用生物素-亲和素ELISA法检测人胚肺二倍体细胞培养的甲型肝炎病毒抗原

利用生物素-亲和素生物放大系统的原理,建立了新的检测细胞培养的甲型肝炎病毒抗原的方法。用生物素标记的抗甲肝IgG,与免疫偶联于固相的甲肝抗原作用,然后用亲和素-生物素辣根酶复合物(ABPC)与生物素化的IgG偶合,邻苯二胺(OPD)显色。该法在检测甲肝抗原中获得满意结果,灵敏度比普通ELISA法提高约10倍,非特异性显著降低。该法可进一步发展成为一种高特异性的,灵敏的甲肝临床诊断和流行病学调查的技术。     

一种简易SNP 检测方法的建立

目的:建立一种快速、简单的SNP(Single Nucleotide Polymorphisms)检测方法。方法:设计带生物素标记的扩增引物对检测用具有单碱基差异的野生型和突变型靶序列分别进行扩增,然后通过紫外交联的方式将相应检测靶序列的探针固定在硝酸纤维素膜上,借助Taq酶完成膜上单引物延伸,从而对探针捕获的靶序列进行延伸固定在膜上,最后使用生物素-亲和素酶联显色(ABS-ELISA)反应肉眼观察结果。结果:阳性和阴性对照探针显示正常。野生型探针和突变型探针能够分别特异性结合靶序列,并通过生物素和亲和素显色系统放大为一种肉眼可判断结果的检测形式。结论:建立了一种基于硝酸纤维素膜载体上进行核酸扩增的SNP检测方法。     

一种简易SNP检测方法的建立

目的：建立一种快速、简单的SNP（Single Nucleotide Polymorphisms）检测方法。方法：设计带生物素标记的扩增引物对检测用具有单碱基差异的野生型和突变型靶序列分别进行扩增,然后通过紫外交联的方式将相应检测靶序列的探针固定在硝酸纤维素膜上,借助Taq酶完成膜上单引物延伸,从而对探针捕获的靶序列进行延伸固定在膜上,最后使用生物素．亲和素酶联显色（ABs-ELISA）反应肉眼观察结果。结果：阳性和阴性对照探针显示正常。野生型探针和突变型探针能够分别特异性结合靶序列,并通过生物素和亲和索显色系统放大为一种肉眼可判断结果的检测形式。结论：建立了一种基于硝酸纤维素膜载体上进行核酸扩增的SNP检测方法。     

应用逆转录PCR检测海产贝壳类中的甲型肝炎病毒

污染水体中生长的贝壳类是传播甲型肝炎的重要媒介之一,本文介绍了用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测贝壳类中甲型肝炎病毒(HAV)的方法。贝壳类中HAV的浓集回收采用洗脱-沉淀法并加以改进,30g贝肉中的病毒浓集回收在1.5~2.0m l上清液中。RT-PCR检出限为回收样品经二次扩增后10-2稀释度。从7种39份采自大连近海海域的贝壳类样品中,用该法检测出阳性样品4种10份,阳性率为26%。说明各种贝壳类有不同程度的污染。     

以人工合成多肽为抗原的戊型肝炎病毒抗体检测方法的建立和评价

酶联法是ＨＥＶ感染的主要检测方法,多采用基因表达产物为抗原。近来由于人工合成多肽抗原克服了基因重组抗原制备复杂、非特异结构多、难以纯化的缺点,已广泛用于多种病毒感染的检测。根据已发表的ＨＥＶ氨基酸序列的保守性及亲水性等特点,设计合成了两个多肽ＥＳＰ１和ＥＳＰ２,分别位于ＯＲＦ２和ＯＲＦ３区,以此为混合抗原建立了检测ＨＥＶ抗体的间接ＥＬＬＳＡ法,与市售优质试剂比较,其阳性符合率为９７．７５％,阴性符合率为９９．４３％,总符合率为９８．８６％。该方法灵敏度高、特异性强、安全快速,是检测ＨＥＶ感染和流行病学调查的理想方法。     

