cAMP依赖性蛋白激酶调节亚单位类型1A（RIα）基因的分子生物学研 …

ｃＡＭＰ依赖性蛋白激酶调节亚单位类型１Ａ基因是ｃＡＭＰ依赖性蛋白激酶基因家族 的一个成员,因其在人生殖细胞的生长、发育、成熟等过程中独有其功效而受到研究者的关注。     

多巴胺受体激动剂对兔动脉cAMP产生系统的影响

实验观察了选择性多巴胺（ＤＡ）ＤＡ１受体激动剂ｆｅｎｏｌｄｏｐａｍ与ＤＡ２受体激动剂ｐｒｏｐｙ１－ｂｕｔｙｌ－ｄｏｐａｍｉｎｅ（ＰＢＤＡ）对兔肾动脉,肺、肠系膜动脉和股动脉环磷酸腺苷（ｃＡＭＰ）产生系统的影响。结果表明：⑴除股动脉外,ｆｅｎｏｌｄｏｐａｍ均可浓度依赖性地增加肺动脉、肾动脉和肠系膜动脉ｃＡＭＰ的生成量。选择性ＤＡ１受体阻断剂ＳＣＨ２３３９０可以显著阻断ｆｅｎｏｌｄｏｐａｍ的效应,而Ｄ     

EAC细胞在3＇5＇－cAMP诱导下PKA－RⅡ移位入核与癌基因表达的动力学变化

Ｅｈｒｌｉｃｈ细胞在ｃＡＭＰ加茶碱的诱导下,于接种后５－７天,伴随着胞质内ｃＡＭＰ蛋白结合率上升的同时,依赖于ｃＡＭＰ的蛋白激酶Ⅱ型酶调节亚基（ＰＫＡ－ＲⅡ）从胞质向核移位,其表达强度在胞质和核内持续升高,此时癌基ｃ－ｍｙｃ,ｃ－ｆｏｓ,ｃ－Ｈ－ｒａｓ,ｃ－ｓｉｓ表达抑制。ｃＡＭＰ蛋白结合率与ＰＫＡ－ＲⅡ的移位入核呈显著的正相关,二者与癌基因表达抑制是显著的负相关,它们均从第７天最为显著。在癌龄晚期（按种后９－１１天）,当胞质内ｃＡＭＰ蛋白结合率下降（与对照组比较）时,ＰＫＡ－ＲⅡ则停止移位入核,癌基因又重新表达,如果用ｃＡＭＰ抑制剂人为阻断接种后第７天的癌细胞内ＰＫＡ信号通路时,ＰＫＡ－ＲＨ则停止移位入核,而癌基因仍呈强烈表达。对上述各结果之间的关系进行了分析与讨论。     

cAMP在急性胃粘膜损害中作用的研究

本研究应用ＲＩＡ法,观察了大鼠胃组织ｃＡＭＰ含量与急性胃粘膜损害之间的关系。结果表明：（１）由消炎痛或失血性休克引起的急性胃粘膜损害时,胃组织ｃＡＭＰ含量明显降低;事先使用异搏定（１０ｍｇ／ｋｇ）可使胃组织ｃＡＭＰ含量明显增加,并使由消炎痛引起的急性胃粘膜损害相应减轻。（２）在正常情况下,胃窦、胃体组织间ｃＡＭＰ含量并非相等,胃窦部组织ｃＡＭＰ含量高于胃体部组织,与此相应的是急性胃粘膜损害主要局限在胃体部。上述引起急性胃粘膜损害的诸因素均可使这种差别加大。５和１０ｍｇ／ｋｇ剂量的异搏定可使消炎痛所致急性胃粘膜损害的大鼠胃体部组织的ｃＡＭＰ含量明显增加,与胃窦部组织ｃＡＭＰ含量的差值变小,结果是胃体部粘膜的损害明显减轻。提示胃组织ｃＡＭＰ含量变化在急性胃粘膜损害中有一定的作用。     

