烟曲霉抗原Asp f16HLA-A*0201限制性的CD8+CTL抗原表位生物信息学预测与实验室鉴定

目的 预测与鉴定烟曲霉抗原Asp f16的HLA-A *0201限制性CD8+细胞毒性T细胞(CTL)抗原表位.方法 以国人常见的HLA-A*0201位点为靶点,依据生物信息学软件扫描烟曲霉特异性抗原Asp f16的全部427个氨基酸序列.使用HLA-A *0201转基因小鼠制备骨髓来源的树突状细胞(DC)和CTL.流式细胞仪技术检测DC表面MHC Ⅱ类抗原,CD80,CD86和CD11c的表达来验证其是否成熟.ELISPOT试验检测烟曲霉抗原多肽特异性CTL产生的细胞因子IFN-γ.四聚体(Tetramer)试验证实烟曲霉特异性CTL与抗原肽,HLA-A*0201分子复合体的亲和性.结果 根据与MHC I类分子结合的半衰期评分,选择了3个HLA-A*0201限制性抗原表位.流式细胞仪分析示成熟DC高表达HLA Ⅱ类抗原,CD80,CD86和CD11c.Tetramer试验证实烟曲霉特异性T细胞受体与抗原肽,HLA-A*0201分子复合体的高亲和性.ELISPOT实验结果 表明烟曲霉抗原肽体外可以活化CD8+CTL,被负载了抗原肽的DC刺激活化后可以产生IFN-γ.结论 本研究成功鉴定烟曲霉抗原Asp f16的HLA-A*0201限制性CD8+CTL表位,可作为疫苗设计的候选表位,为进一步研发新型抗烟曲霉疫苗提供参考.     

CD4+T细胞在肿瘤免疫治疗中的作用

近年来,人们对CD4 T细胞在肿瘤免疫治疗中的作用给予了极大的关注,CD4 T细胞不仅可通过IFN-γ依赖性等机制直接杀伤肿瘤细胞,而且在CD8 T细胞的激活、记忆性的细胞毒性T细胞(CTL)应答的产生、维持以及促进其存活等过程中发挥着重要作用,同时激活CD4 T细胞和CD8 T细胞是免疫治疗的理想策略;另外,CD4 CD25 调节性T细胞(Treg细胞)可能被肿瘤表达的自身抗原所诱导,与肿瘤免疫耐受的维持和抗肿瘤应答的下调有关,被认为是免疫治疗失败的主要原因,抑制该细胞亚群可增强治疗性肿瘤疫苗的临床效果.现就CD4 T细胞在肿瘤免疫治疗中的作用的研究进展作一综述.     

自身肽结合于HLA-A2分子上能够在体外诱导抗原肽特异性的同种T细胞

在同种反应性T细胞(同种T细胞)识别的配体中, 抗原肽的作用是免疫学长期争论的问题, 即同种T细胞识别是否具有抗原肽特异性. 为了证实通过长期混合淋巴细胞培养(LTMLC)方法能够诱生抗原肽/MHC复合物(pMHC)特异性的同种T细胞, 本研究利用仅表达HLA-A2, TAP缺陷的T2细胞, 将酪氨酸激酶来源的自身抗原肽(Tyr_369-377)和EB病毒来源的病毒抗原肽(LMP2A_426-434)分别加载到T2细胞上, 使T2细胞提呈单一的T细胞抗原识别表位, 并且选择4个HLA-A2阳性(HLA-A2+ve)与4个HLA-A2阴性(HLA-A2-ve)个体的PBL样本, 与加载上述抗原肽的T2细胞混合培养. 在此实验系统中, HLA-A2+ve PBL与加载病毒抗原肽的T2细胞(T2/LMP)混合培养代表T细胞对普通抗原的反应, 而HLA-A2-ve PBL与加载自身抗原肽的T2细胞(T2/Tyr)混合培养则为T细胞对同种抗原的反应. 利用特异性pMHC四聚体染色与特异性细胞毒试验检测LTMLC诱生CTL的特异性, 其中利用HIV抗原肽(Gag_77-85)作为对照. 结果显示: (ⅰ) T2/LMP与HLA-A2+ve个体的PBL混合培养产生CTL(CTL-T2/LMP), CTL-T2/LMP对T2/LMP的杀伤显著高于对照T2/HIV的杀伤(26.52%±3.72% vs 7.01%±0.87%, P<0.001); LMP四聚体对CTL-T2/LMP染色的阳性细胞数显著高于对照HIV四聚体 (0.98%±0.33% vs 0.05%±0.01%, P=0.0014); (ⅱ) 加载自身抗原肽的T2细胞(T2/Tyr)可诱导HLA-A2-ve个体的PBL产生CTL(CTL-T2/Tyr), CTL-T2/Tyr对T2/Tyr的杀伤显著高于对T2/HIV的杀伤(28.07%±2.58% vs 6.87±1.01%, P<0.001); Tyr四聚体对CTL-T2/Tyr染色的阳性细胞数显著高于HIV四聚体(0.88%±0.3% vs 0.06±0.03%, P=0.0018). 结果说明: 结合于自身MHC分子上的病毒抗原肽与结合于同种MHC分子上的自身抗原肽都能诱导产生抗原肽特异性的CTL; 在LTMLC诱生的同种CTL中, 有相当数量的CTL具有pMHC特异性, 这些同种CTL的识别机制与普通抗原反应性CTL一样, 识别的对象也是特异性的pMHC. 支持了同种抗原的pMHC种类繁多造成同种T细胞反应强度极高的假说. 利用LTMLC诱生抗原肽特异性同种T细胞方法对于T细胞过继治疗具有潜在的应用价值.     

