H1亚型猪流感病毒血凝素基因在昆虫细胞中的表达及其间接ELISA方法的初步建立

根据GenBank发表的H1亚型猪流感HA基因序列设计引物,扩增出HA基因片段,将其克隆到pFastBacGP67B杆状病毒载体上,筛选阳性重组转座载体pFastBacGP67B-H1,转化含有杆状病毒穿梭载体(bacmid)的DH10Bac感受态细胞,构建杆状病毒表达载体获得重组转座子(rBacmid-H1),在脂质体介导下转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒(rBV-H1),再感染细胞,收获目的蛋白。通过血凝试验、免疫印迹法、免疫组化分析表明该蛋白得到表达,且具有良好的生物学活性。利用表达的蛋白作为猪流感间接ELISA的抗原,初步建立H1亚型猪流感的间接ELISA检测方法,并对内蒙古、辽宁和黑龙江等地送检的93份猪血清进行了检测,阳性率为31.18%,为研制开发快速、准确、简便的H1亚型猪流感鉴别诊断试剂盒奠定基础。     

一种更灵敏的特异性检测H9亚型禽流感抗体的间接ELISA方法的建立

H9亚型禽流感在全球范围内广泛流行,控制其传播需监测H9亚型禽流感病毒的感染情况及疫苗的免疫效果。为了建立便于检测且灵敏特异的H9亚型禽流感抗体间接ELISA方法,本实验利用不同亚型之间变异较大的H9亚型禽流感病毒HA蛋白的头部球状区作为包被抗原,确定了最佳复合封闭液和抗体稀释液,提高了其特异性。结果显示建立的ELISA方法灵敏度高于血凝抑制试验(HI),且与H3N2、H5N2、H7N9亚型流感病毒及新城疫病毒(NDV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)和产蛋下降综合征病毒(EDSV)的阳性血清均无交叉反应。另外,利用该方法及HI试验对200份临床鸡血清样本进行检测,两种检测方法的符合率达97%,且存在较高的相关性(R2=0.981 1)。     

H1亚型猪流感病毒血凝素基因在昆虫细胞中的表达及其间接

根据GenBank发表的H1亚型猪流感HA基因序列设计引物,扩增出HA基因片段.将其克隆到pFastBacGP67B杆状病毒载体上,筛选阳性重组转座载体pFastBacGP67B-H1,转化含有杆状病毒穿梭载体(bacmid)的DH10Bac感受态细胞,构建杆状病毒表达载体获得重组转座子(rBacmid-H1),在脂质体介导下转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒(rBV-H1),再感染细胞,收获目的蛋白.通过血凝试验、免疫印迹法、免疫组化分析表明该蛋白得到表达,且具有良好的生物学活性.利用表达的蛋白作为猪流感间接ELISA的抗原,初步建立H1亚型猪流感的间接ELISA检测方法,并对内蒙古、辽宁和黑龙江等地送检的93份猪血清进行了检测,阳性率为31.18%,为研制开发快速、准确、简便的H1亚型猪流感鉴别诊断试剂盒奠定基础.     

H9N2亚型AIVHA基因的原核表达及间接ELISA方法的建立

根据GenBank公开发表的禽流感病毒(AvianInfluenzaVirus,AIV)H9N2亚型血凝素基因(HA)序列设计引物,用PCR方法从重组质粒pUCHA中扩增H9N2亚型禽流感病毒去除信号肽的血凝素基因,将该片段定向插入到原核表达载体pET32a(+)中,构建原核表达载体pETHA。阳性质粒转化宿主菌BL21(DE3),经IPTG诱导,HA基因获得表达,经定位分析,目的蛋白以包涵体的形式存在于大肠杆菌中。通过改变IPTG的浓度和诱导时间,确定了表达HA基因的最佳诱导条件:IPTG终浓度为0.7mmol/L,诱导时间为3h。Westernblot分析表明,重组蛋白能与H9N2亚型AIV阳性血清发生特异性反应。以纯化后表达产物作为诊断抗原包被酶标板建立了检测H9亚型AIV抗体的间接ELISA方法。结果表明,抗原的最佳包被浓度为25μg/mL,血清的最佳稀释度为1∶80,阳性标准初步定为:OD待检血清>0.5且OD标准阳性血清>1.0;OD标准阴性血清<0.1。     