小鼠cAMP依赖的蛋白激酶催化亚基α的重组表达研究

将小鼠ｃＡＭＰ依赖的蛋白激酶（ｃＡＰＫ）催化亚基α（ｍＣα）分别以成熟、麦芽糖结合蛋白（ＭＢＰ）融合以及Ｎ端连续六个组氨酸（Ｈｉｓ_６）融合的形式在大肠杆菌中得到了高效表达,且成熟及融合的重组ｍＣα均有明显的蛋白激酶活性,表明蛋白激酶催化核心结构具有相对的独立性。其中Ｈｉｓ_６－ｍＣα可利用金属离子（Ｎｉ￣（２＋））配体亲和层析（Ⅰ－ＭＡＣ）一步纯化,所得融合蛋白可通过Ｈｉｓ_６亲合手臂（Ｔａｇ）固相化于金属离子（Ｎｉ￣（２＋））配体亲和树脂上,为进一步利用ＰｈａｇｅＤｉｓｐｌａｙ多肽库筛选ｃＡＰＫ识别的底物序列和专一性抑制剂打下了基础。     

重组I型cAMP依赖的蛋白激酶调节亚基的表达,纯化和鉴定

Ｉ型蛋白激酶的调节亚基（ＲＩ）具有两个ｃＡＭＰ结合位点,对ｃＡＭＰ具有很高亲和力和特异性,我们从人神经细胞中克隆人ＲＩ亚基ｃＤＮＡ片段（编码氨基酸残基９３－３８１）并将其亚克隆至ｐＥＴ３０ａ原核表达载体,实验表明该表达质粒在大肠杆菌ＢＬ２１中,在ＩＰＴＧ诱导下,表达产生大量带聚组氨酸标记的重组ＲＩ亚基。这些蛋白质以可溶性蛋白形式存在,经组氨酸结合金属螯合树脂亲和柱层析纯化后,每０．１升培养菌可制备     

肺动脉内皮细胞与肺动脉平滑肌细胞增殖的相互调节

血管内皮细胞和血管平滑肌细胞在结构和功能上关系密切,二者的相互关系在血管舒缩和血管壁结构的调节中起重要作用。本文观察了培养的小牛肺动脉内皮细胞（ＰＡＥＣ）和肺动脉平滑肌细胞（ＰＡＳＭ）在细胞增殖方面的相互调节作用。混合培养的ＰＡＥＣ和ＰＡＳＭ细胞的３Ｈ－ＴｄＲ参入明显降低（Ｐ＜０．００１,与对照组相比）。无论向培养的ＰＡＥＣ和ＰＡＳＭ中分别加入ＰＡＳＭ和ＰＡＥＣ的条件培养基还是二者共培养时,均发现ＰＡＥＣ的３Ｈ－ＴｄＲ参入明显降低,而ＰＡＳＭ的３Ｈ－ＴｄＲ明显升高（Ｐ＜０．０５,与对照组相比）。流式细胞测定也发现共培养时ＰＡＥＣ的Ｇ１期细胞增多,Ｇ２／Ｍ期细胞减少;而ＰＡＳＭ的Ｇ１期细胞减少,Ｇ２／Ｍ期细胞增多。共培养的ＰＡＳＭ细胞内ｃＡＭＰ增加,ｃＧＭＰ含量降低;而ＰＡＥＣ细胞的ｃＡＭＰ和ｃＧＭＰ含量均降低（Ｐ＜０．０１,与对照组相比）。上述结果提示,ＰＡＥＣ和ＰＡＳＭ相互作用可能通过第二信使而调节它们本身的增殖     

