pBR322 DNA的超螺旋波动

开环状pBR322 DNA在不同溴乙啶浓度下通过DNA联接酶转变为闭环状分子。除去溴乙啶后,每种样品中都含有一组超螺旋数即拧数(W_r)不同的闭环状分子。这些样品和天然pBR322 DNA的W_r都直接用琼脂糖凝胶电泳加以分析和测定。作者观察到用同样的培养剂在37℃培养同一菌株所获得的不同pBR322 DNA样品,其超螺旋数值可以在相当大的范围内波动。为了便于比较不同的超螺旋DNA,作者采用了一种新的单位——超螺旋跨距,它可能有助于进一步研究环状双链DNA的本质。     

DNA双链区的切割导致碱变性超螺旋质粒pBR322的分子内结节

为进一步研究碱变性超螺旋DNA(Ⅳ型DNA;DNA Ⅳ)的结构,对碱变性质粒pBR322进行了酶学分析并利用原子力显微镜(AFM)对新形成的DNA结构进行了观察和比较．在所有已检测的限制酶中只有PstⅠ可以切割质粒pBR322的Ⅳ型DNA分子,说明在这种变性的DNA分子中仍存在少数完整的限制酶识别位点．与碱变性DNA分子的闭合环状结构相反,AFM成像的结果显示PstⅠ处理后的DNA Ⅳ分子均为开放结构,同时这种分子包含明显的DNA结节．与DNA Ⅳ分子相比,这种DNA分子的表观长度缩短了大约11%．有意思的是,大肠杆菌拓扑异构酶Ⅳ(一种Ⅱ型拓扑异构酶)也可以在pBR322 DNA Ⅳ分子中引入分子内结节,而这种结节DNA分子仍然保持闭合状态．AFM的结果表明上述两种结节的DNA分子在表观长度及结节结构的尺寸上均比较相似．这些发现证实,在碱变性的超螺旋DNA分子中仍然保留着一些长度较短的、含有特异性碱基配对的DNA双链区,而在这些区域内的DNA双链断裂可以导致DNA结节．     

磁场对质粒pBR322DNA的影响

讨论了经５００ｍＴ、９００ｍＴ、１２００ｍＴ、１５００ｍＴ恒磁场作用后的质粒ｐＢＲ３２２ＤＮＡ与Ⅱ型限制性内切酶ＥｃｏＲⅠ、ＨｉｎｄⅢ、ＢａｍＨⅠＳａｌⅠ、ＰｓｔⅠ、ＰｕｖⅡ、ＴａｑⅠ、ＢｇｌⅠ、ＲｓａⅠ、ＨｉｎｆⅠ、ＡＰａⅠ、ＫｐｎⅠ等的单酶解、双酶解及多酶解反应。从琼脂糖电泳分离酶解片段的结果,发现经磁场作用过的ｐＢＲ３２２ＤＮＡ在３３６１—６３１ｂｐ的区段内产生了一个被ＨｉｎｆⅠ识别的新序列ＧＡＮＴＣ,证明了磁场作用能引起ＤＮＡ点突变。     

质粒pBR322的缺失突变株

质粒pBR322[]是较理想的基因载体之一;在基因工程研究中已经取得了不少突出的成绩［u]。我们在体外建造pBR322质粒DNA与X DNA片段的重组质粒过程中;获得一个质粒pBR3 2 2的缺失突变株;命名为pH A4。这种突变株对于研究质粒DNA的形成、进化和结构都具有一定的意义。     

质粒pBR322的温度敏感突变株

携带质拉pBR322的大肠杆菌8021经亚硝基胍诱变后,获得一批温度敏感突变株。携带这些质粒的宿主细胞在含药(氨基苄青霉素、四环素)培养基中,于30℃能正常生长,而于42℃则不能正常繁殖;接种于无药培养基中,即使42℃亦能正常生长。这些突变株中,有四株在37℃亦能表现温度敏感性。对其中一株进行了高温(42℃)敏感细胞分离的观察,在42℃时,耐药细胞数目基本稳定,而敏感细胞数目明显增加。 通过这些突变株对药物抗性的温度敏感性观察、突变质粒DNA的转化及高温分离现象,证明宿主对药物抗性的温度敏感性是由于质粒复制部分发生突变所致。 从它们的电泳及Eco RI酶解图谱来看,在突变质粒的分子量及切点数目上未看到与出发株的差异。     

