绿色木霉纤维素酶CBHⅡ基因的结构研究

实验经限制性酶切和双向Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交将重组质粒ｐＣＢＨＩＩ－１４的１４ｋｂ外源片段上的绿色木霉纤维素酶ＣＢＨＩＩ基因定位于４．４ｋｂ的ＥｃｏＲＩ片段上,将该片段克隆于质粒ｐＵＣ１９,获得重组质粒ｐＣＢＨＩＩ。通过限制性分析构建了ｐＣＢＨＩＩ上４．４ｋｂＥｃｏＲＩ片段的物理图谱。在此基础上用质粒制作该片段的亚克隆,采用Ｓａｎｇｅｒ双脱氧链终止法测定了含绿色木霉纤维素酶ＣＢＨＩＩ基因的４０７４ｂｐ的ＤＮＡ序列,由ＧＴ－ＡＧ规则和ｃＤＮＡ序列推知该结构基因由４个外显子和３个内含子组成,总长１６１３ｂｐ,５′端存在与一般真核基因类似的两个特征性调控序列,但３′端不存在真核基因通常具有的特征序列而存在功能未明的短重复序列和嘧啶富集区。并对纤维素酶基因间的同源性和可能的功能作了初步的探讨。     

康宁木霉K801纤维素酶cbh2基因的克隆及序列分析

通过聚合酶链式反应（PCR）技术扩增得到纤维素高产菌株康宁木霉Trichoderma koeningiiK801纤维二糖水解酶（CBHII)基因全序列,并克隆p GEM-Teasy Vector。序列分析表明,所克隆的cbh2基因长1611bpq,包含了纤维二糖解酶基因的完整编码区序列,并含有三个真核生物典型的内含子序列,其中四个外显子序列共同编码一个471aa的蛋白质。该序列是国内首次克隆得到的cbh2编码区全序列,与国外报道的T.reesei已知序列的同源性达到99．89％,只有两上碱基差别,而推测的氨基酸序列只有一个位置疏水性氨基酸之间发生替代,在推测的氨基酸序列上发现3个潜在的N－糖基化位点。     

长梗木霉纤维素酶基因的克隆及序列分析

从富含纤维素环境筛选获得一株纤维素降解菌株FU05,通过形态学特征及ITS序列分析确定其为长梗木霉(Trichoderma longibrachiatum)。PCR扩增获得该菌株的bgl2、cbh2和eg1。序列分析表明,这3种纤维素酶基因与GenBank上其他木霉同种纤维素酶基因具有较高同源性:bgl2基因与里氏木霉bgl2基因(AB003110)同源性达91%;cbh2基因与康宁木霉cbh2基因(DQ504304)同源性达99%;eg1基因与长梗木霉eg1基因(X60652)同源性达95%。3种纤维素酶基因编码的相应氨基酸序列与其他木霉纤维素酶的氨基酸序列相似性也非常高。对上述纤维素酶基因编码的相应蛋白进行PROSITE motif search,对其N端糖基化位点、纤维素结合区、糖基水解酶家族特征结构区等进行了定位。     

纤维素酶的固体培养方法

通过对菌株产酶能力的测定,确定了绿色木霉（Trichoderma viride)HWO7作为生产菌株。研究了培养基组成、培养条件和培养过程对产酶能力的影响,确定了固体培养生产纤维素酶的生产工艺。研究了纤维素酶的酶学特性。在确定工艺条件下,曲料的绝干酶活力（CMC－Na）达2605．1u/g,产品收率79．0％。     

Novel cellulase profile of Trichoderma reesei strains constructed by cbh1 gene replacement with eg3 gene expression cassette

To construct strains of the filamentous fungus Trichoderma reesei with low cellobiohydrolases while high endoglucanase activity, the Pcbh1-eg3-Tcbh1 cassette was constructed and the coding sequence of the cellobiohydrolase I (CBHI) gene was replaced with the coding sequence of the eg3 gene by homologous recombination. Disruption of the cbhl gene was confirmed by PCR, Southern dot blot and Western hybridization analysis in two transforments denoted as L 13 and L29. The filter paper-hydrolyzing activity of strain L29 was 60% of the parent strain Rut C30, and the CMCase activity was increased by 33%. This relatively modest increase suggested that the eg3 cDNA under the control of the cbhl promoter was not efficiently transcribed as the wild type cbhl gene. However our results confirmed that homologous recombination could be used to construct strains of the filamentous fungus Trichoderma reesei with novel cellulase profile. Such strains are of interest from the basic science perspective and also have potential industrial applications.     

