大规模酵母双杂交技术研究蛋白质相互作用的应用

简介了酵母双杂交技术原理, 总结了酵母双杂交技术大规模筛选蛋白质相互作用的基础、应用及存在的问题。因为大规模酵母双杂交技术结果有大量假阳性及假阴性问题, 因此, 有条件情况下有必要同时开展其他方法的大规模蛋白相互作用研究, 以构建规模更大可信度更高的蛋白质相互作用网络图。     

酵母双杂交筛选类固醇激素合成急性调节蛋白的相互作用蛋白质

目的:利用酵母双杂交技术筛选人肝cDNA文库中与类固醇激素合成急性调节蛋白(STAR)相互作用的蛋白质。方法:将全长STAR基因克隆到酵母表达载体pDBLeu中,形成诱饵;将构建好的诱饵质粒转化至AH109酵母感受态中,利用酵母双杂交技术筛选人肝cDNA文库中与其相互作用的蛋白质,并进行相互作用的回转验证。结果:构建了酵母诱饵蛋白表达质粒pDBLeu-STAR,并筛选到6个猎物,其中有5对相互作用回转验证阳性。结论:为进一步研究STAR的功能和作用机制提供了新的线索。     

应用酵母双杂交筛选与CUEDC2相互作用的蛋白质

目的：应用酵母双杂交技术,筛选与包含CUE结构域的人CUEDC2发生相互作用的蛋白质。方法：应用酵母双杂交系统,以CUEDC2为诱饵筛选人乳腺cDNA文库,寻找能与之相互作用的蛋白质,并运用营养缺陷型培养和X-alpha-Gal等实验提供的信息,筛除假阳性克隆。结果：以CUEDC2为诱饵最终筛出了2个阳性克隆,经测序及生物信息学分析,这2个克隆同为GADD34。结论：CUEDC2可以和GADD34发生相互作用,它们的相互作用有可能与CUEDC2的功能调控相关。     

应用酵母双杂交系统筛选AMPK相互作用蛋白

一磷酸腺苷激活蛋白激酶(AMPK)是调节体内代谢平衡的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。应用酵母双杂交系统,以AMPKβ1亚基作为\"诱饵\"蛋白,筛选均一化的人源cDNA文库,寻找与AMPK相互作用的蛋白。通过对150个阳性克隆进行验证,最终得到了63个与AMPKβ1亚基相互作用的蛋白。其中,包括代谢酶、转录因子或转录相关蛋白、蛋白转运相关蛋白、GTP结合蛋白、支架蛋白、细胞周期调节蛋白、RNA结合蛋白等以及一些未知功能的蛋白。从酵母双杂交的结果来看,AMPK不仅在代谢领域,而且在许多非代谢领域,如核受体及其它转录因子的调节、信号转导、DNA修复及细胞周期调节等,可能都起到非常重要的作用。     

酵母双杂交系统筛选与RapGAP相互作用的蛋白质

目的 筛选与RapGAP相互作用的蛋白质,为进一步研究人源Rap1GAP介导的信号转导通路、揭示其与肿瘤的关系提供实验依据。方法 选用与Rap1GAP同源的来自美丽线虫的RapGAP作为饵蛋白,以来源于美丽线虫的cDNA文库作为靶蛋白,应用pPC97、pPC86组成的酵母双杂交系统筛选cDNA文库中与RapGAP相互作用的蛋白质。结果 通过营养缺陷平板（-LTH）筛选出63个拟似阳性菌落。经过Lac Z鉴定,19个菌落为阳性,其中7个为强阳性。提取来自19个酵母菌落中的重组DNA,经PCR扩增,12个菌落出现阳性结果。将该19个重组DNA分别电转化入DH5α细菌,涂板培养后,每板挑取4～10个克隆,通过SalI和NotI双酶切鉴定进行阳性克隆筛选。将阳性克隆的重组DNA进行序列测定。测序结果与GenBank比较,其中4个克隆的DNA片段为Y39b6a基因片段、2个为RapGAP、1个为苯丙氨酸-4-羟化酶、1个为细胞色素C氧化酶,还有1个DNA片段编码美丽线虫特有的小分子蛋白的基因片段,其余11个DNA片段不编码已知蛋白质。结论 初步筛选出与RapGAP相互作用的蛋白质,特别是其中有两个克隆为RapGAP,提示RapGAP可能以二聚体的方式存在。     

