体的构建与酵母表达

为了提高人源性抗bFGF抗体的表达量,从噬菌体抗体库筛选出的人源性抗bFGF抗体基因中亚克隆单链抗体(single chain fragment variable,ScFv)基因,并将其构建到酵母表达载体pPICZαA中。表达载体质粒经线性化后,电转化法转化至毕赤酵母GS115中,甲醇诱导表达。表达产物经镍离子亲和层析和阴离子交换层析纯化,并检测其生物学活性。酶切鉴定结果显示人源性的酵母表达载体构建成功。SDS-PAGE和Western blot结果显示,抗bFGF单链抗体获得了高效表达,表达量可达124mg/L,目的蛋白大小为36 kDa左右。通过两步纯化方案,目的蛋白的纯度可达95%以上。ELISA结果显示纯化的目的蛋白可与bFGF特异性结合。CCK8检测结果显示,纯化的抗bFGF单链抗体可剂量依赖性地抑制人肺腺癌细胞株A549的增殖。研究结果表明在毕赤酵母中可获得人源性抗bFGF单链抗体高效表达,表达产物具有很好的生物学活性。     

人源抗体筛选和表达载体的构建

目的:构建一个可供抗体CDR(决定簇互补区)进行自由替换、筛选、表达的通用载体,并对其生物学功能进行鉴定.方法:在已构建好的具有Fc段的完全人源抗狂犬病病毒抗体表达栽体基础上,利用PCR介导的定点突变技术,引入2个可供CDR3区进行自由替换的限制性酶切位点,构建出通用表达载体.体外合成人源、鼠源抗乳腺癌Her2抗体的CDR3区,克隆至已构建的通用载体,在毕赤酵母中诱导表达.应用ELISA和Western Blotting技术对亲本抗体和新抗体进行生物学及免疫学分析.结果:PCR、Western Blotting等试验表明具有Her2抗原结合活性的人源和鼠源突变型抗体获得成功表达,通过对表达产物的免疫学及功能学检测证明所表达出的抗体具有抗原中和活性,而且鼠源抗体的活性要稍高于人源抗体.结论:成功构建了可用于功能性抗体筛选和表达的通用载体,对抗体的体外亲和力成熟及抗体的人源化有重要意义.     

抗乙型脑炎病毒人源化单链抗体的构建及其表达

单克隆抗体以其特异性强、均～性好的特点在疾病治疗中已显示了良好的应用前景,但由f目前所用单抗多为鼠源性抗体,进行治疗时,由f多次使用或多剂量使用,会刺激人体产生抗鼠抗体（HAMA）的排斥反应,这不仅减弱了单抗的治疗效果,而且还会使人体产生其它副反应,从而阻碍了单抗治疗的进程。抗体工程技术的发展,使人们可以利用分子生物学手段对抗体进行人源化改造,这不仅降低了抗体中的鼠源成份,可以使鼠源抗体的免疫原性减弱,有利于抗体的临床应用。本文利用表面重塑法对抗乙脑抗体可变区基因进行了人源化改造。1材料与方法工．三…     

抗甜菜坏死黄脉病毒单链抗体表达载体的构建及其表达

用ＰＣＲ方法以分泌抗甜菜坏死黄脉病毒（ＢＮＹＶＶ）单克隆抗体的杂交瘤细胞的基因组为模板,扩增了编码ＢＮＹＶＶ单抗的重链可变区（ＶＨ）基因。测序表明,该ＶＨ序列属于小鼠ＩＩ（Ａ）亚类,全长为３６０ｂｐ,编码１２０个氨基酸。将其和先前克隆的轻链基因分别插入到一个含有连接ＶＨ和ＶＬ基因的连接序列的质粒之中,构建成单链抗体（ｓｃＦｖ）基因的表达载体ｐＴＣｓｃＦｖ。将质粒在大肠杆菌中表达,ＥＬＩＳＡ法检测出     

抗HBsAg人源单链可变区抗体的筛选与可溶性抗体的表达

采用噬菌体表达展示技术,以从乙型肝炎病毒（HBV）表达抗原（HBsAg）阳性血汪有超速离心纯化的HBsAg为固相抗原,从噬菌体单链可变区半合成抗体库中经过5轮“吸附－洗脱－扩增”筛选过程,获得特异性较强的HBsAg人源单链可变区抗体（ScFv）克隆并提取质粒,经SfiⅠ/NotⅠ酶切鉴定后,亚克隆到pCANTAB5E表达载体中,转化大肠杆菌XL1－Blue。经IPTG诱导后,表达的可溶性HBsAg特异性ScFv以50％硫酸胺沉淀,经SDS－PAGE电泳表明,XL1－Blue中表达的HBsAg可溶性ScFv的分子量约28kD。免疫活性检测结果表明,该单链抗体具有较强的抗原结合性和特异性。HBsAg人源单链抗体的筛选和表达成功,为今后HBsAg人源抗体的研究和应用奠定了基础。     

