L-酪氨酸对大鼠黄体细胞3β-羟-甾体脱氢酶活性的影响

目的:研究L-酪氨酸对离体培养大鼠黄体细胞3β-HSD活性的影响.方法:运用细胞培养技术和放射免疫分析法,观察不同剂量L-酪氨酸对大鼠黄体细胞3β-HSD活性的影响和L-酪氨酸及其类似物酪氨酰肼在拮抗hCG诱导孕酮生成作用中,3β-HSD活性的变化.结果:①0.2 mmol-1和2.0 mmol-1的L-酪氨酸明显抑制3β-HSD的活性,相同浓度的L-苯丙氨酸及L-多巴胺对此酶活性无影响;②在底物浓度较低时,L-酪氨酸可显著增强3β-HSD活性,随着底物浓度的增加,L-酪氨酸的作用逐渐减弱并转为抑制作用.③L-酪氨酸及酪氨酰肼对hCG诱导的3β-HSD活性有明显的抑制作用.结论:L-酪氨酸可明显影响大鼠黄体细胞3β-HSD活性,其作用性质与底物浓度密切相关.L-酪氨酸及酪氨酰肼抑制hCG诱导的3β-HSD活性.     

山羊胎儿肝脏3β-羟基甾体脱氢酶/△~4-△~5异构酶(3β-HSD)cDNA的克隆(英文)

3β-羟基甾体脱氢酶/△~4-△~5 异构酶(3β-HSD)是哺乳动物体内广泛存在的一类参与甾体激素代谢的氧化还原酶, 且具有异构酶活性。3β-HSD 催化3β-羟基甾体的脱氢及随后的△~5-3-甾酮产物的异构化反应, 以产生α, β-非饱和酮, 3β-HSD 在甾体激素代谢中起着重要作用。本文以胎羊肝为材料, 首次获得了山羊胎肝的3β-HSD 的cDNA, 并进行了3β-HSD在肝脏组织的表达分析。参照牛、啮齿类的3β-HSD cDNA的高同源区设计引物。 以2～3月雌性胎羊肝脏mRNA为模板, 经RT-PCR获得416 bp cDNA片段 (Fig.1), 然后以其为探针筛选胎羊肝λgt 10 cDNA文库 最后获得3'-端缺失的3β-HSD cDNA 克隆,并推导了其氨基酸序列 (Fig.2)。同源分析表明山羊胎肝3β-HSD的氨基酸序列与牛卵巢、人Ⅰ型和小鼠Ⅰ型3β-HSD的同源性分别为96%、78%和73% (Fig.3)。提取雌性胎羊、雄性胎羊及母体羊肝脏的总RNA, 同时做RT-PCR,表明3β-HSD 在不同个体肝脏中的表达存在差异,雌性胎羊和母体孕羊肝脏中都有3β-HSD的表达,而在雄性胎羊肝脏中,则未检测到表达信号(Fig.4)。     

L-酪氨酸对大鼠黄体细胞3p-羟-甾体脱氢酶活性的影响

目的：研究L-酪氨酸对离体培养大鼠黄体细胞3β-HSD活性的影响。方法：运用细胞培养技术和放射免疫分析法,观察不同剂量L-酪氨酸对大鼠黄体细胞3β-HSD活性的影响和L-酪氨酸及其类似物酪氨酰肼在拮抗hCG诱导孕酮生成作用中,3β-HSD活性的变化。结果：①0．2mmol^-1和2．0mmol^-1的L酪氨酸明显抑制3β-HSD的活性,相同浓度的L-苯丙氨酸及L-广多巴胺对此酶活性无影响;②在底物浓度较低时,L-酪氨酸可显著增强3β-HSD活性,随着底物浓度的增加,L-酪氨酸的作用逐渐减弱并转为抑制作用。③L-酪氨酸及酪氨酰胼对hCG诱导的3β-HSD活性有明显的抑制作用。结论：L-酪氨酸可明显影响大鼠黄体细胞3β-HSD活性,其作用性质与底物浓度密切相关。L-酪氨酸及酪氯酰肼抑制hCG诱导的3β-HSD活性。     

酪氨酸对未成年大鼠卵巢Δ~5-3β-羟类固醇脱氢酶活性的影响

利用PMSG(妊娠母马血清促性腺激素)及HCG(人羢膜促性腺激素)处理的未成年大鼠卵巢匀浆,通过测定Δ~5-3β-羟类固醇脱氢酶(HSD)活性,研究了酪氨酸影响孕酮的代谢机理。结果表明,同一浓度的酪氨酸(60微克/毫升)加到排卵后不同时间(12—72小时)的卵巢匀浆中,Δ~5-3β-HSD活性增加,并随着时间延长有逐渐增加的趋势。酪氨酸组同对照组间差异非常显著(P<0.001),不同浓度的酪氨酸(30—160微克/毫升)加到排卵后同一时间(24小时)的卵巢匀浆,也能提高Δ~5-3β-HSD活性,酪氨酸组与对照组间差异非常显著(P<0.001)。     