酵母双杂交技术及其在蛋白质组研究中的应用

蛋白质组学是后基因组时代出现的一个新兴的研究领域,它的主要任务是识别鉴定细胞,组织或机体的全部蛋白质,并分析蛋白质的功能及其模式。因此,揭示蛋白质组中蛋白质间的相互作用关系也是蛋白质组学的重要内容之一。酵母双杂交技术是用来检测蛋白质间是否相互作用的一个非常有效的手段,该技术在酵母蛋白质组研究中的初步成功应用,表明它有望在人类蛋白质且研究中发挥重要作用。     

大规模酵母双杂交技术的发展及其在蛋白质相互作用组学中的应用

酵母双杂交技术作为研究蛋白质相互作用的主要方法,在规模化蛋白质相互作用研究中占据举足轻重的地位。虽然蛋白质相互作用的数据逐年递增,但是还远不能满足"大数据"的实际需求。为了使蛋白质相互作用组学研究更加高效、快捷、准确,以及使酵母双杂交适用于全基因组规模筛选和蛋白质相互作用数据高度覆盖的研究需求,近年来对酵母双杂交技术进行了一系列的改进和发展。综述了近年来在规模化蛋白质相互作用组学研究中,酵母双杂交技术的最新改进和发展。     

酵母双杂交系统研究进展

综述了酵母双杂交技术的基本原理和实际应用,以及该技术的发展,并展望了该系统的发展前景。     

应用酵母双杂交系统筛选BRD7相互作用的蛋白质

BRD7基因是鼻咽癌组织表达下调/缺失的基因, 有强烈的鼻咽癌细胞系HNE1生长抑制作用. 利用酵母双杂交系统筛选与BRD7蛋白相互作用的蛋白, 首先将BRD7基因的完整阅读框架部分亚克隆至pAS2载体(BRD7-BD), 然后以BRD7-BD为靶蛋白, 筛选人胎脑cDNA文库, 在4.8×10⁶个转化子中筛选到11个阳性克隆, 序列测定表明, 分离到溴区包含蛋白3, 溴区包含蛋白2, β-IκB激酶, KIAA1375蛋白, 白介素7和接头相关蛋白复合物3 δ-1亚单位等与BRD7相互作用蛋白, 说明BRD7可能与BRD3或BRD2蛋白形成异源二聚体或三聚体发挥核内转录调节功能.     

应用酵母双杂交技术寻找与GGNBP相互作用的蛋白质

生殖细胞缺陷症(gcd)小鼠突变体是20个世纪90年代初发现的一种不育突变小鼠,其不育原因是由于其胚胎期原始生殖细胞的数目低于正常。FancL(也叫Pog)的缺失是引起gcd突变小鼠的原因,FancL基因缺失后可能影响了小鼠胚胎期原始生殖细胞的增殖／存活和成年期小鼠精母细胞的减数分裂。FANCL是一种含有PHD结构域的泛素E3连接酶,是Fanconi贫血复合物的组分之一。在生殖细胞中,FANCL与GGN1和GGN3相互作用,GGN1和GGN2又与一种新的蛋白质GGNBP特异作用。但GGNBP蛋白的功能还不清楚。为了研究GGNBP的功能以及揭示更多的参与该过程的蛋白质,运用Clontech公司新开发的第3套酵母双杂交系统,以GGNBP为诱饵从成年小鼠睾丸cDNA库中筛选与其相互作用的蛋白质基因,发现了一个主要在睾丸中表达的新的基因,其编码的蛋白质产物在酵母系统中与GGNBP特异作用。     

酵母三杂交系统的应用研究进展

介绍了酵母三杂交系统的原理、应用、前景和存在的不足.在酵母双杂交基础上发展起来的酵母三杂交系统,将应用范围扩大到研究蛋白质-蛋白质、蛋白质-RNA、蛋白质-小分子药物间的相互作用.     

Identification of proteins that interact with a protein of interest: Applications of the yeast two-hybrid system

The yeast two-hybrid system is a molecular genetic test for protein interaction. Here we describe a step by step procedure to screen for proteins that interact with a protein of interest using the two-hybrid system. This process includes, construction and testing of the bait plasmid, screening a plasmid library for interacting fusion proteins, elimination of false positives and deletion analysis of true positives. This procedure is designed to allow investigators to identify proteins and their encoding cDNAs that have a biologically significant interaction with your protein of interest.     