恶性疟原虫CTL抗原微表位基因重组疫苗的构建和免疫原性预测

选用中国人群常见的MHCⅠ类分子HLA-A2.1和HLA-B51限制性恶性疟CTL抗原表位, 构建了单表位重组疫苗pcDNA3.1/tr和pcDNA3.1/sh,再将上述表位DNA序列串联,构建成双表位重组疫苗pcDNA3.1/ts.将3种重组疫苗分别转染C1R/HLA-A2.1和K562/HLA-B51细胞后均证实表达.单表位重组疫苗pcDNA3.1/tr和pcDNA3.1/sh的表达分别促进细胞表面HLA-A2.1和HLA-B51的稳定性.免疫共沉淀实验证实上述表位促进细胞表面HLAⅠ类分子组装,并提示特异性表位在细胞表面的递呈.双表位重组疫苗pcDNA3.1/ts在以上两个不同细胞系中的表达与两个单表位微型基因的表达结果相似,证明双表位肽的串联编码构型不影响肽链中不同表位的特异性抗原递呈.这一研究结果为进一步设计具有广泛覆盖率的多表位恶性疟重组CTL疫苗提供了理论和实验基础.与常规体外CTL实验不同,本研究观察微表位基因在表达特定MHCⅠ类分子的人细胞中进行内源性抗原递呈的过程,其方法更接近人体内环境,对于人类CTL抗原表位的确定和人重组CTL表位疫苗免疫原性的预测具有重要意义.     

重组牛痘病毒介导的微小基因表达产物OVA257—264在真核细胞中的抗原呈递效率

应用含重组OVA微小基因及全长基因的牛痘病毒感染能够稳定表达Kb 分子的多种真核细胞 ,通过构象特异的单克隆抗体 2 5 .D 1.16 (anti OVA2 57～ 2 64/Kb)检测细胞表面复合物的形成情况 ,并借助四聚体技术检测了它们对抗原特异性T细胞的诱导能力。结果表明四聚体的构建是成功的 ,进一步用已被重组牛痘病毒感染的L92 9 Kb 细胞作为抗原呈递细胞以诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞 (CTL)的产生 ,并对活化后特异性CTL进行检测 ,从胞外IFN γ的分泌情况看 ,诱导后的整个群体细胞发生了活化与增殖 ,H 2Kb OVA四聚体对特异性T细胞进行的结合分析与经典的细胞毒效应相一致。可见 ,重组牛痘病毒介导的微小基因产物OVA2 57～ 2 64不仅能为MHC I类分子的合成提供更有效的肽来源 ,且能更有效诱导特异性CTL的产生。     

Treg细胞和Th17细胞在多发性骨髓瘤中的研究进展

多发性骨髓瘤(MM)系血液系统的恶性肿瘤,以老年人多见.目前治疗以化疗和自身干细胞移植为主,仍难以治愈.多发性骨髓瘤的进展涉及到一系列基因和骨髓微环境的改变,这些改变恰好促进了肿瘤细胞的生长并瓦解了局部的免疫反应.CD4+和CD8+T细胞在多发性骨髓瘤患者体内数量和功能的改变都已经阐明.Treg细胞和Th17细胞的平衡在维持多发性骨髓瘤患者的抗肿瘤免疫中起着至关重要的作用.Treg细胞负责维持机体对外来抗原和自身抗原的免疫耐受.Th17细胞主要参与机体抵抗真菌和寄生虫感染、炎症反应和自身免疫.多发性骨髓瘤患者体内TGF-β和IL-6高水平表达,并可直接或通过其他促炎因子影响Th17细胞的分化,进而调节机体的抗肿瘤免疫应答.因此我们针对Treg细胞和Th17细胞在多发性骨髓瘤中的研究进展进行阐述.     