H9N2亚型AIV HA基因的原核表达及间接ELISA方法的建立

根据GenBank公开发表的禽流感病毒(Avian Influenza Virus, AIV)H9N2亚型血凝素基因(HA)序列设计引物, 用PCR方法从重组质粒pUC-HA中扩增H9N2亚型禽流感病毒去除信号肽的血凝素基因 , 将该片段定向插入到原核表达载体pET-32a(+)中, 构建原核表达载体pET-HA.阳性质粒转化宿主菌BL21(DE3), 经IPTG诱导, HA基因获得表达, 经定位分析, 目的蛋白以包涵体的形式存在于大肠杆菌中.通过改变IPTG的浓度和诱导时间, 确定了表达HA基因的最佳诱导条件 IPTG 终浓度为0.7mmol/L , 诱导时间为3 h .Western-blot分析表明, 重组蛋白能与H9N2亚型AIV阳性血清发生特异性反应.以纯化后表达产物作为诊断抗原包被酶标板建立了检测H9亚型AIV抗体的间接ELISA方法.结果表明, 抗原的最佳包被浓度为25μg/mL, 血清的最佳稀释度为180, 阳性标准初步定为 OD待检血清＞0.5且OD标准阳性血清＞1.0 ; OD标准阴性血清＜0.1.     

应用跨膜区置换的血凝素蛋白建立H7N9禽流感病毒抗体间接ELISA检测方法

【目的】由于H7N9禽流感病毒能够感染鸡,并且已经变异成了高致病性毒株,因此,鸡群中H7N9禽流感疫苗的免疫是一个趋势,而鸡群免疫后抗体检测方法的建立也十分必要。本研究旨在建立一种灵敏、高效、高通量的鸡群H7N9亚型禽流感病毒抗体间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测方法。【方法】通过昆虫杆状病毒表达系统分别表达属于W1、W2-A和W2-B分支H7N9流感病毒的3种野生型血凝素(HA)蛋白,以及跨膜区(TM)置换为H3 HA TM的W2-B分支HA蛋白(H7-53TM)。4种HA蛋白经过离子交换层析纯化后作为抗原,通过ELISA检测H7N9禽流感病毒抗体。【结果】ELISA特异性、敏感性和重复性试验结果显示,跨膜区置换主要影响HA蛋白ELISA检测的重复性,以H7-53TM为抗原的ELISA方法具有较好的重复性,其批内和批间变异系数小于10%,然而3种野生型HA蛋白与部分血清反应批内和批间变异系数大于10%,重复性较差,因此选择H7-53TM蛋白作为ELISA包被抗原。通过受试者工作特征曲线(ROC曲线)分析,以H7-53TM为抗原的ELISA能够精准地区分H7N9亚型流感病毒抗体阳性和阴性血清。通过相关性分析,该ELISA方法与134份鸡血清HI试验结果具有显著强相关性(r=0.854 6,P0.000 1),并且与3个分支疫苗株免疫血清的HI试验结果也具有显著相关性(r0.5,P0.05)。【结论】跨膜区置换能够提高HA蛋白抗原检测H7N9禽流感病毒抗体的重复性,并应用跨膜区置换的HA蛋白建立了一种能够检测不同分支疫苗株免疫的H7N9亚型禽流感病毒抗体间接ELISA检测方法。     

H5N1亚型禽流感病毒血凝素基因的原核表达及间接ELISA方法的初步建立

根据GenBank公布的H5N1亚型禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)基因序列设计引物,用PCR方法扩增H5N1亚型禽流感病毒HA1基因, 将该片段定向插入到原核表达载体pET_32a(+)中,构建原核表达载体pET_HA1。阳性质粒转化宿主菌BL21(DE3), 经IPTG诱导, HA1基因获得表达, 重组蛋白以包涵体的形式存在。通过改变IPTG的浓度和诱导时间, 确定了表达HA1基因的最佳诱导条件: IPTG终浓度为0.8mmol/L,诱导时间为3h。Western blot分析表明表达产物具有良好的免疫学活性。以纯化的表达产物作为诊断抗原建立了检测H5亚型AIV抗体的iHA_ELISA方法。结果表明,抗原的最佳包被浓度为4μg/mL,血清的最佳稀释度为1∶200, 阳性标准初步定为：OD待检血清＞05,且OD待检血清/OD阴性血清＞2。     

猪口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体间接ELISA方法的建立

将口蹄疫病毒(FMDV)的VP1基因,通过pPROex-HT表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达,获得大小为31ku的融合蛋白,Westernblot检测证实表达的该蛋白具有良好的生物学活性。以纯化的融合蛋白为抗原建立了猪FMDVVP1蛋白间接ELISA检测方法。通过对80份田间血清样品的检测表明,该方法与FMDV液相阻断ELISA(国标试剂盒)的总符合率为96.25%,表明建立的VP1蛋白间接ELISA检测方法具有很好的特异性和敏感性。     

