STGC3基因缺失突变对CNE2细胞生长增殖能力的影响

为探讨鼻咽癌候选抑癌基因STGC3中层粘连蛋白G结构域(LG domain)对CNE2生长增殖能力的影响,应用基因定点突变技术将该结构域缺失,亚克隆至真核表达载体上,并将野生型及突变型STGC3稳定转染人鼻咽癌细胞系CNE2,检测其对CNE2细胞系表型的影响,包括测定稳转细胞系的生长曲线、细胞集落形成能力和细胞周期分布.研究发现,LGdomain的缺失明显降低了STGC3的肿瘤抑制活性,使受其稳定转染的细胞系恶性度显著增强,提示该结构域在STGC3发挥肿瘤抑制功能中起着重要作用.     

鼻咽癌细胞系CNE2中NPCEDRG基因mRNA剪接变异体的分析

NPCEDRG基因是采用基因定位候选克隆策略获得的1个鼻咽癌候选抑瘤基因. NPCEDRG在鼻咽癌细胞和组织中表达下调,重新恢复NPCEDRG基因在CNE2细胞系的表达,可部分逆转CNE2 的恶性表型. 本研究对CNE2细胞所表达的NPCEDRG基因mRNA剪接变异体克隆、鉴定,发现NPCEDRG基因至少有7个转录起始位点,其中NM_032316的TSS位于ATG上游-85 nt处,AF538150和AK094248的TSS位于-25 nt处;AF538150不存在第2外显子中6核苷酸序列（5′-TTGCAG-3′）的缺失,其CDs为516 bp,编码1种由171个氨基酸组成的蛋白质（而非GenBank中公布的CDs为510 bp,1种由169个氨基酸组成的蛋白质）. 本研究成功克隆得到1种新的NPCEDRG基因的mRNA剪接变异体V2,其TSS位于-23 nt处,其CDs为297 bp,编码1种由98个氨基酸组成的蛋白质.     

鼻咽癌中差异表达基因的分析和克隆

为了验证通过ＣＤＮＡ代表性差性分析法（ｃＤＮＡ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ,ｃＤＮＡ ＲＤＡ）分离的ＣＤＮＡ序列在鼻咽癌活给组织中的差异表达,并进一不克隆鼻咽癌差异表达基因,采用ＲＴ－ＰＣＲ方法并结合Ｎｏｔｔｈｅｒｎ杂交确定其转录本的大小,进而充分利用生物信息学对有差异表达ＣＤＮＡ全长进行克隆,并对其基因产物进行了结构和功能预测。结果显示,ＡＦ０９１５     

Epstein—Barr病毒反义LMP1基因对鼻咽癌细胞CNE2株生长的抑制

将０．６ｋｂＬＭＰ１前段基因反向插入逆转录病毒载体（ｐＺＩＰ）中,构建成ｐＺＩＰ－反义ＬＭＰ１载体,再转入ＰＡ３１７包装细胞中,用Ｇ４１８筛选性克隆,获得产生１．７×１０＾５（ＣＦＵ／ｍｌ）反杂交实验证实ｐＺＩＰ－反义ＬＭＰ１载体基车整合到ＣＮＥ２细胞的ＤＮＡ中,并且有载体基因ＲＮＡ的表达,观察反义ＬＭＰ１基罟对ＣＮ＃２细胞生长的影响,发现反义ＬＭＰ１基因可降低细胞生长速度,减弱ＣＮＥ２细胞在这果     

鼻咽癌相关基因 BRD7 对鼻咽癌细胞CNE1的影响

为了研究BRD7基因对鼻咽癌细胞CNE1的影响,通过脂质体转染方法,将BRD7基因导入NPC细胞株CNE1细胞中.通过细胞生长曲线发现该基因能够抑制CNE1细胞的生长.为了探讨可能的作用机制,进而采用蛋白质组技术研究该基因对鼻咽癌蛋白质表达谱的影响,从而研究该基因在CNE1中的地位和作用.通过对过表达BRD7基因后鼻咽癌细胞系CNE1的蛋白质表达谱改变的研究,鉴定出19个差异表达蛋白,这些蛋白质包括:BCCIP (BRCA2 and CDKN1A(p21(Waf1/Cipl)),FHL2(four and a half LIM domains 2),Chloride channel regulatory protein;Hin-1(high-in-normal-1),WISP-1(connective tissue growth factor related protein),SREC-4(scavenger receptor expressed by endothelial cells-2),folate receptor.这些差异蛋白涉及到基因表达调控、细胞黏附等众多的事件.从另一个侧面研究了BRD7基因与鼻咽癌的关系,扩展了BRD7基因的研究范围,并进一步充实了该基因做为鼻咽癌候选抑瘤基因的证据.     