Nucleosome “phasing” and cruciform structures in circular supercoiled pBR322 DNA

Cruciform structures have been detected in pBR322 supercoiled DNA, both in its naked state and when complexed with histone octamer, using S1 endonuclease cleavage and EcoRI restriction. An inspection of the DNA sequence shows that the S1-hypersensitive sites are very near to AT-rich regions of pBR322 genome. A nucleosome “phasing” in these regions, as found on AT-rich regions of SV40 DNA (15), has been shown by restriction enzymes analysis. On the basis of these results it can be proposed that cruciform structures protrude on the nucleosome surface. This model explains the reason why these structures, which need high superhelical density, can exist in supercoiled DNA partially relaxed by nucleosome formation.     

影响pBR322质粒DNA对E. Col I C600转化的因子

在DNA体外重组技术的研究和应用中;转化是个很重要的步骤。自Cohen等人^[2]在1972年首次用CaCl:处理的方法成功地进行了R因子对E. colt C600的转化之后;这个方法一直广泛地应用于大肠杆菌各受体菌系的转化。鼠伤寒沙门氏杆菌S. typhimurium^[3]和金黄色葡萄球菌S. aureus^[4];的转化也都沿用此法。直至1978年;Michael等^[5]在用pBR 322质粒DNA对E. colt X1776的转化中却采用了与此不同的方法。     

pBR 322 DNA的HaeⅢ,BamHI的酶切片段的核苷酸顺序

DNA是生物体的遗传物质。蛋白质和RNA分子结构信息以及调节基因的信息都编码在DNA的特定核苷酸顺序中。搞清楚蛋白     

竹红菌甲素敏化质粒pBR 322 DNA光氧化——使封闭环DNA转变为开环DNA

甲素可敏化质粒pBR 322 DNA光氧化断链的使其封闭环DNA转变为开环DNA。甲素敏化pBR 322 DNA光氧化反应可被单线态氧淬灭剂-NaN_3抑制,证明此光敏氧化机制属Ⅱ型过程。     

pBR322DNA与8-甲氧补骨脂素光化学反应部位的碱基顺序特异性

用限制性核酸内切酶酶切试验研究了质粒pBR322 DNA经8-MOP及近紫外线作用后损伤部位的碱基顺序特异性。实验研究发现PUVA损伤的DNA在HindⅢ及RsaⅠ识别位置上酶切反应受到严重抑制,而在SphⅠ,EcoRⅠ,PvuⅡ,BamHI,PstⅠ识到位置上抑制轻微。通过对不同识别位置上碱基顺序及其光化学反应敏感性的分析,推断出DNA的TpA顺序可能是最易接受8-MOP光化学反应的部位。     

pBR322质粒DNA中EcORⅠ和Hpa Ⅱ酶解片段的核苷酸序列分析

DNA核苷酸序列分析对基因的结构与功能研究起着重要作用。1977年Maxam和Gilbert建立的化学裂解法能测定200个核苷酸左右的长片段序列。我们根据国内条件用Maxam—Gilbert方法测定了pBR 322质粒DNA中Ecor Ⅰ和Hpa Ⅱ酶解片段的序列。     

大肠杆菌topA-菌株中质粒pBR322的超凝集结构

超凝集DNA是质粒DNA的一种特殊拓扑结构形式,最初在大肠杆菌SD108(topA gyrB225)细胞中被发现.现在大肠杆菌DM800(topA-gyrB225)细胞中也发现了这种结构,这说明超凝集DNA的形成与细胞内旋转酶活性降低有直接关系,而与拓扑异构酶Ⅰ的存在与否无关.体外实验的结果显示,具有很强的正超螺旋松弛活性的拓扑异构酶Ⅳ可以将超凝集DNA完全松弛,这也证明质粒DNA的超凝集结构与超螺旋结构在细胞内是可以互变的.使用原子力显微镜对分离到的pBR322DNA超凝集结构进行分析,并与普通超螺旋进行比较,结果表明,超凝集DNA分子的结构发生了巨大的变化,其分子长度比正常超螺旋分子缩短了约30%,宽度和高度则增加了60%,结构更接近于A型DNA.另外,原子力显微镜研究结果表明,氯喹的嵌入并非改变了超凝集DNA的超螺旋状态,而是使其打结并最终压缩成一团.     