发展中的酵母杂交体系

酵母杂交体系包括双杂交、反向双杂交和三杂交等体系。双杂交作为一种新兴的体内研究蛋白质之间相互作用的方法,已经得到了广泛的应用。而反向双杂交和三杂交系统是在双杂交基础上发展起来的两种新技术。反向双杂交除了筛选突变株,以获取蛋白质结合的信息外,还能发现可导致已知蛋白质间特异相互作用发生解离的肽类或其他小分子物质,进一步分析蛋白质间作用位点、调控。三杂交系统则在蛋白质与小分子配基之间以及多种蛋白质之间相     

The liver-specific human alpha(1)-microglobulin/bikunin precursor (AMBP) is capable of self-association

alpha-1-Microglobulin (A1M) and bikunin are two plasma glycoproteins encoded by an alpha-1-microglobulin/bikunin precursor (AMBP) gene. Despite their lack of any structural or functional relationship, both A1M and bikunin originate from AMBP cleavage by a furin-like protease that releases the two mature molecules. The AMBP gene maintains a tight control over its expression by a unique enhancer, which is controlled by several hepatocyte-enriched nuclear factors; however, the mechanisms of regulation of the intracellular levels of the AMBP protein are currently unknown. We report the ability of the AMBP protein to self-associate and form a dimer in a yeast environment using the yeast two-hybrid system and an in vitro dimerization assay. We also show that the A1M protein binds to its precursor protein, AMBP, whereas bikunin does not. This observation warrants further investigations for a dimerization-dependent intracellular control that AMBP may be involved in. The relevance of AMBP dimerization and its possible biological significance are postulated.     

利用酵母双杂交系统筛选水稻类受体激酶OsWAK50胞内域相互作用蛋白

细胞壁连接的类受体激酶(wall-associated kinase,WAK)是植物细胞中一类特有的类受体激酶基因亚家族,因其胞外域与细胞壁紧密相连而得名．水稻中共有125个OsWAK基因,OsWAK50编码的蛋白质具有胞外域、跨膜域和激酶域,呈现典型的WAK样受体激酶特征．首先通过对OsWAK50-GFP融合蛋白的观察发现OsWAK50定位于细胞膜并且与细胞壁偶联．进而通过酵母双杂交系统筛选到了20个可能与OsWAK50胞内域相互作用的候选蛋白,并通过一对一酵母转化验证了OsSK4、OsSWIB和OsSWI3C全长均可与OsWAK50胞内域相互作用．进一步分析显示,OsSWIB能够直接与OsWAK50激酶域互作,而OsSK4和OsSWI3C与OsWAK50胞内域的互作是依赖于OsWAK50 C端的．研究还表明,OsSK4和OsSWIB亦能与OsWAK50同源基因OsWAK53a结合,而OsSWI3C则不能与OsWAK53a结合．双分子荧光互补实验证明,OsSK4与OsWAK50和OsWAK53a能够在植物体内发生互作．以上结果为阐明OsWAK50发挥功能的分子机制提供了重要线索．     

酵母双杂交系统及其应用

酵母双杂交系统（yeast two-hybrid system)是直接于细胞内研究蛋白质间相互作用的一种灵敏度很高,且非常有效的遗传学方法,在不同研究领域中广泛应用,并不断完善及改进,发展出单杂交系统（one-hybid system)和三杂交系统（three-hybrid system)等一系列相关的技术,克服了原系统的局限,本文对双杂交系统的原理,发展概况,应用,存在问题和前景等进行了综述。     

Using yeast two-hybrid system to detect interactions of ATP synthase subunits from Spinacia oleracea

Subunit interactions among the chloroplast ATP synthase subunits were studied using the yeast two-hybrid system. Various pairwise combinations of genes encoding α, β, γ, δ and ε subunits ofSpinach ATP synthase fused to the binding domain or activation domain of GAL4 DNA were introduced into yeast and then expression of a reporter gene encoding β-galactosidase was detected. Of all the combinations, that of γ and ε subunit genes showed the highest level of reporter gene expression, while those of α and β, a and ε, β and ε and β and δ induced stable and significant reporter gene expression. The combination of δ and ε as well as that of δ and γ induced weak and unstable reporter gene expression. However, combinations of α and γ, β and γ and α and δ did not induce reporter gene expression. These results suggested that specific and strong interactions between γ and ε, α and β, α and ε, β and ε and β and δ subunits, and weak and transient interactions between δ and ε and δ and γ subunits occurred in the yeast cell in the two-hybrid system. These results give a new look into the structural change of ATP synthase during catalysis.