用生物素标记结核菌单克隆抗体检测脑脊液结核菌抗原的研究

应用生物素标记结核菌单克隆抗体酶联免疫吸附试验(BA-ELISA)检侧脑脊液结核菌扰原,并在同一滴定板上与常规ELISA比较。结果表明在85.4%的脑脊液中,BA-ELISA较常规ELiSA敏感,抗原滴度为后者的2.5倍。本法阳性率为88.5%,明显高于常规ELISA法(p<0.05),而其非特异性却无明显增加,提示本法为结核性脑膜炎的免疫学诊断提供了一种比常规ELISA更为敏感的新方法。     

甲型肝炎病毒抗原蛋白的制备与分析

目的 提取并制备甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV)抗原蛋白,了解、分析其主要成分和性质.方法 利用人胚肺二倍体细胞培养并收获HAV,释放并初步提取病毒抗原;采用阴离子交换层析和分子筛层析等方法纯化制备HAV抗原蛋白;再利用凝胶电泳(gel electrophoresis)和Western印迹法(...     

甲型肝炎病毒对理化因子的稳定性

用放射免疫成斑法研究了甲型肝炎病毒FM-175株的理化稳定性和灭活条件,证明甲型肝炎病毒理化稳定性与其它肠道病毒相似,具有广范围的pH(2～10)稳定性;Mg~(++)和Ca可增强其热稳定性,不能抵抗冷冻干燥,但对热的抵抗力明显高于普通肠道病毒,可被紫外线迅速杀灭,也可被多种消毒剂如3～8％的甲醛液,50～90％的乙醇,2％的石炭酸及400ppm的有效氯等杀灭,但可抵抗0.1％甲醛液,2～5％的来苏儿及200ppm的有效氯1小时以上,本研究工作为甲型肝炎病毒的理化性状、保存及消毒条件等提供了实验数据。     

一种快速检测甲型流感病毒的方法

目的 开发一种快速、简便的基于胶体金免疫层析法（GICA）的试剂盒,以用于对甲型流感病毒的检测。方法以柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记抗甲型流感病毒内部抗原的单克隆抗体。硝酸纤维素膜上包被两种抗甲型流感病毒单克隆抗体的混合液,制成免疫层析试纸。待测样品中的甲型流感病毒首先与胶体金标记抗体结合,后移动至硝酸纤维素上与固定的单克隆抗体发生反应,形成肉眼可见的红色带。结果GICA试纸条与甲1型和甲3型流感病毒共16种毒株均能发生特异性反应,与乙型流感病毒、副流感病毒、腺病毒和呼吸道合胞病毒无交叉反应。用三种不同甲型流感病毒毒株的不同浓度标本与美国同类经过FDA批准的产品比较,灵敏度相同。结论GICA试纸条灵敏度能够达到临床使用的要求,并具有简便快速、无需特殊仪器设备等优点,对甲型流感的诊断和流行病学调查具有十分重要的应用价值。     

生物素-亲和素偶联探针蛋白芯片检测技术

自行制备一种新型生物素-亲和素偶联探针分子并用于反相蛋白芯片的检测。首先, 将生物素-羊抗鼠IgG与亲和素按照不同比例混合后与鼠IgG蛋白芯片反应, 观察荧光信号的放大情况; 然后以鼠IgG-羊抗鼠IgG体系为研究模式, 对反相蛋白芯片的制备条件进行了考察和优化, 包括荧光分子的非特异性吸附、点样缓冲液的选择以及蛋白的活性等。最后, 采用此偶联探针对反相蛋白芯片进行了检测。结果表明, BSA缓冲液制备的反相蛋白芯片可以防止非特异性吸附, 并有利于保持固定蛋白活性和提高检测限; 另外, 与传统的与生物素-亲和素检测技术相比, 采用生物素-亲和素偶联探针对反相芯片的检测限可以提高4倍左右。表明亲和素-生物素偶联探针成本低、易于合成、并可以与其它的信号放大技术联用进一步提高检测的灵敏度, 有望用于蛋白质芯片的检测。     