质粒pBR322电注入E.coli HB101的研究

常用的转化方法是用CaCl_2或CaCl_2/RbCl_2处理受体菌使成感受态。转化率约为10~3—10~6个转化子/μg质粒DNA。近年发展起来的电转化技术可使转化率提高到lC~(?)—10~(10)个转化子/μg质粒DNA。我们以质粒pBR322和大肠杆菌HB101为实验材料,对常用的转化方法和电转化的结果进行了比较,对电转化中获得最佳转化效果和各种参数如电压、脉冲时间、脉冲次数、循环数等进行了探讨。     

超螺旋DNA的碱变构研究

对超螺旋ＤＮＡ（ＤＮＡⅠ）的碱处理产物进行了琼脂糖凝胶电泳,氯化铯－溴化乙锭密度梯度超离心分析,紫外吸收光谱分析和电镜观察。实验结果表明超螺旋ＤＮＡ在碱性环境中的结构改变发生在很窄的ｐＨ范围内（ｐＨ１２．８８─１３．００）．超过ｐＨ临界点的超螺旋ＤＮＡ碱变构产物紫外吸收高于同浓度天然ＤＮＡ紫外吸收的２９％。变构产物在ＣｓＣｌ－ＥＢ密度梯度超离心中的高密度区形成稳定的区带．用透射电镜的观察表明碱变构的超螺旋ｐＢＲ３２２ＤＮＡ具有高电子密度并呈中空颗粒状,以上事实表明,ＤＮＡ在高ｐＨ下可产生一种结构有序的相对稳定的产物．这些结果意味着在碱处理过程中,超螺旋ＤＮＡ在构象上发生了改变,使其分子由扭曲线形变成球形颗粒状。根据实验事实本文对超螺旋ＤＮＡ的碱变构产物（ＤＮＡⅣ）提出一个新的结构模型──压缩模型。这个模型能更合理地解释一些实验现象。     

超螺旋DNA的碱变构研究

对超螺旋ＤＮＡ（ＤＮＡＩ）的碱处理产物进行了琼脂糖凝胶电泳,氯化铯－溴化惭锭密度梯度超离心分析,紫外吸收光谱分析和电镜观察,实验结果表明超螺旋ＤＮＡ在碱性环境中的结构改变发生在很窄的ＰＨ范围内（ＰＨ１２．８８－１３．００）。超过ＰＨ临界点的ＣｓＣｌ－ＥＢ密度梯度超离心听高密度区形成稳定的区带。用透射电镜的观察表明碱变构的超螺旋ｐＢＲ３２２ＤＮＡ具有高电子密度并呈中空颗粒状,以上事实表明,ＤＮＡ在高     

超氧化物歧化酶切割超螺旋DNA的活性

在体外系统中,发现超氧化物歧化酶(SOD)具有切割超螺旋DNA的活性. 猪血和牛血Cu/Zn-SOD以及烟草Mn-SOD都能将超螺旋DNA转变为非超螺旋结构的缺刻环状DNA,进一步产生线状DNA. 它们只作用于超螺旋DNA而不作用于线状DNA. 这个事实排除了SOD样品中污染核酸酶的可能性. 用H₂O₂、胍基抑制或蛋白酶降解的实验结果表明,这两种酶的活性中心处于酶蛋白的不同部位.     

DNA超螺旋构象的理论研究

本文总结了近年来描述DNA超螺旋结构的基本关系式和各种参量,综述了计算超螺旋的几何参数,定量分析DNA分子与蛋白质结合时的特殊构象,以及基于物理模型解释和预见精确的超螺旋空间构象等方面的理论研究进展。