日本血吸虫琥珀酸脱氢酶铁硫蛋白全长cDNA的克隆、表达及保护性免疫评价

根据GenBank日本血吸虫(Schistosoma japonicum)琥珀酸脱氢酶铁硫蛋白(SjSDISP)不完整的表达序列标签(BU804141)以及日本血吸虫成虫cDNA文库载体多克隆位点邻近核苷酸序列设计引物, 以日本血吸虫成虫cDNA文库为模板, 采用锚式PCR策略, 对SjSDISP cDNA不完整的3′端和5′端进行扩增、测序, 用序列比对拼接电子软件比对, 基于重叠区进序列合并, 获得1071 bp的SjSDISP全长cDNA. 序列分析推断该片段含有编码SjSDISP基因的完整阅读框, 编码278个氨基酸残基. 将其编码基因克隆到原核表达载体pQE30上, 在大肠杆菌M15中获得准确、高效表达, 表达产物分子量约为32 kD. 用日本血吸虫成虫抗原免疫血清对表达产物进行Western blot检测, 在预测位置上出现明显的识别条带. 用纯化的重组蛋白rSjSDISP免疫小鼠, 进行动物免疫保护性评价, 在虫荷、每克肝卵、每克粪卵和每雌子宫内卵数方面, 与佐剂对照组比较差异均具有显著性(P<0.05, P<0.01). 结果表明, 日本血吸虫琥珀酸脱氢酶铁硫蛋白酶(SjSDISP)全长cDNA成功克隆并在大肠菌中得到表达; 表达产物具有良好的抗原性和动物免疫保护效果, 是一种潜在的具有部分免疫保护性的抗日本血吸虫病疫苗候选分子.     

日本血吸虫新抗原基因的筛选、克隆、 表达和免疫效果研究

为了寻找日本血吸虫 (Schistosoma japonicum, Sj) 新的疫苗候选基因并进行免疫效果研究,用 Sj 雌虫抗原免疫家兔制备血清,对Sj成虫 cDNA 文库进行免疫筛选,将获得的新基因 ( 命名为Sj-F1, GenBank 登录号为 AY261995) 克隆入原核表达载体 pTWIN1 和真核表达载体 pcDNA3 ,经 PCR 、限制性酶切筛选和鉴定阳性重组子. 将 pTWIN1/Sj-F1 质粒转化大肠杆菌 ER2566,在低温和低 IPTG 浓度下诱导表达可溶性重组融合蛋白 (rSj-F1/intein2),并经 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 和蛋白质印迹 (Western blot) 分析鉴定. 将 pcDNA3/Sj-F1 质粒转化大肠杆菌 ER2502 ,大量制备 DNA 疫苗. 用重组融合蛋白和 DNA 疫苗免疫小鼠,末次免疫后 2 周用Sj尾蚴进行攻击感染. 感染后 42 天剖杀冲虫,计算减虫率和减卵率. 感染前采血用 ELISA 法检测抗体. 免疫保护效果测定显示：重组蛋白疫苗以 FCA 作佐剂经皮下免疫和以壳聚糖作佐剂经粘膜免疫分别获得了 28.07%、 24.69% 的减虫率和 48.30% 、 46.38% 的减卵率; DNA 疫苗 (pcDNA3/Sj-F1) 单独免疫获得了 18.47% 的减虫率和 35.06% 的减卵率;用 DNA 疫苗启动免疫后用重组蛋白疫苗经皮下加强免疫,减虫率和减卵率分别提高到了 40.42% 和 56.17%;用 DNA 疫苗启动免疫后用重组蛋白疫苗经黏膜加强免疫,减虫率和减卵率增高更明显,分别提高到了 42.38% 和 62.87%. 结果表明,Sj-F1 重组蛋白疫苗及 DNA 疫苗均可诱导小鼠产生部分抗血吸虫感染的保护力,两者联合免疫保护效果优于单一疫苗.     

