BSA和PEG影响固定化辣根过氧化物酶HRP在有机相中活力

ＢＳＡ和ＰＥＧ可以有效地提高固定化辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）在有机相中的活力。固定化酶活力的提高与试剂加入的顺序有密切的联系;不同载体对酶的影响不同,Ｇｅｌｉｔｅ,ａｌｕｍｉｎａ,ＸＡＤ－７,Ｋｉｓｅｌｇｅｌ和Ｆｌｏｒｉｓｉｌ为载体,分别以吸附法制备固定化酶。实验表明固定化过程中保护剂和酶的加入顺序与国家化酶活力密切相关,而这些载体的固定化效果又以Ｃｅｌｉｔｅ最佳,Ｆｌｏｒｉｓｉｌ最差。Ｆｌｏｒｉｓ     

辣根过氧化物酶同工酶在不同介质中的动力学

本文研究了辣根过氧化物酶［ＥＣ１．１１．１．７］同工酶的联苯胺动力学。结果表明：其酸性酶和碱性酶的最适ｐＨ均为５．８左右。二者最适有机溶剂浓度略有差异：酸性酶最适乙醇浓度为５０％,最适二氧六环浓度为４０％;而碱性酶则分别为６０％和５０％。在水溶剂中,酸性酶为米氏酶,碱性酶为正协同的别构酶;在有机溶剂（如：乙醇、二氧六环）中,酸性酶为正协同的别构酶,碱性酶则仍为正协同的别构酶。即有机溶剂可能使酶构象     

PEG修饰的辣根过氧化物酶及其在非水介质中的性质

酶的化学修饰可以明显提高酶在有机相中的活力。通过氧化过氧化物酶（ＨＲＰ）的糖链后引入氨基再连接甲氧基聚乙醇（ＰＥＧ）５０００和在酶的肽链上连接ＰＥＧ５０００,发现ＨＲＰ多肽链上修饰后的酶在水相中的活力几乎没有变化,但通过氧化糖链连接ＰＥＧ的酶在水相中的活力下降近２倍。在甲苯及二氧六环含量较高的体系中,修和均呈上升趋势。特别在甲苯体系中两种修饰酶活力都比未经修饰的酶提高了近２倍。稳定性研究表明,不论     

辣根过氧化物酶模拟酶研究进展

辣根过氧化物酶 (HRP)是一种常用的工具酶 ,对其模拟酶的研究是近年来生物化学和有机化学的重要课题 ,具有重要的理论意义和应用价值。本文评述了近十年来HRP模拟酶的研究进展。     

中性辣根过氧化物酶制法新进展

中性辣根过氧化物酶制法新进展季钟煜,费锦鑫（上海普洛麦格生物产品有限公司,上海２００２３３）关键词中性辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）是生物检测中用得非常多的工具酶,其应用和经济价值都很大。因此,制备ＨＲＰ的技术和方法也是相关行业的一个重要研究...     

辣根过氧化物酶同工酶在不同介质中的动力学

本文研究了辣根过氧化物酶［ＥＣ１．１１．１．７］同工酶的联苯胺动力学。结果表明：其酸性酶和碱性酶的最适ｐＨ均为５．８左右。二者最适有机溶剂浓度略有差异：酸性酶最适乙醇浓度为５０％,最适二氧六环浓度为４０％;而碱性酶则分别为６０％和５０％。在水溶剂中,酸性酶为米氏酶,碱性酶为正协同的别构酶;在有机溶剂（如：乙醇、二氧六环）中,酸性酶为正协同的别构酶,碱性酶则仍为正协同的别构酶。即有机溶剂可能使酶构象发生变化。     

辣根过氧化物酶在水相胶束中的动力学

研究了辣根过氧化物酶在三种表面活性剂（ＳＤＳ,ＴｒｉｔｏｎＸ－１００及ＣＴＡＢ）的水相胶束中催化联苯胺聚合反应的动力学。结果表明水相胶束体系有利于反应的进行。辣根过氧化物酶在水相胶束体系中遵循米氏反应,Ｋ_ｍ在ＳＤＳ、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００及ＣＴＡＢ三种体系中分别为３．０１４×１０~（－４）ｍｏｌ／Ｌ、１．７２８×１０~（－４）ｍｏｌ／Ｌ和５．６６４×１０~（－５）ｍｏｌ／Ｌ。由于微环境的不同,ＨＲＰ在三种体系中表现出不同的最适反应温度和最适ｐＨ。     