3β,20α-羟基甾体脱氢酶的动力学性质

3β,20α-羟基甾体脱氢酶(3β,20α-Hydroxysteroid dehydrogenase,3β,20α-HSD)是从胎羊血中分离得到的。分子量为35kD。该酶以NADPH为辅酶,有两种底物。以孕酮为底物时,Km=30.8μmol/L,Vmax=0.7nmol min~(-1)(nmol enzyme)~(-1);以5α-二氢睾酮(5α-Dihydrotestosterone,5α-DHT)为底物时,Km=74μmol/L,Vmax=1.3nmol min~(-1)(nmol enzyme)~(-1)。5α-DHT竞争性抑制20α-还原活性,Ki=102μmol/L。16α-溴代乙酰氧基(16α-Bromo acetoxyprogesterone,16α-BAP)是3β,20α-HSD不可逆竞争性抑制剂,t_(1/2)=75min。对3β和20α还原活性的抑制常数Ki分别为23μmol/L和58μmol/L。     

3β-羟基类固醇脱氢酶在甾体激素生成组织中的功能

3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-hydroxysteroid dehydrogenase,3β-HSD)是一类依赖于NAD+/NADP+接受质子的氧化还原酶。在胆固醇转化为类固醇激素中起限速酶作用,在体内广泛分布。3β-HSD催化环戊烷并多氢菲结构3号位CH-OH转化为C=O,是参与肾上腺糖皮质激素合成中唯一非细胞色素P450家族中的酶;3β-HSD催化孕烯醇酮生成孕酮、17α-羟孕烯醇酮转化为17α-羟孕酮、雄烯二醇生成睾酮等多步化学反应。3β-HSD通过参与细胞内甾体激素生成,进而在生殖系统中发挥功能。此外,3β-HSD在脑、脂肪组织中也有较强表达,本文就3β-HSD在甾体激素生成组织中的功能及其临床意义进行总结。     

山羊胎儿肝脏3β—羟基甾体脱氢酶／Δ^4—Δ^5异构酶（3β—HSD）cDNA的克隆

3β－羟基甾体脱氢酶／Δ^4-Δ^5异构酶（3β－HSD）是哺乳动物体内广泛存在的一类参与甾体激素代谢的氧化还原酶,且具有异构酶活性。3β－HSD催化3β－羟基甾体的脱氢及随后的Δ^5-3-甾酮产物的异构化反应,以产生α,β－非饱和酮,3β－HSD在甾体激素代谢中起着重要作用。本文以胎羊肝为材料,首次获得了山羊胎肝的3β－HSD的cDNA,并进行了3β－HSD在肝脏组织的表达分析。参照牛,啮齿类的3β－HSD CDNA的高同源区设计引物,以2－3月雌性胎羊肝脏mRNA为模板,经RT－PCR获得416 bp cDNA片段（Fig.a),然后以其为探针筛选胎羊肝λgt10cDNA文库最后获得3－端缺失的3β－HSD cDNA克隆,并推导了其氨基酸序列（Fig.s)。同源分析表明山羊胎肝3β－HSD的氨基酸序列与牛卵巢,人I型3β－HSD的同源性分别为96％,78％和73％（Fig.3),提取雌性胎羊,雄性胎羊及母体羊肝脏的总RNA,同时做RT－PCR,表明3β－HSD在不同个体肝脏中的表达存在差异,雌性胎羊和母体孕羊肝脏中都有3β－HSD的表达,而在雄性胎羊肝脏中,则未检测到表达信号（Fig.4)。     

甾醇类脱氢酶的亲和标记

用亲和标记的方法研究重要生物蛋白专一结合位点的局部结构和功能是过去30年中出现的重要生物化学技术之一,而把这项技术用于甾醇类脱氢酶活性中心的研究还是70年代以后的事。自从Ganguly和Warren首次报道了用21-碘乙酸基可的松亲和标记20β一羟甾醇脱氢酶活性中心以来,又有一系列卤乙酸基甾醇类衍生物被合成出来用作亲和标记试剂。     

低温环境对小鼠乳酸脱氢酶活性的影响

本文以总酶活性测定和聚丙烯酰胺凝胶电泳为手段,探讨了4℃低温环境对小白鼠LDH的影响。在低温环境下,小白鼠6种组织LDH总活性显著下降(P<0.05),肾脏和心脏的H型LDH相对活性显著上升,而M型LDH相对活性显著下降,相应地B亚基比例显著上升,而A亚基比例显著下降。这种变化可能反应了在低温环境下小白鼠这种恒温动物厌氧代谢急剧下降。本文还从基因表达的角度初步讨论了这种变化的可能原因。     

A环饱和甾体的微生物转化作用II.降解5a一△16一3β一羟基-孕甾烯-20-酮-3β-醋酸酯为△1,4-雄甾二烯-3，17一二酮

节杆菌9—2能彻底降解5a一△16一3β一羟基一孕甾烯一20一酮一3β一醋酸酯(I)形成二氧化碳和水。在它的培养基质中添加钴离子可抑制甾核的进一步降解,从而积累中间产物△1,4-雄甾二烯-3,17一二酮(VI),     