人乳腺癌cAMP结合蛋白

建立了测定人乳腺癌胞浆ｃＡＭＰ结合蛋白（ｃＡＭＰｂ．ｐ．）方法。综合研究了其温度、保温时间、配体浓度、稳定性等条件。ｃＡＭＰｂ．ｐ．的Ｋ_Ｄ值为２．９０×１０~（－８）ｍｏｌ／Ｌ．并测定了６０例雌激素受体（ＥＲ）Ｆｕ性乳腺癌标本的ｃＡＭＰｂ．ｐ．含量。此组病人术后均接受系统的内分泌治疗,ＥＲ／ｃＡＭＰｂｐ,比值范围为７．７～３６２×１０~（－３）,ＥＲ／ｃＡＭＰｂ．ｐ．比值≥４０×１０~（－３）的五年生存率明显高于比值＜４０×１０~（－３）组,（ｐ＜０．００５）．表明测定ＥＲ／ｃＡＭＰｂ．ｐ．比值对预测患者内分泌治疗疗效,优于单独测定ＥＲ．     

酵母cAMP依赖的蛋白激酶催化亚基基因A的克隆与表达

利用人工合成寡核苷酸引物,进行ＰＣＲ反应,从酵母染色体中扩增得到酵母ｃＡＭＰ依赖的蛋白激酶催化亚基基因Ａ（ＴＰＫＡ基因）,并克隆到ＰｈａｇｅＭ１３载体中。经ＤＮＡ全序列测定,表明除由ＰＣＲ引物在该基因的５＇端引入ＡＴＧＧＧＴ（ＭｅｔＧｌｙ）６个核苷酸外,蓁与文献报道ＴＰＫＡ结构基因序列完全一致。进一步构建了ＰＬＰｒｏｍｏｔｅｒ控制下的含上述完整ＴＰＫＡ结构基因的表达质粒ＰＢＬＴＰＫＡ２Ｂ,转化大肠     

环腺苷酸在灰盖鬼伞子实体发育中的效用研究

通过测试ｃＡＭＰ,子实体浸提液对灰盖鬼伞（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ　ｃｉｎｅｒｅｕｓ）双核体菌丝的子实体诱导测试研究及通过用腺苷分别抑制ｃＡＭＰ在子实体发育各阶段的合成,对ｃＡＭＰ在灰盖克伞子实体发育中的影响进行了研究。结果表明：ｃＡＭＰ及子实体浸提液对灰盖鬼伞双核体菌丝的子实体形成并无诱导信号作用,阻止ｃＡＭＰ的合成延缓了子实体原基的发生,菌盖的形成,担孢子梗的形成,也延缓了质配和担孢子的发生,但菌柄的延长,子实体的成熟,担孢子的着色与释放则不受ｃＡＭＰ合成受阻的影响。     

败血症大鼠心肌钙通道分布的变化

本研究用结扎盲肠及穿刺（ＣＬＰ）引起败血症。结果证明：大鼠心肌钙通道在早期败血症（ＥＳ,ＣＬＰ后９ｈ）时由心肌轻型囊泡向心肌肌膜转运增多;在晚期败血症（ＬＳ,ＣＬＰ后１８ｈ）时由心肌肌膜向心肌轻型囊泡转运增多。败血症时大鼠心肌肌膜和心肌轻型囊泡钙通道的再分布与ｃＡＭＰ依赖性蛋白激酶（ＰＫＡ）,Ｃａ（２＋）／钙调素依赖性蛋白激酶（ＰＫＭ）和蛋白激酶Ｃ（ＰＫＣ）磷酸化作用无关。败血症时大鼠心肌肌膜和心肌轻型囊泡上肾上腺能β－受体、Ｍ－胆碱受体和Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰａｓｅ的变化规律和钙通道的一样,它们可能是败血症时的一种非特异性变化。     

新型生长抑肽对成纤维细胞的DNA合成及某些癌基因表达的影响

从细胞水平和基因水平研究了新型生长抑肽（ＥＰＰ）的生物学作用,研究表明：ＥＰＰ对ＮＣ３Ｈ１０及ＴＣ３Ｈ１０细胞的ＤＮＡ合成均有抑制作用,当ＥＰＰ与ｃＡＭＰ的位点选择性类似物８－Ｂｒ－ｃＡＭＰ共同作用时,其对ＮＣ３Ｈ１０细胞的ＤＮＡ合成的抑制作用消失,而对ＴＣ３Ｈ１０仍具有抑制作用;核酸杂交分析表明,ＥＰＰ可以抑制ｃ－ｆｏｓ、ｎｅｕ、ｋｉ－ｒａｓ三类癌基因在转化细胞中的表达。证明了ＥＰＰ对转化细胞的生长具有一定的抑制效应,且与８－Ｂｒ－ｃＡＭＰ联合使用时其效果更佳。     