对鼻咽癌恶性转化基因Tx表达的初步研究

运用杂交组化及Ｎｏｒｔｈｅｒｎ法,对中国人鼻咽癌细胞株恶性转化基因Ｔｘ的表达进行了初步研究。结果表明该基因在鼻咽癌细胞株中表达１．３ｋｂｍＲＮＡ,但表达强度较低,在ＨＰＶ阳性或阴性人宫颈癌细胞中均无表达,ＥＢＶ阴性的Ｂ淋巴细胞系及ＨＴＬＶ－１阳性的Ｔ细胞系中为阴性,而在ＥＢＶ阳性的Ｂ９５－８及Ｒａｊｉ细胞中Ｔｘ基因表达强烈,从而提示ＨＰＶ及ＨＴＬＶ－１不增强Ｔｘ的表达水平,而ＥＢＶ可能使Ｔｘ基因活化．这为进一步研究ＥＢＶ与Ｔｘ等瘤基因协同作用提供了新的依据。     

Tet调控STGC3基因表达CNE2细胞系的建立及其功能初步研究

利用Tet-on调控系统,建立受强力霉素诱导STGC3基因表达的CNE2细胞系,为进一步研究STGC3的功能提供了一个理想的实验平台.先后将调控质粒pTet-on和反应质粒pTRE-STGC3转染入CNE2细胞,并用G418和潮霉素分别进行两轮筛选,运用RT-PCR选择对强力霉素诱导敏感的细胞克隆.用不同浓度强力霉素诱导CNE2/Tet/pTRE-STGC3细胞,RT-PCR检测STGC3的表达,确定强力霉素的最佳诱导浓度.采用此浓度的强力霉素分别诱导CNE2、CNE2/Tet/pTRE、CNE2/Tet/pTRE-STGC3三组细胞,测定细胞的生长曲线、克隆形成率和细胞周期分布.诱导STGC3基因高表达,CNE2细胞增殖速度显著减慢(P<0.05),克隆形成能力显著降低(P<0.01);流式细胞仪检测结果显示,瘤细胞群体中处于G0/G1期细胞数增加,细胞阻滞于G0/G1期.Tet调控STGC3基因表达CNE2细胞系的成功建立,为进一步研究STGC3基因的功能提供一个理想的细胞模型.     

雌激素对转STGC3基因CNE2细胞系生长增殖的影响

为探讨雌激素对STGC3基因抑瘤的促进作用,将重组的pcDNA3.1( )-STGC3真核表达载体导入鼻咽癌细胞系CNE2,经G418筛选,RT-PCR及蛋白质印迹检测STGC3的表达,获得稳定高表达STGC3基因的pcDNA3.1( )/STGC3/CNE2细胞系.采用细胞计数法,检测雌二醇(β-estradiol)对体外培养pcDNA3.1( )/STGC3/CNE2细胞生长增殖的影响.将pcDNA3.1( )/STGC3/CNE2细胞接种于裸小鼠前肢背部皮下,观察分析雌性与雄性裸鼠成瘤的差别.运用RT-PCR、免疫组织化学及蛋白质印迹方法,分别从mRNA及蛋白质水平,分析STGC3基因在裸鼠移植瘤组织中的表达状况.移植瘤组织病理切片检查,观察瘤细胞形态学变化.用流式细胞仪测定移植瘤组织的细胞周期分布.研究结果表明:细胞体外培养,pcDNA3.1( )/STGC3/CNE2细胞经β-estradiol处理后,其生长速度明显减缓(P<0.05);裸鼠体内研究,接种pcDNA3.1( )/STGC3/CNE2细胞实验组的移植瘤体积和重量均小于对照组,差异有显著性意义(P<0.05);实验组中,雌性裸鼠组移植瘤体积和重量均小于雄性组,差异有显著性意义(P<0.05),雌性裸鼠组移植瘤生长最慢,而对照组中雄性与雌性裸鼠组间瘤块的差异无显著性意义(P>0.05);接种pcDNA3.1( )/STGC3/CNE2细胞的雌性裸鼠组移植瘤,阻滞于G0/G1期细胞数大于其他各组(P<0.05).上述体内外研究结果显示,雌激素可能具有增强STGC3基因对CNE2细胞系的生长抑制作用.     