高灵敏可视化核酸试纸条法快速检测HBV DNA

目的：本研究旨在建立一种基于试纸条的快速、灵敏及可视化检测乙型肝炎病毒核酸的方法。方法：利用聚合酶链反应扩增乙肝病毒的保守区,其中上、下游引物的5＇端分别修饰异硫氰酸荧光素和生物素。核酸试纸条上的胶体金以及检测线处分别标记有链霉亲和素以及抗荧光素抗体。将扩增产物与展开液混合后点样,10 min后即可用肉眼判读结果。在优化了展开液成分、上样体积以及上样浓度之后,对该方法的灵敏度进行了评价。最后收集15例阴性样本及33例HBsAg阳性样本,按血清标志物结果进行分类后使用核酸试纸条进行检测,并与实时荧光PCR的结果进行了比较。结果：试纸条检测乙肝病毒核酸的灵敏度为250copies/mL。在临床样本的测定中,该方法与实时荧光定量PCR的特异性均为100%。且两种方法检测不同血清标志物类型的阳性检出率无差异。结论：核酸试纸条技术能够用于乙肝病毒核酸的可视化检测,与实时荧光PCR相比检测速度快,具有较好的灵敏度和特异性,适合流行病学调查以及在基层医院体检使用。     

一步多重PCR同时检测甲型肝炎和脊髓灰质炎病毒研究

建立的一步ＰＣＲ方法即反转录和ＰＣＲ在同一管中进行,同时检测甲型肝炎和脊髓灰质炎病毒病毒ＲＮＡ。实验中对不同的反转录温度以及一步多重ＰＣＲ的特异性和灵敏度进行了探讨。结果表明：４２℃、５０℃反转录时ｐｏｌｉｏ有非特异性条带出现,６０℃反转录特异性较好,而ＨＡＶ在三种不同的反转录温度下均得到牧场划性较好的条带;应用一步ＰＣＲ同时检测两种病毒与检测单一病毒的灵敏度基本一致,但在同等反应条件下后者的反应效率高于前者,特别是在检测ＨＡＶ时。     

Mutation patterns for two flaviviruses: hepatitis C virus and GB virus C/hepatitis G virus

We studied the mutation patterns of hepatitis C virus (HCV) and GB virus C/hepatitis G virus (HGV). Although the mutation patterns of the two viruses were similar to each other, they were quite different from that of HIV. In particular, the similarity of the patterns between HCV or HGV and human nuclear pseudogenes was statistically significant whereas there was no similarity between HIV and human nuclear pseudogenes. This finding suggests that the mutation patterns of HCV and HGV are similar to the patterns of spontaneous substitution mutations of human genes, implying that nucleotide analogues which are effective against HCV and HGV may have a side effect on the normal cells of humans.     

The binding of hepatitis A virus to cell surfaces shows evidence of positive co-operativity

Abstract Radio-iodinated hepatitis A virus binds to cultured mammalian cells in a saturable manner, with about 1.4 × 10³ sites/cell and a S _0.5 of about 1.4 × 10⁻¹¹ M for FRhK-4 cells. This binding to FRhK-4 cells shows evidence of positive co-operativity, with a Hill coefficient of 2.1 (±0.1). This implies that the cellular receptor for the virus may have multiple binding sites and that the affinity of HAV for its receptor is increased if one of the binding sites is occupied by virus. Binding is completely blocked by two neutralising monoclonal antibodies, which also inhibit viral haemagglutination. A non-neutralising monoclonal antibody partially inhibits binding to FRhK-4 cells, but has no effect on haemagglutination.     