猪口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体间接ELISA方法的建立

将口蹄疫病毒(FMDV)的VP1基因,通过pPROex-HT表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达,获得大小为31ku的融合蛋白,Western blot检测证实表达的该蛋白具有良好的生物学活性。以纯化的融合蛋白为抗原建立了猪FMDV VP1蛋白间接ELISA检测方法。通过对80份田间血清样品的检测表明,该方法与FMDV液相阻断ELISA（国标试剂盒）的总符合率为96.25%,表明建立的VP1蛋白间接ELISA检测方法具有很好的特异性和敏感性。     

一株H1N1亚型猪流感病毒的分离鉴定及全基因序列分析

2006年从辽宁省某猪场采集具有流感症状猪鼻拭子共30份,经9~11日龄SPF鸡胚分离,对分离株进行了血凝试验、血凝抑制试验、RT-PCR亚型鉴定,全基因序列比对和接种试验动物试验。结果表明:该毒株具有凝集0.5%鸡红细胞的活性,且与抗猪流感H1标准血清发生血凝抑制反应,RT-PCR分别扩增得到全基因8个片段,利用DNAStar生物学软件进行序列分析,HA基因与GenBank登录的H1~H16中的H1基因序列同源性最高,NA基因与N1~N9中的N1基因序列同源性最高,故该LN株分离毒为猪流感H1N1亚型病毒。全基因序列中,除了M基因不是猪源的,其它基因片段均与国内H1N1亚型猪流感参照株高度同源,推测LN株可能是由类人和类禽谱系的流感病毒与古典猪谱系的流感病毒重排形成的;用该病毒接种试验动物可成功复制出猪流感典型症状。该病毒的分离鉴定及全基因组序列分析为我国进一步调查猪流感的流行规律提供了基础数据。     

Genetic characterization of swine influenza viruses isolated in Japan between 2009 and 2012

Eleven swine influenza viruses (SIVs) isolated from pigs in Japanese institutions between 2009 and 2012 were genetically characterized. Seven H1N1 were shown to have originated from A(H1N1)pdm09 viruses. Two H1N2 viruses contained H1 and N2 genes of Japanese H1N2 SIV origin together with internal genes of A(H1N1)pdm09 viruses. Two H3N2 viruses isolated during animal quarantine were identified as triple reassortant H3N2 viruses maintained among pigs in North America. This study shows that A(H1N1)pdm09 viruses and their reassortant strains are already present in domestic pigs in Japan and that novel SIVs are possibly being imported from abroad.     

表达H3N2亚型猪流感病毒血凝素蛋白的重组腺病毒在猪体内的免疫试验

摘要:【目的】本研究旨在评价表达H3N2亚型猪流感病毒血凝素蛋白的重组腺病毒在猪体内的免疫效果。【方法】以10-8 TCID50、2×10-8 TCID50和4×10-8 TCID50的剂量经肌肉注射接种后2到6周每周检测血凝抑制（HI）抗体;比较肌肉注射、滴鼻、灌胃三种接种途径对仔猪免疫效果的影响,并通过攻毒保护试验进一步考察重组腺病毒rAd-HA-GFP在猪体内的免疫效力。【结果】以不同的剂量分别经肌肉注射免疫后, HI抗体水平与接种剂量呈正相关。三种接种途径均能刺激仔猪产生特异性抗体,肌肉注射组的HI抗体要高于其他两组,差异显著（P<0.01）。通过滴鼻和肌注注射方式进行攻毒后,阴性对照组仔猪在攻毒2d后出现体温升高、打喷嚏、咳嗽、流鼻液、精神沉郁、体重减轻等症状;而各免疫组仔猪未观察到明显的临床症状,各免疫组的病毒分离率也明显低于阴性对照组。【结论】重组腺病毒rAd-HA-GFP诱导的HI抗体达到1:320可以有效抵抗H3N2亚型猪流感病毒的侵袭,可以作为候选疫苗株。     

共表达H5N1流感病毒M1和HA基因的DNA疫苗与腺病毒载体疫苗的小鼠免疫评价

为评价在小鼠体内表达流感病毒M1和HA基因诱导的免疫反应,制备共表达H5N1亚型禽流感病毒 (A/Anhui/1/2005) 全长基质蛋白1 (M1) 基因和血凝素 (HA) 基因的重组DNA疫苗pStar-M1/HA和重组腺病毒载体疫苗Ad-M1/HA,将其按初免-加强程序免疫BALB/c小鼠,共免疫4次,每次间隔14 d。第1、3次用DNA疫苗,第2、4次用重组腺病毒载体疫苗,每次免疫前及末次免疫后14 d采集小鼠血清用于检测体液免疫应答,末次免疫后14 d采集小鼠脾淋巴细胞用于检测细胞免疫应答。血凝     