cDNA微阵列技术分析NAG7基因对鼻咽癌细胞基因表达谱的影响

运用cDNA微阵列技术分析NAG7基因重表达对HNE1细胞基因表达谱的影响.抽提HNE1细胞和pcDNA3.1(+)/NAG7/HNE1细胞总RNA,分离polyA mRNA,将mRNA逆转录为cDNA,并在逆转录过程中用³³P-dATP进行标记,与含有16 150个基因和表达序列标签(EST)的cDNA表达阵列膜杂交,获得基因表达图谱.Array Gauge软件分析NAG7基因的重表达所导致的鼻咽癌细胞HNE1基因表达谱改变,并用RNA印迹对微阵列杂交结果进行验证.结果分析表明,2倍以上的差异表达基因或EST 179个,其中表达上调的91个,表达下调的88个;已明确基因表达产物的上调基因29个,下调基因37个.在差异表达基因中,涉及基因转录调控、信号转导、细胞生长、细胞代谢和细胞凋亡等基因.RNA印迹证实生长阻滞特异蛋白1（gas 1）基因表达上调.特别值得关注的是, 先前的蛋白质组研究结果亦发现NAG7基因可导致生长阻滞特异蛋白1表达上调,说明gas 1基因在NAG7重表达的HNE1细胞中具有重要作用,这为深入研究NAG7基因的作用环节和机理提供了重要的线索.     

鼻咽癌、胃癌中抑癌基因ING1的突变检测

为探讨抑癌基因ING1是否在鼻咽癌和胃癌中存在基因突变,以确定该基因在鼻咽癌、胃癌发病过程中所起的作用,本研究运用PCR－SSCP法分别对鼻咽癌和胃癌组织ING1点突变情况进行检测;对30例鼻咽癌组织和26例胃癌组织的ING1外显子1b扩增的PCR产物进行SSCP分析,结果未发现所扩增的片段有泳运速率的改变,以上结果可以初步排除ING1在鼻咽癌和胃癌中以基因突变方式失活的可能。     

Tet调控STGC3基因表达的CNE2细胞系裸鼠成瘤实验性研究

STGC3基因是一个新近克隆的肿瘤相关基因,前期的体外实验研究结果表明,STGC3基因在CNE2鼻咽癌细胞系高表达,可明显抑制CNE2的生长增殖.采用Tet/pTRE-STGC3/CNE2细胞系接种于裸鼠皮下,以强力霉素(Dox)诱导STGC3基因高表达,观测STGC3基因高表达对CNE2裸鼠体内成瘤的影响,并探讨其可能作用机制.运用RT-PCR、蛋白质印迹及免疫组织化学方法,分别从mRNA和蛋白质水平,分析瘤组织中STGC3基因的表达;用流式细胞仪检测移植瘤组织内肿瘤细胞的凋亡情况;用免疫组织化学方法,检测移植瘤组织凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达.研究结果显示,STGC3蛋白表达主要定位于细胞核内,Dox诱导STGC3基因在Tet/pTRE-STGC3/CNE2细胞系高表达,Tet/pTRE-STGC3/CNE2细胞系裸鼠体内成瘤受到明显抑制,与对照组比较,移植瘤成瘤时间晚、生长慢、肿块小、细胞凋亡率高,Bax蛋白表达增强,Bcl-2蛋白表达减少,差异有显著性意义(P<0.01).此体内实验研究结果与前期体外实验结果一致,进一步证明STGC3基因对肿瘤细胞生长具有抑制作用.     