水在有机介质酶催化反应中的作用

本文针对有机介质酶催化反应中水的作用,结合最新研究进展作了综合评述,指出水在有机介质中对维持酶的活力构象起到“润滑剂”作用,水活度是衡量水作用的有效参数。分析了酶的水化程度,水化方式,有机溶剂及固定化载体对酶活力的影响及其作用机理,并对反应过程中水的控制问题进行了讨论。     

银离子对辣根过氧化物酶的影响

实验研究Ag 对HRP的影响对检测银的污染有重要意义。以ABTS[2,2-连氮-双-(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)]和H2O2为底物,在pH值5.0的条件下,用分光光度法考察了Ag 存在下的辣根过氧化物酶催化氧化反应。Ag 对辣根过氧化物酶的催化活性显示出抑制作用,并进一步分别探讨了对两种底物的抑制类型和对酶结构的影响。结果表明Ag 对底物H2O2而言,对酶的抑制效应属于反竞争性抑制类型,抑制常数Ki=14.83mmol/L;对底物ABTS而言,对酶的抑制效应属于非竞争性抑制,抑制常数Ki=16.139mmol/L。不同浓度Ag 分别与酶作用后,测定酶的内源荧光光谱。光谱结果表明Ag 影响酶活性的同时也影响酶的构象。     

甲醇酵母Pichia pastoris高水平表达有活性的辣根过氧化物酶

表达有活性的辣根过氧化物酶（ＨＲＰ） 不仅可以深入揭示ＨＲＰ 结构与功能及其生理作用规律, 而且为ＨＲＰ的广泛需要提供新的来源． 为了在甲醇酵母Ｐ． ｐａｓｔｏｒｉｓ 中成功表达, 将编码ＨＲＰＣ成熟肽的ｃＤＮＡ 构建到ｐＰＩＣ９ 上, 再转化到Ｐ． ｐａｓｔｏｒｉｓ 中, 筛选到了分泌表达非糖基化ＨＲＰ 和高糖基化ＨＲＰ（ 分子质量超过１００ ｋｕ） 两种主要产物的重组细胞株． 优化表达条件, 目标产物在摇瓶发酵液中高效表达, 可达４～６ ｇ／Ｌ． 并且直接从发酵液中可获得具有活性的高糖基化ＨＲＰ, 每毫升发酵液中酶活力约有２ Ｕ, 经初步的纯化ＨＲＰ具有最大吸收峰４０３ ｎｍ ．     

甲醇酵母Pichia pastoris高水平表达有活性的辣根过氧化物酶

表达有活性的辣根过氧化物酶(HRP)不仅可以深入揭示HRP结构与功能及其生理作用规律,而且为HRP的广泛需要提供新的来源.为了在甲醇酵母P.pastoris中成功表达,将编码HRP-C成熟肽的cDNA构建到pPIC9上,再转化到P.pastoris中,筛选到了分泌表达非糖基化HRP和高糖基化HRP(分子质量超过100 ku)两种主要产物的重组细胞株.优化表达条件,目标产物在摇瓶发酵液中高效表达,可达4～6 g/L.并且直接从发酵液中可获得具有活性的高糖基化HRP,每毫升发酵液中酶活力约有2 U,经初步的纯化HRP具有最大吸收峰403 nm.     

在甲醇酵母Pichia pastoris胞内表达有活性的辣根过氧化物酶

为了开辟在甲醇酵母 Pichia pastoris中表达 HRP的新途径 ,将编码成熟 HRP同功酶 C基因克隆到表达载体 p PIK3.5K中 .p PIK3.5KHRP转化 GS1 1 5后 ,用 PCR筛选阳性 P.pastoris重组株 ,并用甲醇进行诱导 . Western印迹杂交分析表明目标蛋白 (约为 38k D)能被天然 HRP的多克隆抗体所识别 ,因此活性辣根过氧化物酶已在 P.pastoris胞内表达 .筛选菌株中显示了明显的过氧化物酶活性 ,同时诱导过程中血红素和 Ca Cl2 的加入对过氧化物酶的活力影响不大     