抗HBsAg人源单链可变区抗体的筛选与可溶性抗体的表达

采用噬菌体表面展示技术,以从乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原(HBsAg)阳性血清超速离心纯化的HBsAg为固相抗原,从噬菌体单链可变区半合成抗体库中经过5轮“吸附-洗脱-扩增”筛选过程,获得特异性较强的HBsAg人源单链可变区抗体(ScFv)克隆并提取质粒,经SfiⅠ/NotⅠ酶切鉴定后,亚克隆到pCANTAB5E表达载体中,转化大肠杆菌XL1-Blue。经IPTG诱导后,表达的可溶性HBsAg特异性ScFv以50%硫酸胺沉淀,经SDS-PAGE电泳表明,XL1-Blue中表达的HBsAg可溶性ScFv的分子量约28?kD。免疫活性检测结果表明,该单链抗体具有较强的抗原结合活性和特异性。HBsAg人源单链抗体的筛选和表达成功,为今后HBsAg人源抗体的研究和应用奠定了基础。     

人era真核表达载体的构建

Era是一个独特的含有RNA结合KH结构域的G蛋白亚家族,哺乳类era新近被克隆,目前还没有关于其功能的研究报道。构建了带流感病毒血凝素9肽表位标签（HA tag）的野生型人era基因的真核表达载体,瞬时转染体外培养细胞CHO,Western blot鉴定表明目的的基因得到表达。为深入探讨人era基因的功能奠定了坚实的基础。     

抗克伦特罗单链抗体表达载体的构建与鉴定

为构建克伦特罗(Clenbuterol, CBL)单链抗体(scFv)表达载体, 实现其在大肠杆菌中的表达。以pCANTAB5E- CBL质粒为模板, 扩增CBL的scFv基因, 与pPICZaA载体重组, 然后以重组质粒pPICZaA-scFv为模板扩增scFv及其相连的6 个组氨酸(6×His)片段, 再与载体pBV220连接, 转化大肠杆菌DH5a, 阳性克隆质粒经酶切和PCR鉴定后进行目的片断的序列测定。重组菌经温度诱导表达重组单链抗体, 并通过SDS-PAGE和Western blotting对其鉴定。采用竞争ELISA检测重组单链抗体的抗原结合活性。结果表明重组质粒pBV220-scFv含有插入片段, 与原序列的同源性达99.8%。重组蛋白的分子量接近37 kD, 能够被抗His标签单克隆抗体特异性识别且可被游离的CBL竞争性抑制, IC50值为4.55 ng/mL。这说明我们成功构建了重组质粒pBV220-scFv并实现了其在大肠杆菌中的表达, 为进一步进行CBL免疫法快速检测奠定了一定的基础。     

人源抗狂犬病毒单链抗体基因原核表达质粒的构建及高效表达

在原核系统中高效表达抗狂犬病毒单链抗体scFv41,以便进一步研究其生物学功能,预测临床应用前景。以重组质粒pCANTABscFv41为模板,PCR扩增带NcoI和NotI位点的scFv41基因,克隆入原核表达载体pET-22b( ),酶切鉴定重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。竞争ELISA检测表达蛋白的特异结合活性。酶切鉴定证实scFv41基因已插入原核表达载体pETl-22b( ),重组表达质粒pET-scFv41在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了高效表达,表达量约占菌体蛋白总量的30％。竞争ELISA检测结果表明scFv41表达蛋白可特异抑制抗狂犬病毒IGY与狂犬病毒的特异性结合。该实验为进一步研究scFv41的生物学特性和免疫保护作用,及基因工程抗体的制备奠定了基础。     

人Bcl2基因真核表达载体的构建及其抗凋亡功能研究

目的:构建带myc标签的Bcl2真核表达载体,获得myc-Bcl2融合蛋白,并对其生物学功能进行初步检测。方法:以本实验室保存的乳腺文库为模板,采用PCR技术扩增Bcl2编码序列,将其插入p CMV-myc载体,Western印迹检测表达情况;将重组质粒与空载体分别转染乳腺癌MCF-7细胞,通过流式细胞仪检测p CMV-myc-Bcl2重组质粒对细胞凋亡的影响。结果:双酶切和测序结果表明p CMV-myc-Bcl2真核表达质粒构建成功;转染293T细胞后myc-Bcl2蛋白成功表达;流式细胞仪检测结果显示,myc-Bcl2明显抑制乳腺癌细胞系的凋亡。结论:构建了带myc标签的人Bcl2真核表达载体,为进一步研究Bcl2在细胞凋亡中的功能奠定了基础。     