缅甸陆龟染色体高分辨G带

我们用高分辨技术揭示缅甸陆龟单组染色体有４０８条高分辨Ｇ带,描述这些带所属的区段及其特征,提供其模式图。     

固态纤维素酶曲的制备

在3.54m~3体积的制曲机中,进行了以蔗髓纤维为基质,用康氏木霉(Trichoderma koningii)P_2,菌株制备纤维素酶曲及其最适参数的研究。稳定试验结果表明,P_2菌株的CMC酶活可达2000 mg/g·30 min,FP酶活10 IU/g·min。     

茶树染色体高分辨G带带型研究

本文应用胰酶法在茶树的晚前期、前中期和早中期的每一染色体的全长上诱导出了清晰而丰富的G带带纹。染色体带纹的数目随染色体的浓缩程度而变化,同源染色体带纹的大小、分布及着色的深浅基本相似。作者认为植物G带的诱导与染色体处理技术及染色体所处的分裂时期密切相关。当胰酶处理超过了G带诱导的临界限度时,常可观察到染色体的大螺旋结构。本文讨论了在染色体前处理中a-溴萘的选用和甲醇-冰醋酸(3:1)的固定时间对G带诱导的影响以及G带的形成与染色体大螺旋结构之间的关系。     

市售洗衣粉提高木霉菌株产生纤维素酶量的研究

加入不同浓度的双猫牌洗衣粉(主要成份为烷基苯磺酸钠)对木霉菌产纤维素酶的能力发生不同的作用。在浓度为0.1%到0.7%时,酶产量逐步提高。然献当加人量为0.8%时,提高作用下降,0.9%与1%时,反而起抑制作用。这可能与适量表面活性剂提高了木霉菌的细胞膜透性,克服其胞内产酶的反馈现象有关;而过高浓度,却使细胞膜破坏。     

高活力纤维素酶菌株康氏木霉B—7的选育与产酶条件的研究

野生型康氏木霉８５４－Ｂ＿２分别经物理化学诱变因子,ＴＤＰ辐射器和空间微重力辐射等因素的多级处理,得到１株形态发生明显改变的变异株Ｂ—７,其固体培养物的纤维素酶各组分酶活力,如滤纸糖酶活力（ＦＰＡ）为３４ｕ／ｇ,羧甲基纤维素酶活力（ＣＭＣ—ａｓｅ）为２９．０ｕ／ｇ,β－葡萄糖苷酶活力（β－Ｇｌａｓｅ）为２９．０ｕ／ｇ,与８５４－β２相比,分别提高５．９倍,７．６倍和４．２倍。其固体培养的最佳条件是：ｐＨ６．０,２８～３０℃,９６小时,最适培养基成分为：青草粉：麸皮＝７：３,１．５～２．０倍水和（ＮＨ４）２ＳＯ４１．５～２．０％（均以固体料计）。     

里氏木霉中纤维素酶的合成诱导及调控*

随着绿色化学的兴起,天然纤维素原料转化和利用的研究受到了高度重视和广泛应用。利用纤维素酶降解纤维素为燃料乙醇、生物柴油的生产铺设了道路。但纤维素酶的生产成本较高,限制了纤维素酶产业化应用。里氏木霉生产的纤维素酶组分丰富,是纤维素酶高产菌株,深入研究里氏木霉的纤维素酶诱导及表达调控机制,有助于提高其纤维素酶产率。近年来人们对里氏木霉的纤维素酶诱导过程和调控机制有了一定研究进展,综述了里氏木霉纤维素酶诱导和基因表达调控,首先介绍了纤维素、纤维二糖、槐糖、乳糖等几种诱导物及诱导物的转运蛋白,进一步综述了几种转录因子的调控作用,同时介绍了染色体调控、信号通路和光条件对纤维素酶诱导的影响。最后展望了未来里氏木霉纤维素酶诱导表达的研究方向,包括探明诱导物的本质及其具体过程、揭示转录因子之间的联系及转录调控网络、寻找信号转导关键功能蛋白及研究环境因素对纤维素酶的诱导作用等。     

L-山梨糖提高木霉纤维素酶合成速率机制的研究

在0.5％葡萄糖-Mandels盐培养液中添加终浓度为0.5％的L-山梨糖,可使里斯木霉(Trichoderma reesei C 30)和拟康氏木霉(Trichoderma pseudokoningii S38)的内切和外切β-1,4葡聚糖酶合成速率在培养的2天内提高4倍。与此同时β-葡萄糖苷酶的合成没有明显变化。L-山梨糖能明显抑制菌丝生长,但对葡萄糖的吸收没有影响,对菌丝分泌纤维素酶的机制影响不大。其对酶合成的促进可能主要是通过降低了菌丝体的生长速率。     