诱导免疫应答的肿瘤抗原

肿瘤抗原可以诱导机体的免疫应答,是肿瘤的免疫治疗中多肽疫苗的分子基础,近十年来发展起来的肿瘤疫苗筛选方法,利用肿瘤抗原特异性T细胞或抗体识别肿瘤抗原,为临床肿瘤免疫治疗提供了大量备选抗原分子。文中总结了肿瘤抗原的种类,及迄今几乎所有被证明的含有T细胞识别表位的抗原分子及其血清学反应性,为临床肿瘤疫苗的选择提供了依据。     

抗HIV-1细胞毒性T细胞克隆的体外功能研究

人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)特异细胞毒性T细胞(Cytotoxic T-lymphocytes,CTL)是产生保护性免疫应答反应的重要宿主细胞。由于HIV-1特异性CTL免疫应答反应的异质性,CTL有效抗HIV-1病毒反应的功能机制仍然不明确。为了研究HIV-1特异性CTL抗病毒反应的功能特性,本研究应用分离培养的HIV-1特异性CTL克隆细胞株在细胞水平直接测定抗原肽刺激CTL产生的多种功能反应。选取12株具有不同HLA分子和抗原识别表位的HIV-1特异性CTL克隆细胞平行进行多种体外功能实验,包括杀伤活性实验、脱颗粒功能实验、胞内多重细胞因子测定实验,并对CTL的细胞毒性颗粒成分和耗竭分子表达进行定量分析。本研究发现HIV-1特异性CTL克隆细胞的杀伤活性与脱颗粒功能紧密相关,杀伤活性和脱颗粒功能又与多种细胞因子的生成水平和多重功能性相关。这些发现提示HIV-1特异性CTL克隆细胞的多种功能反应之间具有协同调节的机制特点。     

泛素与EB病毒核抗原1融合基因的DNA免疫研究

构建了EB病毒核抗原1(EBNA1)基因的表达质粒pCI-EBNA1和泛素(ubiquitin,Ub)与EBNA1融合基因的表达质粒pCI-Ub-EBNA1.间接免疫荧光和Western blot分析表明,两重组质粒转染HeLa细胞后均能瞬时表达.两种质粒DNA肌肉注射免疫Balb/C小鼠后,分别检测小鼠血清抗EBNA1的抗体和特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应,比较单基因与融合基因DNA免疫所诱生免疫应答的强度.结果显示:二者诱生抗体的效率无明显差别,但泛素的融合使得针对EBNA1的特异性CTL反应明显增强.     

多表位肽抗原诱导特异性CTL抗慢性髓性白血病细胞的体外实验研究

目的：在应用基因工程技术人工表达获得多表位BCR-ABL融合蛋白的基础上,对该融合抗原在体外诱导对自血病细胞的特异性杀伤效应进行检测,探索慢性髓性自血病（CML）免疫治疗的新途径。方法：从外周血单个核细胞培养树突细胞（DC）,以BCR-ABL融合抗原脉冲刺激DC,诱导特异性细胞毒T淋巴细胞（CTL）产生;MTT法检测CTL对白血病靶细胞的特异性杀伤活性。结果：以BCR-ABL融合抗原刺激产生的CTL能特异性抑制b3a2＋的靶细胞生长,包括K562细胞（P〈0．01）和HIJA-A2＋／b3a2＋的CML原代细胞（P〈0．05）,而对HIA-A2-或b2a2＋靶细胞无明显抑制作用。结论：设计表达的多表位BCR-ABL融合抗原能在体外诱导特异性抗CML免疫反应,抑制b3a2＋自血病细胞生长,有望为进一步的体内实验奠定基础。     

六种藓类植物茎的比较解剖学研究

通过对6种藓类植物,即褶叶青藓(Brachythecium salebrosum(Web.et Mohr.)B.S.G.)、湿地匐灯藓(Plagiomnium acutum(Lindb.)Kop.)、侧枝匐灯藓(Plagiomnium maximoviczii(Lindb.)Kop.)、大凤尾藓(Fissidensnobilis Griff.)、大羽藓(Thuidium cymbifolium(Doz.et Molk.)B.S.G.)和大灰藓(Hypnum plumaeforme Wils.)嫩茎和老茎的石蜡切片和显微观察发现,同一藓类植株的嫩茎和老茎,茎结构稳定,不同种藓类植物茎横切面具有不同特征.植物体茎横切面形状、表层细胞的层数、细胞大小和细胞壁厚薄、皮层细胞大小和形状、中轴的有无以及比例等特征可以作为藓类植物的分科分类依据之一.