卵巢癌抗独特型单链抗体的人源化——抗独特型微抗体的构建与表达

为了降低人抗鼠抗体反应 ,获得满意的免疫原性 ,将模拟人卵巢癌抗原的抗独特型单链抗体人源化 .采用重叠PCR和基因工程的技术 ,将 6B11ScFv基因的轻链和重链颠倒 ,成为 6B11VL VH.再与人IgG1铰链区和CH3区的基因进行融合 (VL VH CH3) ,构建抗独特型微抗体的原核表达载体 .转化E .coliBL2 1(DE3)后用IPTG诱导表达 .经SDS PAGE分离显示 ,在 5 0kD左右处有一诱导蛋白带 .不连续非变性凝胶电泳显示 ,表达产物分子量为 10 0kD左右 .采用ELISA、竞争抑制实验、West ern印迹对其进行活性测定 .结果表明 ,人源化的抗独特型微抗体具有特异性双价结合卵巢癌单克隆抗体COC16 6 9和识别人免疫球蛋白IgG1的活性 ,成功地将鼠源的scFv的人源化     

人snail真核表达载体构建与鉴定

目的:构建人snail基因真核表达载体并鉴定。方法:使用RT-PCR法获取人snail基因全长c DNA,经Bam H I、Eco R I双酶切、连接,插入pc DNA3.1(+)真核表达载体,转化TOP10感受态细胞,用含氨苄青霉素的LB培养基筛选阳性克隆,提取质粒双酶切电泳及测序鉴定,瞬时转染siha细胞Western-blot从蛋白水平鉴定重组质粒在真核细胞内的表达。结果:pc DNA3.1-snail重组质粒经酶切电泳符合预期片段,测序鉴定插入片段与NCBI Gen Bank文库中人snail序列一致,重组质粒瞬时转染后snail蛋白表达量明显增高。结论:成功构建pc DNA3.1-snail重组质粒载体,为进一步探讨snail基因生物学功能奠定了基础。     

hCGβ真核表达载体的构建和瞬时表达筛选

为探讨人绒毛膜促性腺激素β亚基（hCGβ）基因避孕疫苗的可能性,利用DNA重组技术将hCGβ的基因片段连接到真核表达载体pCMV4上,酶切分析鉴定正确构建了质粒DNApCMV4-hCGβ,将质粒DNApCMV4-hCGβ通过脂质体转染的方法导入体外培养的Hela细胞,双抗夹心ELISA法检测质粒DNApCMV4-hCGβ在Hela细胞瞬时表达系统中特异性的表达了hCGβ。结果表明hCGβ表达含量24h为6.78ng/ml,48h为15.24ng/ml,说明在体外瞬时表达了特异性hCGβ的pCMV4-hCGβ真核表达载体能够作为DNA疫苗使用,为pCMV4-hCGβ质粒DNA免疫小鼠进行DNA避孕疫苗的研究奠定了基础。     

抗卵巢癌单链免疫细胞因子真核表达载体的构建及表达

为将细胞因子IL 2靶向卵巢癌局部 ,提高肿瘤局部细胞因子的浓度 ,构建并表达了抗卵巢癌单链免疫细胞因子IL 2 1 83B2scFv .通过基因工程将两段基因IL 2和 1 83B2scFv开放读码框架的编码序列克隆在一起 ,在CHO细胞内人巨细胞病毒启动子的作用下表达可溶性融合蛋白 .酶联免疫吸附法检测其免疫学活性 ,并检测其促淋巴细胞增殖活性 .构建成功的抗体细胞因子融合蛋白能够在哺乳动物细胞内表达并能分泌到细胞外 ,且融合蛋白既能与卵巢癌相关抗原OC1 83B2很好地结合 ,又能刺激IL 2依赖细胞株的增殖 ,为其进一步临床应用打下实验基础     

从大容量噬菌体抗体库中筛选抗Acr蛋白人源单链抗体

目的:从天然的大容量噬菌体抗体库中筛选特异的抗结核分枝杆菌晶体蛋白( alpha-crystallin Acr)的人源抗体.方法:以结核分枝杆菌Acr蛋白包被免疫管,通过对噬菌体抗体库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”的过程从大容量抗体库中筛选特异性抗结核分枝杆菌Acr蛋白的抗体,并对可变区序列进行了测序分析.将特异性的噬菌体抗体感染HB2151菌,经IPTG诱导表达,制备了抗结核分枝杆菌Acr蛋白的可溶性单链抗体;对其序列和抗原结合活性进行分析鉴定.结果:经过4轮筛选,获得了43个与结核分枝杆菌Acr蛋白结合的阳性克隆,其中29个特异结合的克隆;测序分析有26不同的可变区片段;通过可溶性单链抗体(scFv)表达筛选到14株特异性结合Acr蛋白的可溶性单链抗体克隆;经过基因测序,分析了可变区基因的亚群.成功制备了可溶性单链抗体.Westren blotting分析证实筛选的人源单链抗体能与天然蛋白结合.结论:利用单链大容量抗体库获得抗结核分枝杆菌Acr蛋白的噬菌体抗体并且成功制备抗结核分枝杆菌Acr天然蛋白的可溶性单链抗体,为今后的研究和应用奠定基础.