应用RNA干扰技术体外抑制兔成纤维细胞HGPRT的表达及其核移植研究

次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶( hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase,HGPRT )的功能缺失与痛风、肾结石和雷纳综合症(Lesch-Nyhan Syndrome)等疾病相关．制作HGPRT基因表达降低的模式动物,将有利于人们对这种疾病的发病机理和治疗做进一步的研究．构建了针对HGPRT基因表达的shRNA干扰载体,并将质粒转染兔成纤维细胞,获得携带该干扰片段的转基因细胞系,经PCR鉴定转基因成纤维细胞克隆阳性率为83.3%．RT-PCR及Western blot检测结果表明转基因干扰成纤维细胞系HGPRT mRNA和蛋白质表达量明显降低．最后,以转基因成纤维细胞进行核移植,囊胚率为27.8%,与正常来源的成纤维细胞囊胚率相比较差异不显著．说明,通过RNAi可稳定干扰兔成纤维细胞HGPRT基因的表达,为进一步通过核移植技术建立HGPRT RNAi转基因兔模型创造条件．     

黄鳝Hprt基因的克隆及表达分析

次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Hprt)参与嘌呤核苷酸的补救合成。采用RACE技术克隆了黄鳝的次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因,它的全长cDNA 为1 452 bp,预测编码218个氨基酸,与人类、小鼠、鸡和斑马鱼等脊椎动物Hprt氨基酸序列之间的同源性超过76.7％。基于该基因氨基酸序列构建了进化树,显示与斑马鱼Hprt基因更同源。RT-PCR表明黄鳝Hprt基因在多种组织中广谱表达,表明黄鳝该基因在功能和进化上的保守性。      

3,5,2',4'-四羟基查尔酮对小鼠尿酸及尿酸合成相关酶基因的影响

用氧嗪酸钾诱导高尿酸血症动物模型,对化合物3,5,2',4'-四羟基查尔酮(P40)的降尿酸作用及尿酸合成相关酶基因进行研究。用磷钨酸法测定小鼠血清尿酸水平,用RT-PCR测定脑组织中次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)、肝脏中的磷酸核糖焦磷酸合成酶(PRPS)和磷酸核糖焦磷酸酰胺转移酶(PRPPAT)mRNA的表达水平。结果表明:灌胃给予高尿酸血症小鼠P40 2、4、8 mg/kg和阳性对照药别嘌醇1 mg/kg,共给药5次,每天2次,均显著降低血清尿酸水平(P0.05,0.01),具有显著的降尿酸作用;但对HGPRT、PRPS、PRPPAT的mRNA表达水平无明显影响。     

次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶突变体的基因构建、表达和性质

通过对我国嗜热菌Thermoanaerobactertengcongensis中次黄嘌呤 鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 (HGPRT)三维结构进行同源模建 ,设计出HGPRT的突变体K1 33A、K1 33S和K1 33T。用抗性筛选法 ,对HGPRT的基因进行了定点突变 ,并实现了在大肠杆菌中的高效表达。野生型HGPRT及其突变体K1 33A、K1 33S和K1 33T的催化动力学研究表明 ,HG PRT突变体改变并扩大了底物专一性 ,具有催化嘌呤类似物的活性。     

日本血吸虫中国大陆株抱雌沟蛋白编码基因的克隆和表达

根据曼氏血吸虫抱雌沟蛋白SmGcp序列和日本血吸虫编码抱雌沟蛋白保守区的基因片段jGcp1分别设计三对引物,以日本血吸虫中国大陆株成虫mRNA为模板 ,用RT－PCR法扩增出大小为1949bp的基因片段。经序列分析推断该基因片段含编码日本血吸虫抱雌沟蛋白基因的阅读框,与SmGcp碱基一致性为85％,其理论推测氨基酸组成与曼氏血吸虫抱雌沟蛋白的一致性为83．7％。将上述扩增的基因片段克隆到表达载体pET28c( )中,在大肠杆菌BL21中获得表达,融合表达产物分子量约为80kD。利用日本血吸虫成虫抗原免疫血清对该表达产物进行Western印迹检测,在预测位置出现了明显的识别条带,说明该编码日本血吸虫中国大陆株抱雌沟蛋白基因的表达产物具有抗原性。     