非水介质中辣根过氧化物酶（HRP）荧光活性测定法

建立了一种分析ＨＲＰ催化活力的新方法。该方法基于单体（底物）、聚合物（产物）的荧光发射光谱不重叠,使用荧光光谱仪,通过测量底物荧光淬灭来检测ＨＲＰ在非水介质中（二氧六环－水、乙醇－水、丙酮－水体系）催化酚类、芳香胺类物质聚合的活力。此方法迅速、简便,结果是定量并可重复的,并能定量地计算底物转化率。     

“构象记忆”的辣根过氧化物酶的微水相共价固定化

本研究利用酶在微水溶剂中的"构象记忆"特性,以壳聚糖微球为载体,以辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP)为研究对象,将HRP于活性构象下冻干"固定"后,在二氧六环:水=99:1(V/V)微水介质中与载体进行共价交联,同时与传统水介质中共价交联固定化的HRP进行比较。结果发现,两种介质中固定化HRP的最适温度都提高到60°C,最适pH均为6.5,而微水相中固定的酶活力损失较低,酶活比传统水相中固定的酶高6倍以上;70°C保温30min后,微水相中固定的酶保留75.42%的活力,而水相中固定的HRP仅存15.4%的活力;微水相中固定的HRP具有更好的操作稳定性和热稳定性,60°C下连续操作5次之后,微水相固定的HRP保留77.69%的酶活,而水相固定的HRP仅存16.67%的酶活;微水相中固定的HRP在苯酚的去除中表现得更具优势;微水相中共价交联制备的CS-HRP-SWCNTs/Au酶修饰电极对H2O2的响应信号比水相中共价固定的酶电极强2.5倍,灵敏度更高。本研究表明利用酶的"构象记忆"在微水介质中进行共价交联是固定化酶的一种可行方法,所制备的固定化酶具有更优良的性质。     

鸡前、后背阔肌去神经后对辣根过氧化物酶(HRP)的胞纳作用

本文报道了用辣根过氧化物酶(HRP)作为大分子标记物,以组织化学和生物化学方法观察了鸡前后背阔肌在去神经后的胞纳现象。结果表明,在去神经后发生肥大的前背阔肌和去神经后发生萎缩的后背阔肌同样都出现胞纳的明显增加。组织化学所观察的结果表明,浸泡在含 HRP 的任氏液中的有完整神经支配的前、后背阔肌只有极少数的肌纤维摄取 HRP,而在去神经的前、后背阔肌中则有不少的肌纤维内部出现 HRP 染色反应。这种反应在有的纤维表现为弥散性染色,有的表现为浓的 HRP 反应颗粒。生物化学的结果显示,去神经后的前、后背阔肌中 HRP 的相对含量分别比有神经支配的对照肌肉明显地增多54%和87%,我们在鸡前背阔肌用组织化学和生物化学所得的实验结果与 Thesleff 等人提出的关于肌肉萎缩机制的假设显然不符。本工作证实了肌肉的胞纳作用的增加并不一定最终导致肌纤维的变性和萎缩。     

小鼠骨胳肌在切腱、协同肌切腱和肉毒杆菌毒素中毒后对辣根过氧化物酶(HRP)的胞纳作用

本文报道了用生物化学方法测定离体小鼠比目鱼肌对 HRP 的胞纳作用。结果表明,在切断神经或切腱后引起萎缩的肌肉侧或在协同肌切腱后引起代偿性肥大的肌肉侧,与它们各自对照的正常肌肉侧相比,都可发生对 HRP 胞纳的明显增加。而在肉毒杆菌毒素中毒后引起萎缩的肌肉侧,和它正常的对照肌肉侧相比,却意外地不发生这种胞纳摄取的明显增加。本文的实验结果进一步证实。肌肉的胞纳增加并不一定导致肌纤维的变性和萎缩(例如代偿性肥大的肌肉);而肌纤维的变性和萎缩亦不一定需要肌肉的胞纳增加为前提(例如肉毒杆菌毒素中毒的肌肉)。本工作结果还提示:肌肉的胞纳增加有其神经原性和肌原性因素。本文还对肌肉胞纳增加的可能机制进行了讨论。