Interference of hepatitis A virus replication by small interfering RNAs

The rate of acute liver failure due to hepatitis A virus (HAV) has not decreased, and therapy of severe infections is still of major interest. Using a DNA-based HAV replicon cell culture system, we demonstrate that small interfering RNAs (siRNAs) targeted against viral sequences or a reporter gene contained in the viral genome specifically inhibit HAV RNA replication in HuhT7 cells. Combinations of siRNAs were more effective suppressors of HAV RNA replication. Also, siRNAs targeted against HAV 2C and 3D inhibited the expression of the respective protein. Expressions of endogenous beta-actin and double-stranded-specific RNA-activated serin/threonine kinase (PKR) were unaltered, demonstrating that the siRNA inhibitory effect was not connected to interferon inhibition, but rather was specifically targeted against HAV RNA. These results suggest that RNA interference might ultimately be useful in treatment of severe HAV infection with or without chronic liver diseases.     

甲型肝炎病毒的提取及免疫学性质分析

目的建立甲型肝炎病毒(hepatitis A virus, HAV)的提取方法,了解和掌握HAV的免疫学性质。方法利用人胚肺二倍体细胞培养并收获HAV,用层析纯化等方法提取HAV,然后通过抗原检测、免疫电镜检查以及小鼠免疫试验对HAV的免疫学性质进行检测和分析。结果利用层析纯化等方法提取HAV,抗原回收率达84%以上,蛋白去除率达97%以上,电镜及免疫电镜检查可以观测到典型的HAV以及HAV+IgM抗原抗体免疫复合物和HAV+IgG抗原抗体免疫复合物,免疫小鼠抗体阳转率为100%。结论利用层析纯化等方法可以对HAV进行有效提取,提取的HAV具有良好的免疫反应性和免疫原性。     

生殖器疱疹病毒抗原的两种检测结果比较分析

比较分析生殖器疱疹病毒抗原的两种检测方法,找出更为准确、简便、经济、实用的检测方法,分别利用疱疹病毒抗原酶免疫(ELISA)法和荧光定量PCR(FQ-PCR)法检测南方医科大学珠江医院门诊患者538例。酶免疫法检出率为27.5%,略低于荧光定量PCR法的28.3%,经SPSS12.0分析,两种方法检测结果无显著差异。酶免疫法检测生殖器疱疹病毒抗原具有操作简便、快捷、经济等特点,而敏感性和特异性均无显著差别,是一种更适合临床的检验方法,更具有值得推广使用的价值。     

应用PCR方法检测部分血液制品中HCV-RNA

应用市售丙型肝炎ＰＣＲ检测试剂盒,对１９９４ １９９６年用不同病毒灭活工艺生产的人凝血因子类制品、人静注丙球和人血白蛋白进行ＨＣＶ ＲＮＡ检测。结果表明,检测六种血液制品共２１批,１批阳性,占４８％。     

大鼠仙台病毒ELISA、间接免疫荧光和免疫印迹三种检测方法比较

目的比较ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay）、IFA（immuno-fluorescence assay）和WB（Western blot）三种方法在大鼠仙台病毒血清学检测中的差异。方法仙台病毒蛋白抗原经凝胶电泳分离转移后用于血清学检测的WB方法;使用IFA、ELISA方法对20份无菌大鼠、227份SPF大鼠以及63份清洁级大鼠送检血清样品进行检测,阳性及可疑样品用WB方法进行了验证。结果 20份无菌大鼠血清样品被3种方法检测为仙台病毒抗体阴性;SPF级大鼠样品被IFA方法判定为阴性,1.32%（3/227）被ELISA方法判定为阳性,其中有2/3被WB确认为阳性;ELISA、IFA和WB在清洁级大鼠样品中检出仙台病毒的阳性率分别为为18.12%、11.34%和15.87%。结论三种检测方法灵敏度从高到低依次为ELISA、WB和IFA。WB方法可作为IFA和ELISA难以确定结果的替代方法。