日本血吸虫信号转导蛋白Sjwnt_4基因的克隆、表达及功能分析

由Wnt基因家族产物与其它相关基因产物构成的Wnt信号通路,是细胞发育和生长调节的一个关键途径,对动物的发育特别是生殖系统的发育起重要的调节作用。在人类和小鼠中,Wnt4蛋白是性腺分化过程中主要调节因子,在胚胎发育中起着关键作用。利用RACE技术从日本血吸虫19d童虫中首次扩增到一个Wnt家族基因,序列分析表明该基因的完整编码框含1311bp,编码436个氨基酸,理论分子量49.6kD。同源性分析结果表明,该基因的氨基酸序列具有典型Wnt家族蛋白特征,与日本三角涡虫、人Wnt4的氨基酸序列相似性分别达43％、37％,推测为血吸虫的Wnt4基因,命名为Sjwnt4（GenBank登陆号DQ643829）。实时定量PCR分析显示该基因在14d童虫、19d童虫、31d虫体、44d雌虫及44d雄虫中均有表达,其中19d童虫中的表达量明显高于其它发育阶段,44d雌虫中的表达量明显高于雄虫。构建了该基因的原核表达载体pGEX_4T_2_Sjwnt4,应用大肠杆菌系统进行了表达,表达蛋白以包涵体形式存在,Western印迹显示表达产物能被日本血吸虫成虫粗抗原免疫血清所识别。Sjwnt4基因及其表达产物的获得,为探索Wnt信号通路对血吸虫发育、生殖的调节提供了重要基础。     

日本血吸虫信号转导蛋白Sjwnt_4基因的克隆、表达及功能分析

由Wnt基因家族产物与其它相关基因产物构成的Wnt信号通路,是细胞发育和生长调节的一个关键途径,对动物的发育特别是生殖系统的发育起重要的调节作用。在人类和小鼠中,Wnt4蛋白是性腺分化过程中主要调节因子,在胚胎发育中起着关键作用。利用RACE技术从日本血吸虫19d童虫中首次扩增到一个Wnt家族基因,序列分析表明该基因的完整编码框含1311bp,编码436个氨基酸,理论分子量49.6kD。同源性分析结果表明,该基因的氨基酸序列具有典型Wnt家族蛋白特征,与日本三角涡虫、人Wnt4的氨基酸序列相似性分别达43％、37％,推测为血吸虫的Wnt4基因,命名为Sjwnt4（GenBank登陆号DQ643829）。实时定量PCR分析显示该基因在14d童虫、19d童虫、31d虫体、44d雌虫及44d雄虫中均有表达,其中19d童虫中的表达量明显高于其它发育阶段,44d雌虫中的表达量明显高于雄虫。构建了该基因的原核表达载体pGEX_4T_2_Sjwnt4,应用大肠杆菌系统进行了表达,表达蛋白以包涵体形式存在,Western印迹显示表达产物能被日本血吸虫成虫粗抗原免疫血清所识别。Sjwnt4基因及其表达产物的获得,为探索Wnt信号通路对血吸虫发育、生殖的调节提供了重要基础。     

麻疹疫苗诱发中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K_1)染色体畸变和基因突变的研究

实验证明,麻疹病毒及其疫苗可诱发染色体畸变。近年来,病毒活疫苗诱变性的研究由细胞水平深入到基因水平,已经发现脊髓灰质炎疫苗和流感疫苗可诱发中国仓鼠细胞(V79)HGPRT位点突变,但有关麻疹疫苗的研究,还未见报道。本实验以中国仓鼠卵巢细胞(CHO)次黄嘌呤——鸟嘌呤磷酸核糖转移酶位点突变检测系统(CHO/HGPRT)检测国产麻疹疫苗的诱变性,为麻疹疫苗遗传安全性的认识提供依据。     