可调控小鼠尿激酶原激活剂真核表达载体的构建及其在Huh7细胞中的表达

目的：建立基于Tet-on系统的可调控真核细胞表达小鼠尿激酶原激活剂（uPA）的诱导表达系统。方法：提取C57小鼠肾组织总RNA,RT-PCR扩增uPAcDNA序列;提取基因组DNA,扩增uPA编码区后最后一个外显子序列,构建pTRE2-uPAcDNA-700载体,将其与pTet-on瞬时共转染Huh7细胞系,24h后用强力霉素诱导表达,诱导后36h分别收集细胞和培养上清（诱导组）,提取细胞总RNA并进行细胞uPA转录水平的检测;采用溶圈法对细胞分泌至培养上清中uPA的生物活性进行检测,同时以转染但未诱导Hun7（未诱导组）和正常培养Huh7（正常对照组）细胞及培养上清作为对照。结果：与未诱导组和正常对照组相比较,仅诱导组在转录水平上扩增出目的条带;溶圈法证实转染的细胞不仅表达uPA,而且表达的蛋白具有一定的生物活性。结论：构建了可调控的uPA真核诱导表达系统,为进一步制备可调控肝细胞表达uPA转基因小鼠及进一步揭示uPA肝损伤机理奠定了基础。     

Tet 调控的脑相对特异性新基因 LRRC4表达细胞系的构建

LRRC4是一个在脑相对特异性表达的富亮氨酸重复超家族新成员,在神经胶质瘤表达明显下调或缺失且具有抑制脑胶质瘤细胞生长的潜能. 利用 Tet-on 基因表达系统,经过两轮转染,先后将调控质粒 pTet-on 和表达质粒 pTRE-2hyg-LRRC4 转染 U251 细胞系,分别用 G418 和潮霉素 Hygromycin 进行两次筛选. 在第一轮挑取的 80 个克隆中,利用 pTRE-2hyg-luciferase 报告基因进行最佳的低背景高表达的 pTet-on 细胞克隆筛选,在通过量效关系和动力学检测筛选的最佳克隆基础上,再进行 pTRE-2hyg-LRRC4 的转染,并通过 RT-PCR 和 RNA 印迹检测,成功获得了两个具有良好诱导性 Tet 调控的 LRRC4 双稳定表达细胞系,为进一步阐明 LRRC4 在脑胶质瘤发生发展中的作用,提供有利的研究基础和理想的实验平台.     

基因甲基化导致鼻咽癌组织14-3-3σ表达下调

为探讨14-3-3σ基因甲基化在鼻咽癌发病中的作用,以75例鼻咽癌活检组织和25例正常鼻咽黏膜活检组织作为研究对象,采用甲基化特异性聚合酶链式反应 (MSP)检测14-3-3σ基因甲基化状态,逆转录聚合酶链式反应 (RT-PCR)检测　14-3-3σ mRNA表达,免疫组织化学染色检测14-3-3σ蛋白质表达．结果发现,鼻咽癌组织14-3-3σ基因完全甲基化、不完全甲基化和未甲基化的例数分别为4例、59例和12例,正常鼻咽黏膜组织不完全甲基化和未甲基化的例数分别为7例和18例,鼻咽癌14-3-3σ基因甲基化频率显著高于正常鼻咽黏膜组织(84% vs 28%,χ2=28,P < 0.05)．RT-PCR和免疫组织化学染色结果显示：14-3-3σ基因完全甲基化的组织样本无14-3-3σ表达,不完全甲基化的组织样本14-3-3σ表达显著降低,14-3-3σ基因甲基化与鼻咽癌淋巴结转移及鼻咽癌临床分期正相关． 研究结果表明,鼻咽癌组织14-3-3σ基因存在高频甲基化,14-3-3σ基因甲基化导致14-3-3σ表达降低或缺失,14-3-3σ表达水平与鼻咽癌淋巴结转移及其临床分期相关．     