cAPK催化亚基的C端融合表达,纯化及其NMT底物活性作用

将小鼠ｃＡＭＰ依赖蛋白激酶催化亚基α（ｍＣα）基因从３＇端截去９６ｂｐ后与Ｈｉｓ－ｔａｇ融合,构建Ｃ端融合Ｈｉｓ６的表达质粒ｐＺＰｍＣα４Ｈ。该质粒在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中得到了高效表达,目的蛋白ｍＣα４Ｈ的表达量与ｍＣα相近。该蛋白在３７℃表达时主要以包含体形式存在,而２２℃表达时则大部分可溶。利用固定化金属离子（Ｎｉ＾２＋）配体亲和层析,分别从破菌上清涂和包含体中纯化ｍＣα４Ｈ,结果表明     

蛋白激酶B及其在磷脂酰肌醇3-激酶介导的信号转导中的作用

蛋白激酶Ｂ（ＰＫＢ）是原癌基因ｃ－ａｋｔ的表达产物,它参与由生长因子激活的经磷脂磷肌醇３－激酶（ＰＩ３Ｋ）介导的信号转导过程。与许多蛋白激酶相似,ＰＫＢ分子具有一特殊的ＡＨ／ＰＨ结构域（ＡＨ／ＰＨｄｏｍａｉｎ）,后者能介导信号分子间的相互作用。ＰＫＢ是ＰＩ３Ｋ直接的靶蛋白。ＰＩ３Ｋ产生的脂类第二信使ＰＩ－３,４,Ｐ２和ＰＩ－３,４,５－Ｐ３等均能与ＰＫＢ和磷酸肌醇依赖性蛋白激酶（ＰＤＫ）的ＡＨ／Ｐ     

不同pH值条件下利多卡因对淋巴细胞β受体的影响

用放射配基结合法和放免分析法测定了不同ｐＨ值下利多卡因对人血液淋巴细胞β受体结合和肾上腺素刺激的ｃＡＭＰ产量的影响。结果表明,ｐＨ值的增加有利于３Ｈ－ＤＨＡ与β受体结合,肾上腺素刺激的淋巴细胞ｃＡＭＰ的产量随ｐＨ值的增加而增加（Ｐ＜０．００１）;利多卡因抑制β受体结合和肾上腺素刺激的淋巴细胞ｃＡＭＰ产量,其抑制程度亦随ｐＨ值增加而增加（Ｐ＜０．００１）。提示心肺复苏期间不用利多卡因时β受体激动剂的效应随ｐＨ值的增加而增加,如同时使用利多卡因则β受体激动剂的效应并不随ｐＨ值的增加而增强,其机制可能与利多卡因随ｐＨ值的增加,改变了细胞膜脂质流动性,抑制β受体与激动剂的结合有关。     

胰岛素及cAMP对培养人动脉平滑肌细胞HDL受体功能的影响

对胰岛素ｃＡＭＰ对培养人动脉平滑肌细胞（ＳＭＣ）ＨＤＬ受体功能的影响进行了研究,结果发现：胰岛素使ＳＭＣＨＤＬ受体的结合容量Ｂｍａｘ即受体数目显著下降,而对ＳＭＣＨＤＬ受体的Ｋｄ值亲和力无影响;ｃＡＭｐ则ＳＭＣＨＤＬ受体亲和力增加,而对受体数目无影响。     