Cloning, expression and protective immunity evaluation of the full-length cDNA encoding succinate dehydrogenase iron-sulfur protein of Schistosoma japonicum

1071-bp fragment was obtained from the Schistosoma japonicum (Chinese strain) adult cDNA library after the 3' and 5' ends of the incomplete expression sequence tag (EST) of succinate dehydrogenase iron-sulfur protein of Schistosoma japonicum (SjSDISP) were amplified by the anchored PCR with 2pairs of primers designed according to the EST of SjSDISP and the sequence of multiclone sites of the library vector. Sequence analysis indicated that the fragment was a full-length cDNA with a complete open reading frame (ORF), encoding 278 amino acid residues. The fragment was cloned into prokaryotic expression vector pQE30, and subsequently sequenced and expressed in Escherichia coll.SDS-PAGE and Western-blot analyses showed that the recombinant protein was about 32 kD and could be recognized by the polyclonal antisera from rabbits immunized with Schistosoma japonicum adult worm antigen. Compared with the FCA controls, mice vaccinated with rSjSDISP (test) or rSjGST (positive control) all revealed high levels of specific antibody and significant reduction in worm burden, liver eggs per gram (LEPG), fecal eggs per gram (FEPG) and intrauterine eggs. These results suggest that SjSDISP may be a novel and partially protective vaccine candidate against schistosomiasis. In contrast to the worm burden reduction rate, the higher degree of egg reduction rate in the test group also suggested that SjSDISP vaccine may primarily play a role in anti-embryonation or anti-fecundity immunity.     

Cloning, expression and protective immunity evaluation of the full-length cDNA encoding succinate dehydrogenase iron-sulfur protein of Schistosoma japonicum

1071-bp fragment was obtained from the Schistosoma japonicum (Chinese strain) adult cDNA library after the 3′ and 5′ ends of the incomplete expression sequence tag (EST) of succinate dehydrogenase iron-sulfur protein of Schistosoma japonicum (SjSDISP) were amplified by the anchored PCR with 2 pairs of primers designed according to the EST of SjSDISP and the sequence of multiclone sites of the library vector. Sequence analysis indicated that the fragment was a full-length cDNA with a complete open reading frame (ORF), encoding 278 amino acid residues. The fragment was cloned into prokary- otic expression vector pQE30, and subsequently sequenced and expressed in Escherichia coli. SDS-PAGE and Western-blot analyses showed that the recombinant protein was about 32 kD and could be recognized by the polyclonal antisera from rabbits immunized with Schistosoma japonicum adult worm antigen. Compared with the FCA controls, mice vaccinated with rSjSDISP (test) or rSjGST (posi- tive control) all revealed high levels of specific antibody and significant reduction in worm burden, liver eggs per gram (LEPG), fecal eggs per gram (FEPG) and intrauterine eggs. These results suggest that SjSDISP may be a novel and partially protective vaccine candidate against schistosomiasis. In contrast to the worm burden reduction rate, the higher degree of egg reduction rate in the test group also sug- gested that SjSDISP vaccine may primarily play a role in anti-embryonation or anti-fecundity immunity.     

日本血吸虫真核翻译起始因子5基因的cDNA克隆和免疫保护功能分析

利用抑制削减杂交法筛选日本血吸虫雌雄虫差异基因,从中获得真核翻译起始因子5基因(eIF5)的 表达序列标。对该序列进行生物信息学分析:对其5’端进行电子延伸,获得含完整开放阅读框的cDNA序列 (AY686501)。将其亚克隆到表达载体pET-28c,进行重组表达。免疫保护效果实验表明,重组表达蛋白具有显著 抑制血吸虫卵在寄主肝脏中的沉积效果。     