康氏木霉纤维素酶系中C_x酶多分子型的分离纯化及某些性质

从康氐木霉(Trichoderma k(?)ningii)白色变异株As 3.4001的粗酶制剂中,获得了纤维素酶系中的一组C_x酶(C_(x1) C_(x2) C_(x3) C_(x4))。分离步骤包括Sephadex G-75凝胶过滤,DEAESephadex A-50离子交换层析,ConA-Sepharose亲合层析,SE-Sephadex C-50离子交换层析及聚丙烯酰胺凝胶电泳。C_(x1)与C_(x2)的分子量不同而所带电荷相同,它们的分子量各自为44,500和34,000。C_(x2)—C_(x4)的分子量相同而所带电荷不同。纯化的C_(x1)—C_(x4)经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定为单带。比较它们对羧甲基纤维素钠(CMC-Na)的糖化力及液化力表明在作用方式的随机性上C_(x2)>C_(x3)>C_(x1)>C_(x4)。     

康宁木霉液体深层发酵生产纤维素酶

以康宁木霉（ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｋｏｎｉｎｇｉｉ） Ｔ２１５为生产菌,在 ３０ｔ气升式发酵罐中进行了液体深层发酵生产纤维素酶的扩大试验。一、二级罐种子培养基由８％麦麸组成,种龄２４ｈ。产酶培养基由６％稻草粉,１％麦麸和１％蛋白胨组成,起始ｐＨ５．０。每罐装２２ｔ培养基,１０％接种量,通气量０．４ｖｖｍ,罐压０．０８ＭＰａ,２９℃±１℃培养 ９６ｈ。连续试验 ５批,平均发酵液酶活力： ＣＭＣ－Ｎａ活力 ７８．３ＩＵ／ｍＬ,脱脂棉活力 １.３ＩＵ／ｍＬ,水杨苷活力１.４ＩＵ／ｍＬ,滤纸活力     

里氏木霉液体发酵产纤维素酶的研究

在摇瓶试验基础上,采用里氏木霉(Trichoderma reesei)HC-415菌株进行5L自控罐产纤维素酶深层发酵试验。在通气量为 0.2—0.6vvm、搅拌速度为 400r/min、发酵液pH控制在5.8—6.1的条件下,发酵液的羧甲基纤维素(CMC)酶酶活最高为325.0mg糖/ml,滤纸糖酶(FPA)酶活最高达17.9mg糖/ml。发酵周期为108h。所得冻干纤维素酶粉CMC酶活最高3111IU/g,FPA最高135IU/g ,对发酵液得率平均6.7g/L。酶活总收率CMC酶活平均78.2％,FPA酶活平均73.5％。     

蔗渣纤维分解菌的选育及其酶学性质的研究

从土壤中筛选一株产纤维素酶的绿色木霉ＹＢ－１菌株,经紫外线诱变获得一高活力纤维素酶突变株ＹＢ－３,其生长快,产孢子能力强,产生的纤维素酶包括ＣＭＣ,ＦＰＡ和β－葡萄糖苷酶的活力分别可达２０００,４６９和１７５０。研究了碳源,氮源、金属离子和表面活性剂对产酶的影响。最佳培养条件为：起始ｐＨ５．５,温度３０±１℃,温度３０±１℃,时间６０ｈ,正交固体最佳培养基为：复合碳源４．５ｇ（蔗渣：麸皮＝６：４）     

Stimulatory effect of oxidized cellulose on cellulase formation by Trichoderma reesei

Crystalline cellulase has been electrochemically oxidized to yield preparations containing various different percentages of oxidized end-groups. These celluloses have been used as carbon sources for growth and cellulase production by Trichoderma reesei . A low content of oxidized end groups in the celluloses (0.1–0.65%) stimulated cellulase production but not growth, whereas higher contents (> 1%) where inhibitory to both. The cellulolytic enzyme system secreted under stimulated conditions contained the same proportion of individual cellulase enzymes (cellobiohydrolase I and II, endoglucanase I) as the control, indicating a general stimulatory effect of oxidized cellulose. Activity of cellulases against oxidized celluloses in vitro was not stimulated, and only slightly inhibitory at high degrees of oxidation. The data support a potential role of cellulose oxidation in regulating cellulase formation by T. reesei .