脉冲电场对鸡胚脑细胞Ca~(2 )和cAMP含量的影响

利用ｆｕｒａ－２／ＡＭ荧光方法和放射免疫方法分别研究了脉冲电场对１１天和１４天胚龄的悬浮鸡胚脑细胞内Ｃａ２＋和环腺苷酸（ｃＡＭＰ）含量的影响,并探讨了在脉冲电场作用下这两种信号物质变化的相关性。实验结果表明：当电激液中［Ｃａ２＋］为１ｍｍｏｌ／Ｌ时,在宽度为１００微秒．强度为０．５,１．０,２．０ｋＶ／ｃｍ的脉冲电场作用下,１１天胚龄的鸡胚脑细胞内钙离子浓度（以［Ｃａ２＋］ｉ表示）与对照相比显著上升,其升高值随着脉冲强度的增加而增加,而细胞内ｃＡＭＰ含量与对照相比显著降低;用ＥＧＴＡ络合电激液中游离Ｃａ２＋以后,虽然细胞内［Ｃａ２＋］ｉ显著上升,细胞内ｃＡＭＰ含量没有显著变化。１４天胚龄的鸡胚脑细胞内［Ｃａ２＋］ｉ在脉冲电场作用下显著上升,而细胞内ｃＡＭＰ含量没有显著变化。脉冲电场对１１天和１４天胚龄的鸡胚脑细胞膜和细胞内Ｃａ２＋库Ｃａ２＋转移系统的开放均有显著作用,此作用具有对脉冲强度的依赖性。为了解物理信号跨细胞膜传导的方式提供了初步的实验根据     

双歧杆菌对大肠癌细胞ccL187cAMP,cGMP影响的实验研究

双歧杆菌对维持机体正常微生态平衡具有重要作用。本文研究了长双歧杆菌对大肠癌细胞ｃｃＬ１８７内第二信使ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ浓度的影响,对长双歧杆菌的对数期培养物分别进行下列处理：活菌、死菌、代谢产物作用ｃｃＬ１８７细胞２小时后分别收集ｃｃＬ１８７细胞内的ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ浓度。实验表明长双歧杆菌的不同状态及代谢产物对ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ产生显著影响,且存在时间依赖关系,三种处理作用ｃｃＬ１８７细胞内的ｃ     

AHF及NE、人参皂甙对不同年龄大鼠VSMC c-myc基因和HSP_(70)基因表达的影响

用原位杂交法及激光光密度计灰度扫描半定量法,比较了老年组（２４月龄）与青年组（６周龄）Ｗｉｓｔａｒ大鼠离体培养的主动脉ＶＳＭＣ（５－１０代）ｃ－ｍｙｃ与ＨＳＰ７０基因的表达及红细胞抗高血压因子（ＡＨＦ）、去甲肾上腺素（ＮＥ）与人参皂甙对上述基因表达的影响。结果表明：１．增龄导致的ＶＳＭＣ增殖很可能与ｃ－ｍｙｃ基因的过度表达有关,ＮＥ、ＡＨＦ和人参皂甙可以通过调控ｃ－ｍｙｃ基因的表达来影响ＶＳＭＣ增殖。２．增龄伴随的应激能力下降可能与ＨＳＰ７０基因表达的减少有关。３．ＨＳＰ７０基因也可能参与了ＶＳＭＣ增殖与分化的调控,ＮＥ、ＡＨＦ与人参皂甙可能通过调控ＨＳＰ７０基因的表达来影响ＶＳＭＣ的增殖     

中药固真方对促甲状腺素受体基因表达的调节作用

促甲状腺素（ＴＳＨ）通过甲状腺细胞膜上的ＴＳＨ受体（ＴＳＨＲ）,产生第二信使ｃＡＭＰ,从而激活ｃＡＭＰ反应性起动子,而使相应的基因获得表达。实验结果表明,在构建有ＴＳＨＲ和糖蛋白激素ｃＡＭＰ反应性起动子以及萤光素基因（Ｌｕｃ）的转染细胞中,经补肾益精中药固真方提取液（１×１０＾－４稀释）处理３￣５ｄ后,可下调ＴＳＨＲ基因的表达,并使ＴＳＨＲ数目减少。提示固真方可调整甲状腺细胞的功能,或许有利于调整