日本血吸虫中国大陆株21.7kD蛋白编码基因的克隆和表达

根据日本血吸虫菲律宾株编码21.7kD蛋白的基因设计引物,以日本血吸虫中国大陆株成虫mRNA为模板,用RT-PCR法扩增出大小为558bp的基因片段。经序列分析推断该基因片段为编码日本血吸虫中国大陆株21.7kD蛋白基因的完整阅读框,与菲律宾株该基因的碱基序列同源性为98%。将其克隆到表达载体pET28a(+)中,在大肠杆菌BL21中获得表达,融合表达产物分子量约为25.4kD。利用日本血吸虫成虫抗原免疫血清对该表达产物进行Western印迹检测,在预测位置出现了明显的识别条带,说明该基因的表达产物具有抗原性。     

Clonorchis sinensis: expression, characterization, immunolocalization and serological reactivity of one excretory/secretory antigen-LPAP homologue

From a Clonorchis sinensis adult cDNA plasmid library, a cDNA clone encoding a novel lysophosphatidic acid phosphatase (LPAP) homologue was isolated. The predicted molecular weight of putative protein was 48.8 kDa and the deduced amino acid sequence had 45%, 32%, and 29% identity with LPAP of Schistosoma japonicum, Danio rerio, and Homo sapiens, respectively. Prediction of signal peptide and Western blot analysis indicated that the CsLPAP homologue was an excretory-secretory antigen (ES antigen) of C. sinensis. Immunostaining revealed that the CsLPAP was markedly localized in the intestinal cecum, seminal receptacle and eggs of the adult worm. The recombinant CsLPAP showed slightly higher sensitivity (82.14%) and specificity (85.86%) than the crude worm antigen by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), a result which suggested that the recombinant antigen might be valuable in the serodiagnosis of human clonorchiasis.     

日本血吸虫新基因Sj-MA的克隆、表达及保护性免疫

为发现新基因 ,寻找日本血吸虫病新疫苗候选分子 ,采用Sj雄虫免疫血清筛选Sj成虫cDNA文库。经测序发现新基因Sj MA含有一个完整的阅读框 ,推测其由 2 4 9个氨基酸组成 ,编码分子量为 2 8.8kD的可溶性蛋白质 ,并带有多个能被磷酸化激活的位点 ,提示其可能为一重要的信息传递分子。将Sj MA的cDNA亚克隆至原核表达载体pGEX 5X ,获得Sj MA原核表达的重组体rSj MA/GST ,并在E .coli中高效表达为谷胱甘肽S 转移酶 (GST)融合蛋白 ,分子量为 5 4 .8kD ,Western印迹显示融合蛋白质能被抗雄虫和抗GST血清识别。融合蛋白质免疫小鼠可诱导 34.2 9%的减虫率 ,与对照组有显著性差异 (P <0 .0 0 1 )。表明新基因Sj MA表达的蛋白质能诱导小鼠的抗日本血吸虫的保护性免疫 ,提示其作为日本血吸虫疫苗候选分子的潜在价值     

日本血吸虫中国大陆株22.6kD膜相关蛋白基因的克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

以日本血吸虫ｍＲＮＡ为模板,用ＲＴＰＣＲ法快速克隆到一大小约６００ｂｐ的ＤＮＡ片段,ＤＮＡ序列分析证实,所扩增到的ＤＮＡ片段中含有日本血吸虫２２６膜相关蛋白（Ｓｊ２２６（Ｃｈ））基因,将该基因重组到表达型质粒ｐＧＥＸ４Ｔ中,表达的ＧＳＴ融合蛋白分子量约４８ｋＤ,用谷胱甘肽琼脂糖凝胶亲和层析柱纯化的重组蛋白不仅纯度好,而且得率高,纯化产量可达４０ｍｇ／Ｌ培养物,免疫试验结果表明该重组蛋白具有良好的抗原性,为其在血吸虫病抗感染中的免疫作用研究创造了条件。