流感病毒H1N1血凝素基因和神经氨酸酶基因在酵母菌中的表达

在成功克隆流感病毒H1N1全长HA(Hemagglulinin,HA)、NA(Neuramidinase,NA) 基因并测序的基础上,将部分基因序列克隆到表达载体pMETA上,构建了重组表达质粒pMETA/HA(52~1 557 bp)、pMETA/NA(121~1 263 bp),电转化真核酵母菌pMAD16,甲醇诱导表达,利用Ni2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用Western blotting和ELISA方法检测其抗原性。SDS-PAGE显示重组蛋白在酵母菌中可以高效表达,蛋白纯度占总蛋白的95％以上,ELISA和Western blotting实验证实,重组蛋白具有良好的抗原性。成功克隆和表达了流感病毒H1N1 HA、NA基因序列,为流感病毒H1N1诊断试剂和疫苗的开发等进一步的研究提供了参考。     

甲型H5N1流感病毒M2与HA双基因载体疫苗在小鼠体内的免疫学评价

高致病性H5N1亚型禽流感病毒 (AIV) 严重威胁到人类健康,因此研制高效、安全的禽流感疫苗具有重要意义。以我国分离的首株人H5N1亚型禽流感病毒 (A/Anhui/1/2005) 作为研究对象,PCR扩增基质蛋白2 (M2) 和血凝素 (HA) 基因全长开放阅读框片段,构建共表达H5N1亚型AIV膜蛋白基因 M2和HA的重组质粒pStar-M2/HA。此外,还通过同源重组以293细胞包装出表达M2基因的重组腺病毒Ad-M2以及表达HA基因的重组腺病毒Ad-HA。用间接免疫荧光 (IFA) 方法检测到了各载体上插入基因的表达。按初免-加强程序分别用重组质粒pStar-M2/HA和重组腺病毒Ad-HA+Ad-M2免疫BALB/c小鼠,共免疫4次,每次间隔14 d。第1、3次用DNA疫苗,第2、4次用重组腺病毒载体疫苗,每次免疫前及末次免疫后14 d采集血清用于检测体液免疫应答,末次免疫后14 d采集脾淋巴细胞用于检测细胞免疫应答。血凝抑制 (HI) 实验检测到免疫后小鼠血清中的HI活性。ELISA实验检测到免疫后小鼠血清中抗H5N1亚型流感病毒表面蛋白的IgG抗体。ELISPOT实验检测到免疫后小鼠针对M2蛋白和HA蛋白的特异性细胞免疫应答。流感病毒M2与HA双基因共免疫的研究,为研究开发新型重组流感疫苗奠定了基础。     

共表达H5和H9亚型禽流行性感冒病毒血凝素基因的重组禽痘病毒及其免疫效力

为了构建更为安全有效能同时抵抗高致病性H5亚型和低致病忡H9亚型禽流行性感冒(禽流感)病毒的基因工程疫苗,将H5和H9亚型禽流感病毒分离株的血凝素(HA)基因,分别由鸡痘病毒早晚期启动子PS和PE／L调控其转求,定向插入鸡痘病毒转移载体p11s中,获得H5A和H9A基因分别处于PS及PE／L启动子转录调控下的重组转移载体p11SH5H9。以FuGene^TM6转染法将p11SH5H9转染至已感染鸡痘病毒282E4疫苗株(wt-FPV)的鸡胚成纤维细胞(CEF)中。p11SH5H9与wt—FPV基因组DNA之间的同源重组产生了重组鸡痘病毒rFPV11SH5H9。通过在含X-gal的营养琼脂上连续挑选蓝色病毒蚀斑获得并纯化rFPV-11SH5H9。以间接免疫荧光法试验证实,纯化的rFPV-11SH5H9感染的CEF能同时表达H5A和H9A。初步的动物试验表明,用10^5PFU的rFPV-11SH5H9免疫无特定病原体(SPF)鸡,免疫后血凝抑制(HI)抗体监测阳性率均为100％(8／8);该重组病毒能显著抑制H9亚型AIV滴鼻、点眼后7日龄SPF鸡从气管和泄殖腔排毒,同时也能抵抗H5亚型AIV肌肉注射后对7日龄SPF鸡致死性攻击,保护率均为100％,显示出一定的应用前景。     

人H5N1流感病毒血凝素蛋白DNA疫苗的构建及其免疫原性研究

将我国分离的首株人H5N1亚型禽流感病毒A/Anhui/1/2005作为研究对象,扩增其HA和HA1基因片段并克隆至真核表达载体pStar,构建成真核表达质粒。通过Western blot和间接免疫荧光检测方法确认,构建的重组质粒在真核细胞中成功地表达了目的蛋白HA和HA1。将重组质粒免疫BALB/c小鼠,检测免疫后外周血中HA/HA1特异性抗体的效价,并比较HA和HA1的免疫原性。结果表明,重组质粒免疫后成功地诱导了体液免疫反应,且二者的血清抗体效价无显著性差异。