增产菊胺酯对小鼠睾丸间质细胞-氧化氮合酶和3β-羟基甾体脱氢酶影响的酶组织化学研究

本文用ＮＡＤＰＨ－黄递酶法研究了ＮＯＳ在小鼠睾丸的分布与活性,用ＮＢＴ法研究了３β－ＨＳＤＨ的活性,以探讨新型植物生长调节剂增产菊胺酯的生殖毒作用机理。光镜观察和图像分析表明,ＮＯＳ主要存在于睾丸间质细胞,而支持细胞和生精细胞未见或仅见弱阳性反应产物。进一步观察表明,随着剂量的增加,ＮＯＳ和３β－ＨＳＤＨ活性均明显减弱,睾丸内睾酮含量也随之减少。结果提示,增产菊胺酯可能由此而引起生殖功能的损伤     

△^5—3β，7β-二羟基甾醇及其C-7差向异构体波谱特征及胆碱酯酶的抑制活性

本文对△^5-3β,7β-二羟基甾醇（1—3）和△^5-3β,7α-二羟基甾醇（4～6）的一些核磁共振波谱特征进行了比较。活性测试表明化合物1—6对乙酰胆碱酯酶（AChE）无明显的抑制活性,对丁酰胆碱酯酶（BuChE）则有较强的抑制活性,其中24-亚甲基胆甾-5-烯-3β,7α-二醇（6）的IC50值为9．5μM。通过活性数据比较我们发现7α-羟基甾醇对丁酰胆碱酯酶的抑制活性明显比相应的7β-羟基甾醇高。我们通过计算7位羟基和四环平面之间的二面角角度来尝试解释这些活性差别。     

TTC-脱氢酶还原法测定螺旋藻细胞活性的条件优化

为确定氯化三苯基四氮唑(TTC)-脱氢酶还原法测定螺旋藻细胞活性的最优条件,首先通过单因素实验对影响藻细胞活性测定的TTC质量分数、缓冲液pH、提取剂（乙醇）质量分数、培养时间、培养温度进行分析,选定各因素的变化范围,再利用正交试验设计方法,在藻细胞活性测定的最适培养温度下,对TTC质量分数、缓冲液pH、提取剂质量分数、培养时间进行3水平优化试验。最后确定优化的TTC 脱氢酶还原法测定螺旋藻细胞活性的条件为TTC质量分数0.1%、缓冲液pH 8.0~8.5、乙醇质量分数60%、培养时间5 h、培养温度35 ℃。在此条件下所测藻细胞活性最高,为螺旋藻细胞活性的评价提供了一定参考。     

△6-脂肪酸脱氢酶的分子生物学研究进展

包括γ-亚麻酸在内的多不饱和脂肪酸由于在人类健康中的重要作用而成为有价值的产品,目前市场上对γ-亚麻酸的需求持续增长,然而当前来源难以满足市场的需求,寻找合适的替代来源将有助于解决这一问题。△^6-脂肪酸脱氢酶是多不饱和脂肪酸合成途径中的限速酶,这里从△^6-脂肪酸脱氢酶的基因克隆、结构和功能的研究、系统进化和基因工程应用等方面探讨了△^6-脂肪酸脱氢酶的研究进展。     

3α-羟类固醇脱氢酶基因的质粒载体构建和表达

目的 实现3α-羟类固醇脱氢酶基因在大肠埃希菌中的高可溶性表达.方法 从土壤中分离睾丸酮丛毛单胞菌,提取其基因组DNA,PCR扩增3α-羟类固醇脱氢酶(3α-HSD)基因,将它克隆到原核表达载体上进行诱导表达.提取细菌总蛋白进行SDS-PAGE分析并测定酶活性.结果 经核苷酸序列测定和酶切鉴定结果表明,成功地构建了重组质粒,IPTG诱导表达后,获得融合蛋白,SDS-PAGE初步测定目的蛋白的相对分子量约为29kDa,与预期理论值一致;酶活性测定结果表明菌体可溶性总蛋白HSD酶比活性为142.81 U/mg,是对照BL21的12.97倍.结论 该研究成功地构建了3α-羟类固醇脱氢酶基因高效原核表达系统,为利用基因工程手段大量制备3α-HSD的工作奠定了基础.     

3-甾酮-1-脱氢酶基因的表达及甾体转化分析

本文利用带有P43启动子的表达分泌载体pWB980,实现了简单节杆菌3-甾酮-1-脱氢酶在枯草芽孢杆菌中的表达,表达出的目的蛋白的分子量为55KDa。利用分光光度法检测得到胞内和胞外可溶性部分的酶活分别为110±0.5mU和15±0.6mU每毫克蛋白, 比出发菌株简单节杆菌提高了将近30倍。重组芽孢杆菌对甾体底物4-AD的转化率为45.3％,比出发菌株简单节杆菌提高了近10倍。利用枯草芽孢杆菌对甾体底物进行脱氢为甾体药物的生产开辟了一个新的途径。