过表达Runx2促进C2C12细胞成骨分化

利用Tet-on(Tetracycline-on)基因表达系统,通过强力霉素(doxycycline,DOX)诱导Runx2基因在C2C12细胞中的表达,探究Runx2促成骨分化功能,为其分子机制的研究提供一个理想的实验平台.先后将调控质粒pTet-on和反应质粒pTRE-Flag-Runx2转染入C2C12细胞,并用G418和潮霉素分别进行2轮筛选,运用实时荧光定量PCR选择对强力霉素诱导敏感的细胞克隆.用不同浓度DOX诱导C2C12/Tet/pTRE-Flag-Runx2细胞,蛋白免疫印迹检测Runx2的表达,确定DOX的最佳诱导浓度与时间,并检测C2C12细胞的成骨分化能力.结果表明,诱导细胞最佳DOX浓度为10μg/ml;最佳诱导时间为12h;诱导后Runx2基因高表达,C2C12细胞向成骨方向分化(P0.05).成功建立Tet调控Runx2基因表达C2C12细胞系,为进一步研究Runx2基因功能分子机制提供理想的细胞模型.     

Tet调控CYP2E1基因表达细胞系的代谢能力分析

应用Tet-On基因表达系统,调控CYP2E1基因在NIH 3T3细胞中的表达水平,探讨CYP2E1在化学致癌物二甲基亚硝胺(N-nitrosodimethylamine, NDMA)代谢中的作用．先后将 Tet-on基因表达系统的调控质粒pRevTet-on和反应质粒pRevTRE-2E1转染NIH 3T3细胞,分别用G418和潮霉素筛选,并通过RT-PCR和Western印迹检测,成功获得了3个具有良好诱导性Tet调控的CYP2E1基因表达细胞系（Tet/3T3-2E1）．应用不同浓度强力霉素(doxycycline, Dox)处理Tet/3T3-2E1细胞诱导CYP2E1表达,HPLC分析细胞对CYP2E1特异性药物探针氯唑沙腙的原位代谢能力及MTT法分析CYP2E1介导的NDMA细胞毒性作用．结果显示,Tet/3T3-2E1细胞CYP2E1的表达及其代谢能力有明显的Dox浓度依赖性,而且NDMA对Dox诱导组细胞有明显浓度依赖性细胞毒性作用,其IC₅₀值为12.06 μmol/L,无Dox诱导组未见明显的NDMA细胞毒性作用．该细胞模型的成功建立对于开展与CYP2E1相关的毒物、致癌物代谢研究,筛选抗毒物、抗癌物等具有重要价值．     

The tumor supressor function of STGC3 and its reduced expression in nasopharyngeal carcinoma

STGC3 is a novel candidate tumor suppressor gene that was found to be associated with nasopharyngeal carcinoma (NPC) via the cDNA cloning and RACE processes. The biological function of the STGC3 protein and its expression level in nasopharyngeal carcinoma remain unknown. This study aimed to evaluate the STGC3 protein expression level in NPC and to investigate the inhibitory function of STGC3 as a candidate tumor suppressor gene. We assessed the expression of the STGC3 protein in NPC biopsies and normal control specimens via Western blot and immunohistochemical analysis. The expression of STGC3 as induced by doxycycline (Dox) via a tetracycline (Tet)-regulated system in human nasopharyngeal carcinoma cell line CNE2 was also established, and the effect of STGC3 restoration on the biological behavior of CNE2 was observed. A reduced level of STGC3 expression (0.978 ± 0.213 versus 0.324 ± 0.185, P < 0.05) was detected in NPC versus normal nasopharyngeal tissue by Western blot assay. Immunohistochemical assays for STGC3 detected positive staining in the nuclei and cytoplasm of epithelial cells, and the positive expression rate in NPC, 8 of 21 (38%), was lower than that in normal nasopharynx samples, 16 of 22 (72%). After STGC3 expression was restored, the growth capacity and clone formation potential of CNE2 cells in soft agar were significantly suppressed, and the cell percentage in G₀/G₁ phase increased, while the percentage of cells entering the S and G₂ phases decreased. This indicates that an abnormality in STGC3 expression is associated with nasopharyngeal carcinogenesis and that it may play an important role in controlling cell growth and regulating the cell cycle.